2. Métodos de detección de polimorfismo genético
La variación de naturaleza cuantitativa y de origen genético dentro de las poblaciones se presenta en dos formas básicas: mutantes raros y polimorfismo genético. Atendiendo al valor de la frecuencia, si la variante más escasa aparece con una frecuencia menor del 1% se denomina mutante raro, pero si ésta es mayor que este valor estamos en presencia de un polimorfismo genético (Clarke, 1975). Así pues, Berovides y Alfonso (1987) definieron este último como la ocurrencia dentro de una población de variantes discontinuas de origen genético, con una frecuencia del gen que no puede ser explicada por la acción exclusiva de mutaciones, por ser este un evento sumamente raro.
La variabilidad genética es un atributo que no puede ser exhaustivamente medido. Es imposible examinar cada gen en cada individuo de una especie dada para obtener una enumeración completa de la variación genética de la especie; sin embargo, si se toma una muestra de una población es posible estimar su variabilidad genética (Ayala, 1984), al utilizar un carácter o marcador que propicie la medición de dicha variabilidad.
El polimorfismo genético o variación de origen genético ha sido muy estudiado en poblaciones naturales, pues permite el análisis de fenómenos como cantidad de variabilidad genética y frecuencia de mutaciones a través de caracteres de fácil medición y de base genética conocida, con poca influencia del ambiente en su expresión fenotípica (Berovides y Alfonso, 1987).
Hasta mediados de la década de los 60?, los marcadores usados en genética y mejora animal estaban controlados por genes asociados a caracteres polimórficos, en general fáciles de identificar visualmente (Ferreira y Grattapaglia, 1995). Pero solo un pequeño número de marcadores morfológicos permitían encontrar asociaciones significativas entre estos y los caracteres con importancia económica. Por sus limitaciones surgieron los marcadores isoenzimáticos que eran accesibles a un mayor número de especies y brindaban mejores resultados.
Con el advenimiento de las técnicas de biología molecular aparecieron diversos métodos de detección de polimorfismo genético directamente a nivel de ADN. Inicialmente el descubrimiento de las enzimas de restricción permitió el análisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (Grodzicker et al., 1974).
Posteriormente, con el desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction (PCR), Mullis y Faloona, 1987; Saiki et al., 1988), se desarrollaron nuevos métodos de detección de marcadores moleculares; estos últimos se definen como todo aquel fenotipo molecular proveniente de un gen expresado, como en el caso de las isoenzimas o las proteínas (marcadores bioquímicos), o de un segmento específico de ADN (correspondiente a regiones expresadas o no del genoma) (Ferreira y Grattapaglia, 1995).
En las determinaciones de la variabilidad genética, los marcadores "ideales" cumplen una serie de características, entre las que se encuentran: elevada capacidad de detectar altos niveles de polimorfismo, alta heredabilidad, gran capacidad para acceder a todas las regiones del genoma, independencia del estado físico y de desarrollo del individuo, facilidad de obtención, detección por métodos económicos, independencia de las condiciones ambientales y la posibilidad de determinación en cualquier tipo de células que contenga núcleo (Ferreira y Grattapaglia, 1995). Estas constituyen algunas de las ventajas de los marcadores moleculares sobre los morfológicos e isoenzimas; otras radican en su capacidad de detección de mutaciones silenciosas, que no originan cambios de aminoácidos.
Los polimorfismos detectados en el ADN están ocasionados por diferencias en cuanto al número de determinadas regiones no codificantes, que se encuentran dispersas en el genoma (regiones repetidas) o por mutaciones puntuales. En función de estas características se pueden clasificar los diferentes métodos de detección de polimorfismos: los marcadores asociados a variaciones debidas al número de repeticiones en su secuencia y los marcadores que detectan cambios puntuales en el genoma, que pueden ser detectables o n, por enzimas de restricción.
2.1. Polimorfismos de longitud de secuencia simple (SSLPs)
Los SSLPs son arreglos de secuencias repetidas que muestran variaciones en su longitud, con alelos que difieren en el número de unidades repetidas, pueden ser multialélicos y cada SSLP puede tener un número de variantes de longitudes diferentes; existen dos tipos de estos marcadores que se clasifican como DNA satélite, aunque no aparezcan con bandas "satélite" en gradiente de densidad:
- Minisatélites, también conocidos como repeticiones en tandem de número variable (variable number of tandem repeats (VNTRs)), en los cuales la unidad repetida es de hasta 25pb de longitud.
