Bacteriología anaeróbica práctica (página 2)

Se considera que las bacterias anaeróbicas están presentes en la mayoría de los procesos infecciosos, ya como agente principal, o como secundario al daño tisular producido. En muchas ocasiones, éstas bacterias pasan desapercibidas por diversas razones entre las que predominan la mala colección, transporte y conservación de la muestra, el uso de medios inadecuados para su aislamiento, su lento crecimiento, la creencia en que si se ha aislado un microorganismo, ya no hay que seguir buscando y en muchos casos, porque el microbiólogo no pensó en anaerobios.

En la actualidad existen varios sistemas automatizados y semiautomatizados para la identificación de éstos microorganismos. Sin embargo, adicional a las limitaciones que la literatura especializada enumera, ninguno de ellos puede ser útil sin los pasos previos de colección, procesamiento y aislamiento, los cuales son la base de las buenas prácticas de trabajo en la microbiología básica.

Todas estas dificultades propias de la investigación en las que el conocimiento de la flora normal y patológica tiene una gran importancia en la búsqueda de los anaerobios, nos ha estimulado en la realización de éste resumen de técnicas para la detección e identificación de estos microorganismos cuya evaluación requiere un trabajo mas fino por parte del microbiólogo.

Relación de las bacterias con el oxígeno

Ref. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed., 1994).

En base a la relación de las bacterias con el oxígeno, estas se pueden clasificar en :

• Aerobio estricto : Un organismo el cual requiere utilizar el oxígeno como aceptador terminal de electrones , puede tolerar un nivel del oxígeno equivalente o mayor de una atmósfera de aire (oxígeno del 21%), y tiene un tipo terminantemente respiratorio de metabolismo.

• Anaerobio facultativo: Un organismo que puede crecer bien en ausencia del oxígeno y en la presencia de un nivel de oxígeno equivalente a una atmósfera del aire (oxígeno de 21%).

• Microaerofílico : Un organismo que es capaz de un crecimiento oxígeno-dependiente, pero no puede crecer en la presencia de un nivel del oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de 21%).

• Anaerobio estricto : Un organismo que es incapaz de crecimiento oxígeno-dependiente y no puede crecer en la presencia de una concentración de oxígeno equivalente a una atmósfera de aire (oxígeno de 21%).

RELACION DE LAS BACTERIAS CON EL OXIGENO EN TIOGLICOLATO

Tubo # 1: Aerobio estricto

Tubo # 2: Anaerobio facultativo

Tubo # 3: Anaerobio aerotolerante ( Microaerofílico )

Tubo # 4: Anaerobio estricto

Recolección y transporte de muestras clínicas

Las muestras clínicas deben ser obtenidas del sitio infectado usando procedimientos que garanticen el mantenimiento de una atmósfera carente de oxígeno y eviten contaminación con flora endógena. En general el procedimiento recomendado es aspiración con aguja del material purulento o por biopsia después de desinfección apropiada.

Estas muestras deben ser procesadas en el laboratorio lo más rápido posible, manteniendo en todo momento su estado libre de oxígeno. La obtención de muestras son aceptables solo en casos de incluir un medio de transporte apropiado para anaerobios y sean  sembradas antes de 30 minutos de obtenida la muestra.  Las muestras para cultivos anaeróbicos nunca deben ser refrigeradas.

La aspiración directa con aguja es el mejor método de obtener una muestra representativa para cultivo. Los especimenes obtenidos de los líquidos normalmente estériles tales como sangre, líquido cefalorraquídeo o peritoneal, se recogen después de la descontaminación cuidadosa de la piel.

Los dispositivos del transporte contienen generalmente ambiente libre de oxígeno proporcionados por una mezcla del bióxido de carbono, hidrógeno, nitrógeno, más un indicador aerobio de la condición. Los especimenes se deben poner en un transportador anaerobio cuanto antes. Los especimenes se inoculan en un frasco anaerobio del transporte o una jeringuilla con aguja. Después de que se expelan todas las burbujas de aire, el extremo de la aguja se debe insertar en un tapón de caucho estéril, ya que el aire puede difundirse gradualmente a través de la pared plástica de la jeringuilla. Recomendamos el Manual de Colección de Muestras Microbiológicas que hemos redactado en compañía del Dr. Silvio Vega.