- Microsatélites o repeticiones simples en tandem (simple tandem repeats (STRs)), cuyas repeticiones son menores, usualmente de unidades de dinucleotidos o trinucleotidos.
Los microsatélites son más populares que los minisatélites como marcadores moleculares por dos razones: primero los minisatélites no se encuentran repartidos por todo el genoma, encontrándose fundamentalmente en las regiones teloméricas al final de los cromosomas.
En términos geográficos, esto es equivalente a intentar utilizar un mapa de faros para encontrar una casa alrededor del centro de una isla. Los microsatélites están más convenientemente espaciados a través del genoma. Segundo, la vía más rápida de tipificar el polimorfismo de longitud es por PCR, pero esta técnica es mucho más exacta cuando se amplifican secuencias de longitud menor a 300pb. La mayoría de los alelos de minisatélites tienen tallas superiores debido a que sus unidades de repetición son relativamente grandes y con una sola copia, por lo que se requerirían productos de PCR de varias kb para tipificarlos. Los microsatélites típicos constan de 10-30 copias de una repetición que usualmente no son superiores a 4pb de longitud, por lo tanto son mucho más fáciles de analizar por PCR.
2.1.1. Marcadores basados en loci hipervariables de minisatélites (VNTR)
Se conoce que una gran proporción variable del genoma eucariota está compuesto por secuencias repetitivas de ADN, las cuales difieren en el número y la composición de nucleótidos. Los primeros marcadores de este tipo en ser utilizados fueron los minisatélites o VNTR ("Variable Number of Tandem Repeats") (Jeffreys et al., 1985), que están ubicados en regiones centroméricas y teloméricas de los cromosomas (Moyzis et al., 1988). Están constituidos por un número variable de secuencias idénticas repetidas. Estas poseen de 15 a 100 pares de bases y en cada locus hipervariable están repetidas hasta 50 veces.
El nombre de minisatélites se debe al hecho de que las secuencias repetitivas forman un pico satélite diferente al pico principal de ADN genómico después de la separación en gradientes de cloruro de cesio, por contener una proporción de pares de bases G+C diferente a la media del resto del genoma (Lewin, 1997). De esta observación surgió el concepto de huella dactilar genética o "genetic fingerprint" y este tipo de marcador constituyó durante un tiempo la base genética de la identificación de individuos.
Los minisatélites están asociados con características estructurales de los cromosomas. El DNA telomérico, que en humanos comprende cientos de copias con el motivo 5´-TTAGGG-3´ es un ejemplo de minisatélite, de cuyo origen y función se conoce algo y que están relacionados de manera importante en el proceso de replicación. Existen otros ejemplos de genomas eucariotas que contienen varios cluster de minisatélites, de los cuales la mayoría, aunque no todos se ubican al final de los cromosomas, cuyas funciones aún no se conocen totalmente (Strachan y Read, 1999).
El principio genético de la obtención de estos marcadores se basa en la digestión del ADN de los individuos analizados con enzimas de restricción, separado electroforéticamente, inmovilizado en una membrana y detectado por hibridación con sondas y autorradiografía (Figura 1). Cuando la enzima de restricción corta las secuencias adyacentes a un locus hipervariable, la longitud de los fragmentos de restricción producidos en diferentes individuos varía con el número de repeticiones del minisatélite, resultando en un patrón e bandas específico para cada indoviduo.
Esta variación del número de elementos repetidos se genera posiblemente debido a fenómenos como deslices en la replicación del ADN o aún en la conversión génica (Jeffreys et al., 1985). Por este método se pueden detectar gran polimorfimo, que depende de la variación en la distribución de los sitios de restricción y el número de secuencias repetidas (Cornide et al., 2002).
Estos se han utilizado cada vez menos, debido a causas como la gran complejidad de la técnica y su elevado costo, que limitan su utilización, por ejemplo, para la detección de genes ligados a loci de rasgos cuantitativos ("Quantitative Traits Loci", QTL): loci con una gran influencia sobre rasgos comercialmente importantes, marcados por polimorfismos de ADN, cuya variación puede ser empleada en la selección, de forma semejante a los genes simples y que se caracterizan por estar ligados a marcadores genéticos (Distl, 2000).
2.1.2. Marcadores basados en la amplificación de microsatélites
Los loci microsatélites (Litt y Luty, 1989; Koreth et al., 1996), también conocidos como SSR ("Simple Sequence Repeat": Secuencias Simples Repetidas), consisten en pequeñas secuencias con 2-6 nucleótidos repetidos en tándem, altamente variables en tamaño, en un rango alrededor de los 100-200pb. En genomas eucariotas las secuencias de los microsatélites son muy frecuentes, bien distribuidas y mucho más polimórficas que los loci hipervariables formados por minisatélites, constituyendo la clase de marcadores moleculares más polimórficos que se conocen (Ferreira y Grattapaglia, 1995, Cornide et al., 2002). Se ha señalado que los elementos más repetidos en mamíferos son extensiones de dinucleótidos CA.
Por el momento, se desconoce exactamente el origen y la función de estas secuencias repetidas. Respecto a su origen, la aparición inicial de los microsatélites pudo deberse al azar, o podrían haber surgido como producto de mutaciones en la secuencia poli-A en el extremo 3? de las secuencias Alu adyacentes. Por otra parte, la prevalencia selectiva de CA puede explicarse por metilación de los residuos de citosina en el extremo 5? de GC, secuencias normalmente presentes en el genoma. Por último, los residuos metilados pueden ser desaminados produciendo una transición C/T (Koreth et al., 1996).
En relación con su función, se cree que no son más que un reflejo interno de mecanismos genómicos con tendencia a producir y cortar estas secuencias (, y existen evidencias de que no son necesarios para la expresión génica (Stalling, 1994). Anteriormente se habían propuesto como puntos calientes en la recombinación genética, en los cuales se producen entrecruzamientos con intercambios desiguales de cromátidas (Weber y May, 1989) y como reguladores de genes (Hamada et al., 1984). Por último, Kashi et al., (1997) lanzaron la hipótesis de que los microsátelites son una fuente de variación cuantitativa.
Estos autores se basaron en una serie de características de estas regiones como son su dispersión a lo largo del genoma, su asociación a genes como elementos de control de transcripción o como componentes codificantes, las variaciones observadas en el número de repeticiones que pueden causar cambios cuantitativos en la expresión génica y función, así como cambios fenotípicos, entre otras. Así, el cambio en el número de repeticiones puede ser un medio exquisitamente específico y sensible de regulación cuantitativa de variación.
Esta fuente de mutación y cambio en el número de repeticiones podría proveer una fuente de variación cuantitativa para una rápida adaptación evolutiva de las especies a cambios ecológicos. Así, se ha descrito (Rosenberg et al., 1994) que la nutrición y el estrés podrían incrementar la velocidad de mutación en los microsatélites debido a un descenso de la regulación de reparación de errores. De esta forma, el estrés que acompaña al cambio evolutivo podría inducir en una población el incremento de mutaciones requeridas para adaptarse al cambio.
Los microsatélites han demostrado ser los marcadores más informativos para estudios poblacionales a nivel de subespecie. La mayoría de los estudios realizados hasta el momento con este tipo de marcadores se basa en el análisis de frecuencias alélicas, con la finalidad en un principio de la creación de mapas genéticos y posteriormente para la determinación de QTLs (Georges et al., 1995; Velmala et al., 1999).
Weber y May (1989) propusieron la PCR como método general para el estudio del polimorfismo de estas regiones, las que se amplifican individualmente utilizando un par de oligonucleótidos específicos (20-30mer) complementarios a las secuencias únicas que flanquean el microsatélite (figura 2). Los fragmentos amplificados, casi invariablemente, presentan un polimorfismo extensivo resultante de la diferencia en el número de elementos simples repetidos. Así, cada región microsatélite, independientemente de la secuencia repetida, constituye un locus altamente variable, multialélico y de gran contenido informativo.
Figura 2. Esquema que ilustra la composición de una región microsatélite en una cadena de ADN
Cada segmento amplificado representa un alelo diferente del mismo locus. La detección de estas secuencias se ha realizado en geles de poliacrilamida altamente resolutivos debido a que las diferencias entre uno y otro alelo pueden ser de uno o dos nucleótidos y más recientemente en secuenciadotes automáticos utilzando fluoróforos diferentes para cada microstélite (figura 3) (Womack, 1993). Además, pueden analizarse muchos genotipos simultáneamente por ser los marcadores más adecuados para el desarrollo de mapas de ligamiento.