A pesar de que las bacterias aerobias y anaerobias son indistinguibles por la tinción, el frotis directo proporciona información preliminar importante con respecto a tipos de organismos presentes, sugiere terapia inicial apropiada y sirve como control de calidad. Estos anaerobios pueden mostrar un patrón morfológico típico que puede ser reconocido por un microscopista experimentado. Recomendamos muy especialmente el frotis directo por Gram de la muestra para ayudar a evaluar el cultivo posterior.

Flora anaeróbica normal

Las bacterias anaerobias forman parte de la microbiota normal del cuerpo humano y de los animales. Se encuentran como comensales, en algunos casos con funciones fisiológicas importantes. No obstante, también pueden dar lugar a procesos infecciosos graves. Aunque el hombre es un aerobio, más del 99.9% de la flora humana normal son anaerobios estrictos y facultativos. Éstos incluyen:

Piel – Propionibacterium spp (Produce ácido propiónico )

Boca – Actinomyces, Prevotella, Porphyromonas, Peptostreptococcus

Intestino grueso – Bacteroides spp, Bifidobacterium spp, Clostridium

perfringens, Peptostreptococcus

Vagina – Lactobacillus, Prevotella spp

4.1 Microbiota de la piel.

Propionibacterium es el único anaerobio habitualmente presente en la piel, mientras que Eubacterium lo es esporádicamente. En las zonas próximas al área peritoneal se pueden encontrar bacterias intestinales, como Clostridium y Bacteroides, que condicionan de manera distinta el tipo de infecciones de las regiones próximas a la misma.

4.2 Microbiota de la cavidad oral.

El sistema ecológico de la boca es muy complejo. En él se encuentran diferentes hábitat, tales como mucosas de distinta clase de epitelios, la placa dentaria, etc., con interrelaciones entre ellos mismos y el resto del medio ambiente. Los factores que pueden afectar este sistema son muchos y variados: el lugar donde se vive, la edad, el estado de la dentición, el tipo de alimentación, las alteraciones en la dentadura, los hábitos higiénicos, la cantidad de saliva, la forma de respirar, el potencia Eh, la cantidad de lisozima, las peroxidasas, la producción de inmunoglobulinas, la capacidad fagocitaria de los leucocitos, el efecto de substancias antimicrobianas y otros. En la cavidad oral, es casi constante la presencia de bacterias anaerobias y microaerófilas, con predominio de Streptococcus, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Prevotella, Bifidobacterium, Propionibacterium, Eubacterium, espiroquetas y Actinomyces.

La concentración de bacterias en la saliva es de 108 por ml, la de la superficie de los dientes de 109 y la de los raspados gingivales es superior, pudiendo llegar a 1012 por ml. La proporción de anaerobios y aerobios es variable: de 1 a 1 en la saliva y de 1000 a 1 en el surco gingival.

Cuando se pasa de la cavidad oral hacia la laringe, las bacterias prácticamente desaparecen; el resto de las vías respiratorias y los pulmones se consideran estériles.

4.3 Microbiota del tracto digestivo.

En condiciones normales, debido al bajo Ph del jugo gástrico la flora del estómago es mínima o apenas existente, menos de 10 bacterias/ml, no siendo necesariamente anaerobios estrictos.

La microbiota del intestino delgado es bastante simple, con contajes de bacterias entre 103 y 105 por ml y subiendo en el íleo terminal a 106/ml, donde la proporción entre aerobios y anaerobios es muy similar; Bacteroides y Bifidobacterium son los anaerobios más comunes.

Cuando las bacterias llegan al intestino delgado son sometidas a la acción de los jugos intestinales, pancreático y biliar, al peristaltismo y otros factores que tienen un evidente poder antimicrobiano; por esta razón el número total de bacterias en dicho lugar es habitualmente escaso y semejante al de las partes superiores del aparato digestivo, aunque con mayor número de Bacteroides fragilis.

Más abajo, en el íleon y zona colorectal, hay una gran cantidad de bacterias, pertenecientes a más de 500 especies distintas; un 99% son anaerobias, sobre todo Bacteroides, capaces de utilizar los alimentos no digeridos previamente y vivir entre células epiteliales, las cuales los utilizan y convierten en proteínas asimilables, mucina y otras materias.