Figura 3. Análisis de genotipos de microsatélites marcados con fluorescencia
Debido a la importancia que estos marcadores han tomado en el desarrollo de mapas genéticos, las formas de detección son muy variables y constantemente aparecen nuevas técnicas. En un primer momento se pueden dividir en dos: unas basadas en el análisis de las bases de datos de los genes existentes y otras en su detección en el laboratorio. La búsqueda en bases de datos como EMBL, GenBank, etc., han permitido caracterizar algunos microsatélites bovinos (Fries y et al.., 1993). Actualmente la mayoría de los estudios de detección de microsatélites tiene lugar en el laboratorio. Inicialmente se trabajaba en el monitoreo de una librería de ADN genómico bovino (clones bacterianos con distintos fragmentos de ADN) mediante sondas de dinucleótidos (ej. (TG)n y (CA)n) marcadas con 32P y posteriormente se realizaba la secuenciaón de los clones positivos. Utilizando esta metodología se han detectado un gran número de microsatélites en esta especie (Vaiman et al., 1992; Kemp et al., 1993).
Por las ventajas que poseen estos marcadores, se ha trabajado ampliamente en la búsqueda y empleo en diferentes especies de interés en ganadería, tales como ovino (Buchanan et al., 1998; Dietz et al., 1993), caprino (Kemp et al., 1995), porcino (Moran, 1993), bovino (Fries et al., 1990; Vaiman et al., 1992; Usha et al., 1995; Giovambatista et al., 2000; Hansen et al., 2002) , etc. Se han realizado estudios en distintas especies ganaderas y por supuesto en bovinos (MacHugh et al., 1994; Ciampolini et al., 1995; Moazami-Goudarzi et al., 1997; Martín-Burriel et al., 1999; Rusell et al., 2000; Uffo, 2003) que han tomado como base las investigaciones realizadas relacionadas con la caracterización de poblaciones humanas.
2.2. Marcadores que presentan cambios puntuales en el genoma.
2.2.1 Marcadores moleculares basados en el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)
A finales de la década del ?60 el descubrimiento de las endonucleasas de restricción de bacterias (enzimas de restricción con muy alta especificidad), las cuales cortaban el ADN en secuencias definidas de usualmente 4-8pb, conllevó al desarrollo de técnicas para el aislamiento y la manipulación dirigida de fragmentos de ADN. Una de las mayores aplicaciones de esta técnica (ampliamente utilizada en el campo de la genética humana) fue el ensamblaje de los mapas genéticos con el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (Restriction Fragments Length Polymorphism, RFLP) (Grodzicker et al., 1974).
Esta técnica explota las variaciones en las secuencias del ADN por la creación o abolición de sitios para el corte de las endonucleasas de restricción, dadas por los cambios de bases, las adiciones o deleciones de fragmentos de ADN entre y en estos sitios. Además, algunas endonucleasas son incapaces de cortar el ADN si la secuencia de reconocimiento contiene uno o más sitios de citosina metilada, por lo tanto tales enzimas pueden detectar polimorfismo si hay variaciones en los patrones de metilación.
El estudio de los polimorfismos de este tipo consiste en el análisis en cuanto a número y tamaño de los fragmentos de ADN al ser digeridos con distintas enzimas de restricción. Los patrones de bandas resultantes se generan por la presencia o ausencia de los sitios de corte de la enzima producidos por mutaciones: cambios, delecciones o inserciones de bases. Por lo tanto, la variabilidad está dada por las distintas tallas de los fragmentos que se originan al digerir con las mencionadas enzimas el material genómico o un fragmento amplificado del genoma, de manera que un sitio de restricción polimórfico o una delección o inserción entre dos sitios de corte será detectado como un polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción generados a nivel fenotípico (Botstein et al., 1980).
La técnica consta de las siguientes etapas (figura 4): digestión del ADN con enzimas de restricción; separación por electroforesis de los fragmentos resultantes de la digestión; transferencia de los fragmentos separados a membranas de nitrocelulosa (Southern Blotting) e hibridación con sondas moleculares radiactivas y exposición de la membrana a un filme de rayos X. La identificación delpolimorfismo también puede hacerse por PCR (Leveziel et al., 1988; Cornide et al., 2002). Este método se ha empleado en la caracterización de los genes de algunas de las proteínas lácteas bovinas (Rodellar et al., 1992; Osta, 1994; Uffo 2002a y b, 2003).
Figura 4: A: Representación esquemática del principio genético del RFLP.
B: Gel de azarosa 1.5% teñido con bromuro de etidio contenieno los productos obtenidos de ADN de diferentes individuos, amplificados por PCRy digeridos con la enzima TaqI, M: marcador de peso molecular de 1Kb
El uso de los RFLP como marcadores para trazar la transmisión de los genes asociados a ellos, es de una utilidad considerable en genética pues tienen como ventajas el no estar influenciados por el ambiente, no depender del estado ontogénico del animal, permitir un análisis de todo el genoma, poder ser detectados en estadios muy tempranos del desarrollo independientemente de la expresión del gen, una vez heredados, y además poseen la característica de ser codominantes en la expresión fenotípica, es decir, permiten discernir entre el individuo homocigótico dominante y el heterocigótico; son muy comunes y cualquier gen debe tener sitios de restricción polimórficos en una vecindad de varios cientos de pares de bases.
Pero tienen como desventajas que son muy costosos, necesitan de un personal calificado y entrenado para trabajarlo, precisan el uso de radioactividad y además, consumen mucho tiempo (Asmussen y Clegg, 1985; Ferreira y Grattapaglia, 1995).
En animales domésticos se ha realizado este tipo de análisis del ADN desde 1985, con numerosos trabajos en una amplia diversidad de especies: perros (Jeffreys et al., 1987); cerdos (Davies et al., 1988); gatos (Hillel et al., 1989); cabras (Bergensen, 1990); ovinos (Leveziel et al., 1991); bovinos (Rodellar et al., 1992, Uffo, 2003); aves (Bumstead, et al., 1992; Cheng, 1997). En la actualidad su mayor utilización se basa en la combinación con la técnica de PCR
Otras de las aplicaciones de esta tecnología ha sido el desarrollo de detallados mapas de ligamiento en una amplia variedad de organismos. Aunque ésta es la más conocida, el RFLP se ha empleado también en la caracterización del genoma de organelos, en la identificación de líneas o individuos y en las investigaciones sobre el tema de la diversidad genética (Tanksleet al., 1989; Van der Beek et al., 1992; Uffo, 2003).
La identificación y el mapeo de RFLPs han revolucionado la genética humana por el desarrollo del diagnóstico asistido por marcadores y la detección de una amplia variedad de enfermedades hereditarias. A pesar de haber sido ignorados este tipo de marcadores en sus inicios por los genetistas veterinarios, los mismos métodos para el mapeo en humanos son empleados para estudios de diferentes especies animales, respecto a los sitios polimórficos, produciéndose una revolución en el mejoramiento animal por la introducción de la selección asistida por marcadores (Marker Asisted Selection: MAS) (Womack, 1983).
2.2.2. Oligonucleótidos alelos específicos ("Allele Specific Oligonucleotides", ASOs)
Su metodología de identificación consiste en la detección de la variabilidad mediante sondas específicas para los alelos. Pueden usarse marcados con radiactividad para detectar la variabilidad en un "dot blot" tras una amplificación (Pinder et al., 1991) o como oligonucleótidos para PCR que amplificarán un alelo específicamente (Leveziel et al., 1994; Okimoto y Dogson, 1996; Braunschweirg et al., 1999).
Presentan el inconveniente de que cuando se usan sondas, cada análisis deberá realizarse tantas veces como alelos sean detectados, ya que cada sonda será capaz de reconocer si el alelo está presente o no, pero no se puede determinar el genotipo del animal.
El procedimiento general de dot-blot involucra tomar una solución acuosa del ADN blanco, por ejemplo ADN genómico total bovino, y simplemente depositarlo en forma de manchas ("spot") sobre una membrana de nitrocelulosa o de nylon, dejándolas secar. El ADN blanco se desnaturaliza, ya sea por exposición al calor o por tratamiento con álcalis; luego una vez inmovilizado sobre la membrana, este se expone entonces a una solución que contiene las sondas marcadas.
Después transcurrido un determinado tiempo de reacción que permita la formación de los heteroduplex "sonda-blanco", se elimina la solución de la sonda, se lava la membrana para eliminar el exceso de sonda marcada que haya quedado sin reaccionar o que pueda constituir enlaces inespecíficos con la membrana y finalmente, esta se seca y se expone a una película de autorradiografía.