En el intestino grueso es donde el número de bacterias es mayor; la concentración llega hasta 1011 y 1012 de bacterias vivas por gramo de heces, lo que representa un tercio del peso en seco. Las bacterias que predominan son las anaerobias estrictas de los géneros Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Peptostreptococcus y Clostridium, junto con algunas aerobias como las enterobacterias, pero en proporción mucho más baja, de 1000 a 1. Son precisamente las bacterias anaerobias el factor más importante en el mantenimiento de la "resistencia a la colonización". B. fragilis, aunque constituye menos del 1% de la flora total del colon, es el que se aisla en el 70% de las muestras clínicas de infecciones intraabdominales, debido a que se adapta mejor al medio donde se produce la alteración patológica.

4.4 Microbiota del tracto genital femenino.

También en la vagina existe una flora microbiana abundante y compleja en donde unas 20 especies son las más habituales. La microbiota anaerobia es diversa y compleja. Peptococcus, Peptostreptococcus, Bacteroides y los bacilos Gram positivos como Eubacterium y Clostridium son las bacterias que se aíslan con más frecuencia. Prevotella se encuentra como flora normal en más de un 20% de las mujeres.

La microbiota vaginal es relativamente constante, pero varía ante las distintas circunstancias fisiológicas de la mujer, como el embarazo, el puerperio, el uso de antimicrobianos, el empleo de dispositivos intrauterinos, la toma de anticonceptivos, la menopausia, etc.

4.5 Actividades fisiológicas.

Las bacterias anaerobias que constituyen la microbiota del hombre tienen un papel importante en procesos fisiológicos. Este aspecto es de especial importancia a nivel del tubo digestivo, ya que la flora intestinal tiene actividades de tipo metabólico. Intervienen de forma significativa en el metabolismo de los ácidos biliares, pues poseen las enzimas necesarias para tal fin. En la misma línea, hay que citar la metabolización de aminoácidos, mediante reacciones de desaminación o decarboxilación, de forma que cuando disminuye la flora intestinal pueden aparecer situaciones de malnutrición proteica, infantilismo y alteraciones en el metabolismo de la urea y tiroxina. Además, las bacterias anaerobias pueden sintetizar vitaminas del complejo B, así como ácido fólico.

Síntomas clínicos sugestivos de infección anaeróbica

5.1 Distribución de anaerobios en muestras clínicas:

Origen de las infecciones anaeróbicas

Las bacterias anaerobias son la causa de una gran diversidad de enfermedades en el hombre y en los animales. Estas bacterias pueden proceder de fuentes exógenas o endógenas.

Las bacterias anaerobias de la microbiota del hombre y de los animales, son comensales o saprofitas con carácter de oportunistas. Por tanto, son invasores secundarios, siendo el acontecimiento primario la difusión de la flora normal más allá de los límites de sus barreras mucocutáneas.

Los cuadros que originan estas bacterias son inespecíficos, pudiendo afectar a cualquier órgano o tejido y casi siempre son polimicrobianos. Además, con bastante frecuencia son procesos de etiología mixta, en ellos también están involucrados de forma simultánea bacterias aerobias.

6.1 INFECCIÓN ANAERÓBICA DE ORIGEN EXÓGENO

Botulismo

Gastroenteritis por Cl.perfringes

Mionecrosis (Gangrena gaseosa )

Tétano

Infección seguida de mordedura de animal o humana

Aborto séptico

6.2 INFECCION ANAERÓBICA DE ORIGEN ENDÓGENO

Absceso en cualquier órgano

Actinomicosis

Complicación de apendicitis

Mionecrosis clostridial

Endocarditis

Infección periodontal

Meningitis seguida de un absceso cerebral

Osteomielitis

Las infecciones producidas por las bacterias anaerobias ocurren en todas las partes del cuerpo humano. Los tejidos infectados contienen generalmente una mezcla de varias clases de anaerobios y también contienen con frecuencia bacterias aerobias y facultativas. Los tipos de infecciones producidas comúnmente por las bacterias anaerobias son como sigue:

a) Infecciones intrabdominales. Los abscesos, las infecciones postoperatorias de la herida y la peritonitis generalizada producida por los anaerobios, ocurren como consecuencia de la perforación del intestino durante cirugías o por lesión.

b) Infecciones pulmonares. Las infecciones anaerobias del pulmón pueden originarse en los bronquios o la sangre. Las aspiraciones de la zona respiratoria superior, que contienen una gran cantidad de bacterias anaerobias, son responsables de iniciar la infección en los bronquios.