Para el uso de esta técnica en la detección de alelos específicos, se construyen sondas que abarcan las diferentes variantes de un sitio de interés. Así las sondas ASO tienen una longitud entre 15 y 20 nucleotidos, y normalmente se utuilizan bajo condiciones de hibridación a las cuales el duplex entre estas y el ADN blanco es estable solo si existe una complementariedad perfecta entre sus secuencias; un simple error de complementariedad puede producir un heteroduplex pequeño e inestable. Típicamente, esto involucra el diseño de oligonucleotidos en los cuales la diferencia entre los alelos se identifica con un nucleotido ubicado en el segmento central de su secuencia, de tal modo que se maximisa la inestabilidad de un duplex mal ensamblado. Esta propiedad de discriminación puede usarse en una gran variedad de objetivos de investigación y diagnóstico. Un ejemplo de esto lo constituye la identificación de individuos con anemia falciforme o siclemia. En la figura 5 aparece la representación esquemática del alelos normal de la -globina (arriba) (A-ASO; se muestra inmediatamente debajo).
Los resultados son positivos cuando se identifican individuos normales o heterocigóticos (círculos negros) y negativos cuando se encuentran individuoa homociigóticos recesivos (círculos en blanco). El dot-blot de abajo muestra la identificación de la mutación cuando se utiliza un oligonucleotido específico para la misma (S-ASO; se muestra inmediatamente debajo), y en este caso resulta que el individuo es positivo cuando son heterocigotos u homocigotos recesivos (círculos azules) y negativos cuando son normales. Las sondas A-ASO y S-ASO en este caso fueron diseñadas de manera tal que tuvieran 19 nucleotidos de longitud, abarcando de los codones 3 al 9 de las secuencias del gen de la A y S globina, respectivamente, alrededor del sitio de mutación. Este es una sustitución de un nucleotido simple (A
T) en el codón 6 del gen de la -globina, resultando en una sustitución de GAG (Glu) GTG (Val) (se observa en la secuencia central) (Strachan y Read, 1999).
Figura 5. Identificación de oligonuclótido alelo específico (ASO) por hibridación de dot-blot (ejemplo: identificación de individuos con siclemia).
Otro método de identificación de ASOs por dot-blot utiliza unan aplicación inversa. Esto significa que las sondas de oligonucleotidos no estan marcadas y se fijan sobre la membrana o el filtro mientras que el ADN blanco, esta vez marcado, se coloca en solución. Las uniones positivas del ADN blanco con el oligonucleotido específico sobre la membrana se corresponden con la existencia de una secuencia específica en el ADN blanco.
Esta aplicación se relaciona con el método de microarreglos (microarrays) y actualmente tiene innumerables aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades, sobre todo en humanos, la cual es una técnica novedosa basada en la utilización de genosensores o ADN-chips que contienen cientos de sondas ordenadas y adheridas a la superficie, donde posteriormente se hibrida la secuencia complementaria del ADN en estudio. Se puede utilizar para el análisis de mutaciones específicas o de polimorfismo, identificación de especies, ene l análisis de la expresión génica y para la secuenciación.
El uso más importante es el análisis de marcadores polimórficos; si se conoce la secuencia nucleotidica del fragmento polimórfico, entonces se pueden incluir sondas específicas en el genosensor para cada alelo delmarcador de ADN. El patrón de hibridación producido con los fragmentos que contienen los maracdoresde interés revelará rápidamente el genotipo (Cornide et al., 2002)
2.2.3. ADN polimórfico amplicado al azar: RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN)
La técnica RAPD, conocida también como AP-PCR (Arbitrary primed PCR, Welsh y McClelland, 1990) es básicamente una variación del protocolo de la PCR con dos características distintivas: utiliza un cebador único en lugar de un par de primers y este tiene secuencia arbitraria, por lo tanto su secuencia es desconocida, se pueden seleccionar un número infinito de cebadores y su diseño debe estar regido por tres condiciones básicas: %C+G alrededor de 50-70%, que no tenga palíndromes mayores de 6 bases y que no exista complementariedad en el extremo 3´ (Williams et al., 1993). Para que ocurra la amplificación, dos secuencias complementarias al cebador arbitrario deben estar lo suficientemente adyacentes (~400pb) y en orientación opuesta que permita la amplificación exponencial por la ADN-polimerasa (Figura 6).
Figura 6: Detección de un loci polimórfico a través de la técnica RAPD.
El ejemplo muestra esquemáticamente los cromosomas B6 y C3H (líneas horizontales). A: Los recuadros sobre las líneas representan fragmentos genómicos (loci RAPD) que pueden ser amplificados con un primer en particular. El locus B es polimórfico. B: Ilustración del patron de bandeo que sera obtenido de la electroforesis de los productos de B6 y CH3.