c) Infecciones pélvicas. Las infecciones anaerobias de la vagina y del útero ocurren a veces después de cirugía ginecológica o en la asociación con malignidad de órganos pélvicos.

d) Abscesos del cerebro. Los anaerobios producen infrecuentemente meningitis, pero son una causa común de los abscesos del cerebro. Los organismos que provocan la infección se originan generalmente en el tracto respiratorio superior.

e) Piel e infecciones del tejido suave. Las combinaciones de anaerobios, de aerobio, y de organismos facultativos actúan a menudo sinergísticamente para producir estas infecciones.

f) Infecciones orales y dentales. Estas infecciones locales se extienden con frecuencia a la cara, el cuello y a veces a otras áreas del cuerpo tales como el cerebro.

AREAS FRECUENTEMENTE AFECTADAS POR ANAEROBIOS

6.3 INCIDENCIA DE INFECCIONES ANAEROBICAS:

7- PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

7.1 Medios utilizados para el estudio de anaerobios:

• 1. Brucella agar con 5% de sangre de carnero, suplementado con vitamina K y Hemina. También son útiles el Columbia y el Schaedler agar.

• 2. Bacteroides bili-esculina agar ( B. fragilis ).

• 3. Agar sangre con Kanamicina-Vancomicina. ( Bacteroides )

• 4. Agar alcohol fenil etílico. ( Inhibe entéricos. Muy útil para Bacteroides ).

• 5. Tioglicolato 135 sin indicador. Medio de enriquecimiento que puede suplementarse con vitamina K (0.1ug/ml ), Hemina (5 ug/ml ) o bicarbonato de sodio ( 1 mg/ml ). Calentar en baño María por 10 minutos con la tapa floja.

Luego sacar, apretar la tapa y dejar enfriar, antes de usar.

6. Carne molida-dextrosa. Para Clostridium, visualización de esporas, determinación de toxinas y mantenimiento de colonias.

7. Agar yema de huevo (C. perfringes y cocos grampositivos anaeróbicos)

7.2 Sistemas para el cultivo de anaerobios:

Los anaerobios pueden crecer en las placas de agar en una atmósfera sin O 2, generalmente N 2 al 80%, CO 2 al 10% e H 2 al 10%. El CO 2 estimula el crecimiento y el H 2 combinado con O 2 , que pueda estar presente, sirven para mantener las condiciones anaerobias.

Algunos sistemas para el cultivo de anaerobios son

• Técnica de jarra anaeróbica

• Técnica de cámaras de anaerobios

• Medios Pre-reducidos

Aunque existen varias técnicas disponibles para mantener un ambiente libre de oxígeno durante el procesamiento de los especimenes para el cultivo de anaerobios, la jarra anaeróbica es la más común.

7.2.1 Técnica de la jarra anaeróbica:

Los diferentes sistemas de jarras anaeróbicas incluyen la de Brewer, GasPak, McIntosh-Fildes, Jarra Tolbar, entre otras.

Nos referiremos a la jarra GasPak, por ser la de mayor utilidad en el mundo.

El principio básico de ésta, es como la de todas: La remoción del oxígeno presente en la cámara ocurre por la reacción con el hidrógeno producido, en presencia de un catalizador, para formar agua. La reacción se describe como 2H2 + O2 >>> 2H2O

El catalizador está compuesto de un pellet de aluminio revestido de 0.5 % de paladio. El catalizador puede ser inactivado en la jarra por la producción de sulfuro de hidrógeno u otros metabolitos volátiles producidos por las bacterias. Por ello se recomienda que los catalizadores sean reemplazados cada vez que se va a cerrar la jarra. Los mismos pueden restaurar su actividad si son calentados a 160 – 170 ºC por 2 horas; luego de lo cual son almacenados en un lugar seco y limpio a temperatura ambiente.

El sobre generador de GasPak contiene un papel de filtro, una tableta de borohidruro de sodio, una tableta de bicarbonato de sodio y ácido cítrico. El sobre es activado al añadir 10 ml de agua y el ambiente se obtiene en aproximadamente 30 minutos, visualizándose por una condensación del agua dentro de la jarra.

El sistema produce un potencial de oxido-reducción ( Redox ) de -100 Mv dentro de

1 hora y – 200 Mv en 2 horas. Dentro de una hora de incubación a 35 ºC , la concentración de gases es de aproximadamente 4 a 10% de CO2.

Las condiciones anaeróbicas pueden ser monitoreadas utilizando un indicador de óxido-reducción; una tira de papel de filtro impregnada de azul de metileno puede ser utilizada con éste propósito. El azul de metileno se degrada a incoloro y permanece así mientras se mantengan las condiciones de ausencia de oxígeno.

Si el la tira indicadora se observa azul, hay falla en la producción del ambiente y los cultivos deben ser repetidos. El azul de metileno se decolora en aproximadamente

4 a 6 horas a 35 ºC.

Existen en mercado diversas marcas para generadores de ambientes, entre los que llama la atención el Genbox de bioMerieux que no requiere agua para su activación ni catalizador. No desprende Hidrógeno y requiere ser colocado en menos de 1 minuto en la jarra, ya que la reacción es inmediata.

Normalmente el periodo de incubación de los platos es de 48 h, sin embargo algunos requieren más de 3 días como el Fusobacterium y algunos cocos anaeróbicos. Generalmente el periodo máximo de incubación es de 72 horas , con observación de los platos a las 48h.

JARRA DE BREWER

Hay otros procedimientos más sofisticados que se utilizan para aislar los microorganismos extremadamente oxígeno-sensitivos que no siempre pueden ser recuperados usando la jarra anaeróbica.

7.3 Medios Pre-Reducidos (PRAS):

En este método se preparan los medios prerreducidos, se esterilizan, se almacenan en tubos sellados y se les inocula un ambiente libre de oxígeno. Siempre que los tubos se abran por ejemplo para la siembra de la muestra, inoculaciones, transferencia etc., se protegen contra la entrada del oxígeno haciendo pasar a través de ellos y de manera continua, una corriente de gas libre de oxígeno (bióxido del nitrógeno o de carbono). Cada tubo es por lo tanto, su propia cámara de anaerobiosis.

Un método muy práctico de preparación, es el del medio prerreducido con aguja.

Se prepararan tubos de caldo infusión cerebro y corazón (BHI) y tubos de BHI a los que se les incorporó un trozo de carne de res de 0.5 cm de carne cocida desgrasada (BHI-carne), prerreducidos, de acuerdo con las recomendaciones de Holdeman, Cato y Moore, para garantizar una atmósfera completamente anaeróbica.

Para crear la atmósfera anaerobia, el medio de cultivo se dispone en volúmenes de

5 ml en tubos 16 x 100 mm con tapón de hule (nuevo) y tapa de rosca a la que se le hizo un orificio de 1 mm; a través de dicho orificio se introdujo una aguja #27. Los tubos bien cerrados se esterilizaron durante 15 minutos a 121 ºC. Concluido el ciclo de esterilización, se procede a una descompresión rápida de la autoclave y con guantes protectores se precede a sacar las agujas en cada uno de los tubos que se encontraban aún en proceso de ebullición. Los tubos se dejan enfriar a temperatura ambiente y son descartados todos aquellos que presentaran evidencia de oxidación, de acuerdo con el indicador de resarzurina que tiene incorporado el medio.

7.3.1 El método del Roll-Tube es una técnica popularizada por el Virginia Polytechnic Institute (VIP), el cual consiste en un tubo con tapa que contiene gas libre de oxígeno y una capa delgada del medio prerreducido ( PRAS ) en su superficie interior. La muestra se inocula mientras que se rota el tubo. Esto produce una pista en espiral en la superficie del agar. El tubo se limpia con una corriente de bióxido de carbono para prevenir la entrada del aire mientras que esté abierto durante la inoculación, con lo que el tubo al taparlo se convierte en su propia cámara anaeróbica de cultivo.

7.4 La cámara de anaerobio con guantes es otra innovación desarrollada para aislar bacterias anaerobias. Es esencialmente un compartimiento grande de vinil transparente, con los guantes unidos, conteniendo una mezcla de 80 % de nitrógeno, 10 % de hidrógeno y 10 % de bióxido de carbono. Recordar que el H2 es explosivo.

Un compartimento en un extremo de la cámara contiene dos portillas, una que conduce al exterior y la otra al interior del compartimiento. Los especimenes se ponen en el compartimento, la portilla exterior es cerrada, y el aire en el compartimento se evacua y se substituye por la mezcla de gas. La portilla interior entonces se abre para introducir el espécimen en la cámara principal cuando las presiones se igualan. Una de las cámaras más recomendadas es la de Forma Scientific(.