Durante la fase de alineamiento de la reacción de PCR-RAPD, el primer arbitrario se unirá a los sitios de la secuencia complementaria en el ADN molde desnaturalizado. Si dos moléculas se alinean con el molde en cadenas opuestas, con la orientación apropiada y con una distancia amplificable (menor o igual a 2500 bases) entonces será amplificado un fragmento discreto de ADN. Cada primer es potencialmente capaz de amplificar un número de fragmentos (1-10 o más) de diferentes loci durante la misma reacción de PCR resultando en varias bandas en el gel. Los segmentos amplificados pueden ser visualizados en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio o en geles de poliacrilamida de alta resolución visualizados por autorradiografía o teñidos con plata (Waugh y Powell, 1992) detectándose el polimorfismo como ausencia o presencia de bandas de un fragmento particular.
Los polimorfismos RAPD resultan de la diferencia de secuencias en uno o ambos sitios de unión de los primers, los cuales evitan el alineamiento de la secuencia molde. Otras fuentes de polimorfismo RAPD pueden incluir diferencias de apenas un par de bases (mutaciones puntuales) que son suficientes para causar complementariedad del primer en el sitio de iniciación; delecciones o inserciones adyacentes en el sitio de iniciación de modo que provoquen la acción de la ADN-polimerasa, por lo que los marcadores RAPD tienen naturaleza binaria, el segmento amplificado está presente o no; son marcadores dominantes porque solo se amplifica una variante alélica, aquella que cumple con los requisitos de complementariedad entre el cebador y las cadenas de ADN a una distancia menor o igual a 2Kb (Cornide et al., 2002). Dichas mutaciones pueden variar también la talla de la región entre los sitios o evitar la amplificación. Algunos autores (Bowditch y et al.., 1993) sugieren que pueden ocurrir también si se forman estructuras secundarias alrededor de los sitios de unión de los primers durante ciclos de alineamiento con temperaturas relativamente bajas. Estas estructuras secundarias pueden interferir con el alineamiento de los primers y/o la extensión por la ADN polimerasa. Las mutaciones en estas regiones pueden estabilizar o desestabilizar la formación de estructuras para originar polimorfismos RAPD.
La distribución de marcadores RAPD a lo largo del genoma es una consideración importante cuando se evalúa la utilidad de estos marcadores, los cuales están ampliamente ubicados más o menos al azar por todo el genoma. Existen reportes que verifican su presencia en el genoma de numerosas especies, (Cheah et al., 1994; Postlethwait et al., 1994; Hunt y Page, 1995; Cushwa y Medrano, 1996; Rincon et al., 2000; Alves et al., 2003). Los RAPDs se han utilizado también para la caracterización racial en ganado bovino (Parejo et al., 2002),
Una característica importante en cualquier marcador genético es que posean una reproducibilidad consistente. En este tipo de marcadores factores como calidad y concentración del ADN molde, presencia de contaminantes precipitables con etanol, concentración de cloruro de magnesio, contenido de G+C en los primers y su concentración y la eficiencia del termociclador, influyen en la amplificación y afectan la sensibilidad de la reacción, además de la fuente de la ADN polimerasa (Cushwa y Medrano, 1996).
Esta técnica se diferencia fundamentalmente de otras y muestra ventajas, por ejemplo, sobre RFLP (Lynch and Milligan 1994), en que no se basa en hibridación sino en la amplificación de ADN, lo que implica simplicidad y rapidez, lo cual se debe a la posibilidad de detectar polimorfismo por la visualización directa de las bandas en el gel, eliminando todas las etapas de transferencia de ADN para membranas (Southern Blot), hibridación con sondas específicas y autorradiografía; no requiere del desarrollo de una librería de sondas específicas, sino que un conjunto de primers arbitrarios puede utilizarse para cualquier organismo; se elimina la necesidad de isótopos radiactivos, se requiere 10-3 veces menos concentración de ADN que para RFLP y la principal desventaja es el bajo contenido de información genética por loci asociado a la dominancia de los marcadores RAPD (Williams et al., 1990, 1993), además de que para su desarrollo requiere que se garanticen condiciones de adecuada repetibilidad, además de ser un método muy trabajoso y costoso.
Cuando los productos de la amplificación se separan en electroforesis empleando gradiente desnaturalizante donde los fragmentos de ADN migran desde una concentración baja hasta la mayor (80%), entonces se denomina RAPD-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis). Esta variante se emplea para la detección del polimorfismo dek ADN en situaciones donde el polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción es bajo, pero se espera encontrar variaciones en su secuencia (Dweikat y McKenzie, 1997)
2.2.4. Polimorfismo de Conformación de las Cadenas Simples ("Single Strand Conformations Polymorphism", SSCPs)
El ADN de cadena simple tiende a doblarse y formar estructuras complejas estabilizadas por enlaces intramoleculares débiles, especialmente por puentes de hidrógeno. La mobilidad electroforética de dichas estructuras sobre geles no desnaturalizantes dependerá no solo de la longitud de las cadenas, sino también de su conformación, la cual esta determinada por la secuencia de ADN.
Consiste en la detección de las diferencias en la estructura secundaria o terciaria entre fragmentos de ADN amplificados, con distinta secuencia (Orita et al., 1989). Esto permite la detección de mutaciones puntuales de ADN sin necesidad de conocer su secuencia (Berta et al., 1990) y son capaces de identificar entre el 30 y 70% de todos los polimorfismos debidos a una mutación simple (Larsen y Nielsen, 1992). Su detección se lleva a cabo en un gel de acrilamida en condiciones no desnaturalizantes. Los primer pueden estar radiaoctivamente marcados, o puede realizarse la detección de los productos amplificados por tinción con plata y siempre deben incluirse muestras controles para identificar el tipo salvaje del mutado (Figura 7).
Figura 7: Monitoreo de una mutación por análisis de SSCP. El Exon 3 del gen CFTR gene se amplificó por PCR partiendo de ADN genómico de 9 individuos no relacionados entre sí y se incluyeron 6 muestras controles que contenían la mutación en dicho exón. El ADN de conformación simple migra más lentamente en el mismo gel (panel superior).
SSCP es simple y adecuadamente sensible para fragmentos de hasta 200pb de longitude, y han sido utilizados en la identificación de variantes alélicas de las proteínas lácteas (Barroso et al., 1999a y b, Prinzenberg et al., 1999; Klauzinska et al., 2001) así como en estudios de expresión de ellas (Robitaille y Petitclere, 2000), pero para el desarrollo de esta metodología se requiere una amplia batería de oligonucleotidos que encarece su utilización.
2.2.5. Polimorfismo de longitud de los fragmentos amplificados (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)
Consiste en la amplificación de múltiples regiones arbitrarias del gnoma (Vos et al., 1995). Se basa en la amplificación arbitraria de fragmentos de restricción de ADN ligados a adaptadores: se utilizan cebadores semiespecíficos con secuencia complementaria al adaptadpr en el extremo 5´. Involucra cuatro etapas: digestión con dos enzimas de restricción, una de corte raro (reconoce secuencias de 6pb) y otra de cirte frecuente (reconoce secuencias de 4pb); acoplamiento de adaptadores específicos de doble cadena a los extremos de los fragmentos de restricción; amplificación selectiva de fragmentos con cebadores específicos y separación de los fragmentos por electroforesis en geles de poliacrilamida (figura 8).
Se pueden utilizar varios métodos para revelar elpatrón de bandas: empleo de isótopos radiactivos, fragmentos biotinilaos y la tinción con nitrato de plata.
Mediante la selección del número de nucleotidos selectivos es posible controlar el número de fragmentos a amplificar, en una relación inversamente proporcional. El polimorfismo es detectado por la presencia o ausencia de bandas debido a mutaciones en los sitios de restricción o en secuencias adyacentes a estos, los cuales se complementan o se diferencian de los nucleotidos selectivos añadidos a los cebadores de la PCR, y por inserciones o delecciones dentro del fragmento amplificado (Savelkoul et al., 1999).
Tiene como ventajas que se obtiene un alto grado de polimorfismo, un mayor número de marcadores por gel analizado y no requiere del conocimiento de la secuencia de ADN. Dedido a la cantidad de marcadores que pueden ser generados, el mapero genético puede realizarse con mayor rápidez y más fácilmente. Es una técnica para estudios de biodiversidad. Comparado con RFLP es más rápido, menos laborioso y provee mayor información. Revela fundamentalmente el polimofismo dominante, que puede ser por la presencia o ausencia del sitio de restricción o por un simple variación de un n ucleotido en el genoma (Cornide et al., 2002).
Los marcadores AFLP pueden ser aislados del gel y usarlo como sondas para caracterizar nuevos clones, o secuenciarlos para diseñar cebadores y emplearlos en otras técnicas basadas en PCR.
Figura 8. Representación esquemática de AFLP
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