Cámara de anaerobios

7.5 Principios generales para el éxito del cultivo:

• 1. Apropiada colección y transporte

• 2. Procesamiento de la muestra con la mínima exposición al oxígeno

• 3. Medio de cultivo fresco o prerreducido.

• 4. Uso de un sistema anaeróbico adecuado.

7.6 Características útiles en la identificación de bacterias anaeróbicas:

A pesar de que existen signos bacteriológicos que sugieren crecimiento de organismos anaeróbicos como morfología celular típica en Gram, crecimiento en el área profunda de un medio líquido, gas y mal olor en el cultivo, los siguientes detalles ayudan a orientarnos en el diagnóstico:

1. Morfología de la célula y de la colonia

2. Producción de pigmento

3. Formación de endosporas

4. Beta-hemólisis en agar de sangre

5. Picaduras en el medio

6. Fluorescencia con la luz ultravioleta

7. Movilidad

8. Índice de crecimiento

9. Olor característico del cultivo

10. Producción de catalasa

11. Crecimiento en presencia de bilis al 20%

12. Patrones específicos de la susceptibilidad a los antibióticos

13. Efectos del cultivo en agar yema de huevo

14. Producción de indol

15. Hidrólisis de la esculina

16. Subproductos metabólicos característicos de la fermentación de la glucosa

17. Producción de toxinas

7.7 Muestras no adecuadas para el cultivo de anaerobios:

• a) Lavado bronquioalveolar desprotegido.

• b) Hisopo cervical.

• c) Aspirado endotraqueal.

• d) Loquios.

• e) Hisopo nasofaríngeo / Secreción faríngea.

• f) Líquido seminal o prostático.

• g) Esputo por expectoración o inducido.

• h) Heces, rectal, contenido gástrico, colostomía.

• i) Secreción uretral / hisopo vaginal o vulvar.

• j) Orina por vaciado directo o catéter.

Técnicas para la identificación de bacterias anaeróbicas

8.1 Pruebas de Identificación Bacteriana:

8.1.1 Etanol- espora test

Sirve para separar bacilos esporulados de los no esporulados, basado en la resistencia de las esporas al alcohol.

• 1. Utilice un caldo de cultivo de 48h

• 2. Adicione 1 ml del caldo de cultivo a un tubo conteniendo 1 ml de alcohol etílico al 95%.

• 3. Mezcle y deje reposar por 30 a 45 minutos.

• 4. Introduzca un hisopo dentro del tubo y siembre en un plato de agar sangre.

• 5. Introduzca otro hisopo en el caldo original y siembre en plato de agar sangre. Este servirá de control para la pureza y viabilidad del microorganismo.

• 6. Incube ambos platos en ambiente anaeróbico a 35 ºC por 48 h.

• 7. Crecimiento en ambos platos indica la presencia de esporas.

8.1.2 Test de SIM en Anaerobiosis por Esporas

Este test no está descrito en ningún libro y fue descubierto por nosotros de forma casual. Desde entonces por su sencillez es utilizado en la mayoría de los laboratorios del país.

• 1. Coloque la colonia en un tubo conteniendo medio para SIM (Movilidad).

• 2. Incube por 48h a 35 ºC en ambiente anaeróbico.

• 3. Si hay presencia de H2S, haga un frotis por Gram y un frotis por verde malaquita. ( 1 minuto verde malaquita flameando 2 veces, lavado con agua, teñir con safranina por 1 minuto ).

• 4. El frotis teñido por verde malaquita demostrará la presencia de esporas (verdes), si el organismo tiene la capacidad de producirla.

Esporas oval sub-terminal. Frotis por verde malaquita

8.1.3 Prueba de bilis al 20%

Esta prueba es útil para separar el grupo de B. fragilis bilis resistente, del resto de los bacteroides sp. La prueba se puede hacer con disco impregnado de bilis, agar o tubo de bilis test.

• 1. Haga una solución de bilis pura al 40%. Esterilice por autoclave.

• 2. Adicione 0.5 ml de bilis a 10 ml de tioglicolato previamente hervido. Esto hace una concentración de 2% de bilis pura, equivalente a 20% de bilis.

• 3. Inocule al tubo de tioglicolato-bilis y a otro tubo de tioglicolato sin suplemento, 1 a 2 colonias de un plato puro de agar sangre.

• 4. Incube por 24 a 48h.

• 5. Compare el crecimiento en ambos tubos. La prueba es catalogada inhibición por bilis, si no hay crecimiento en el tubo de tioglicolato-bilis.

8.1.4 Lecitinasa Test

El componente lecitina, un componente normal de la yema de huevo, es descompuesta por la enzima lecitinasa en un diglicérido insoluble. Esto resulta en un halo opaco en el medio conteniendo yema de huevo. Es un test importante para los clostridium.

• 1. Inocule el medio McClung Toabe yema de huevo agar suplementado con emulsión de yema de huevo, con el organismo en plato de 24-48h de incubación.

• 2. Incube anaeróbicamente por al menos 24h a 35 ºC.

• 3. Examine por una opacidad blanca en el medio que rodea la colonia y que se extiende al final del crecimiento.

Clostridium novyi en agar yema de huevo.

Reacción de Lecitinasa y Lipasa positiva

8.1.5 Nagler Test

Cl. perfringes, barati, bifermentans y sordelli producen una alfa lecitinasa la cual es detectada por un test de neutralización, utilizando perfringes antitoxina tipo A y B.

• 1. Inocule la mitad de un plato de agar yema de huevo con la antitoxina.

• 2. Deje secar. Inocule el organismo a examinar en la otra mitad del plato libre de antitoxina y luego estriar a través del lado con antitoxina.

• 3. Incube anaeróbicamente por 24 a 48h a 35 ºC.

• 4. Examine por la pérdida de la turbidez en la mitad del plato con antitoxina, lo que demuestra la neutralización de la lecitinasa, lo cual es un test positivo.

Cl. perfringes- Nagler test positivo en agar yema de huevo

Note la perdida de la actividad de la Lecitinasa en el lado derecho, con antitoxina, comparado con el agar limpio en el lado izquierdo, sin antitoxina

8.1.6 CAMP test reversa

Es similar al test para identificar Estreptococos betahemolíticos del grupo "B" (EBHB), excepto que en éste test, el clostridium reemplaza al S. aureus.

El EBHB puede inhibir algo de la hemólisis con otros clostridium y solo el

Cl. Perfringes muestra la característica hemólisis en forma de cabeza de flecha.

• 1. Utilice colonias frescas de clostridium y EBHB.

• 2. Inocule el Estreptococo en una sola línea en el agar sangre, en ángulo de 90º con respecto a una línea de clostridium, haciendo una cruz.

• 3. Incube anaeróbicamente a 35 ºC por 24 a 48h.

• 4. Una zona en forma de cabeza de flecha que indica una hemólisis sinergística, es una prueba positiva.

Cl. perfringes. CAMP test reversa positiva

8.1.7 Test de ureasa en caldo

Es útil para diferenciar algunos clostridium, bacteroides y actinomyces.

• 1. Prepare una suspensión fuerte del organismo en un caldo de urea estéril.

• 2. Incube aeróbicamente a 35 ºC por 24 h.

• 3. Un color morado brillante a rojo es una prueba positiva. Este cambio de color puede ocurrir entre 15 a 30 minutos.

Es útil para diferenciar Bacteroides urealyticus de B. gracilis y B. fragilis. También es útil para separar Cl. sordellii del menos patogénico Cl. Bifermentans.

  8.1.8 Indol:

• 1- Colocar una porción de la colonia sobre un pedazo de papel de filtro.

• 2-  Agregar una gota del reactivo.

• 3- Las colonias positivas dan un cambio inmediato cercano al color rosado.

• 4- Es Una prueba útil para distinguir entre Bacteroides spp. y Fusobacterium spp. y entre miembros de la familia del Peptostreptococcus spp. y clostridium spp.

8.1.9 Nitrato:

Es una prueba en disco de nitrato en 2 horas , la cual es útil para diferenciar el grupo de B. fragilis del grupo de B. ureolyticus, y el grupo de bacilos grampositivos no esporulados que incluye al Propionibacterium acnes y Eubacterium lentum ( ahora Eggerthella lenta). Veillonella es también nitrato positivo.

 8.1.10 Catalasa:

Para el test de catalasa en anaerobios, se utiliza una solución de H2O2 al 15%, lo cual parece ser más sensible que la solución al 3% utilizada para estafilococos.

Bacteroides fragilis y Bacteroides thetaiotaomicron, son catalasa positiva, sin embargo, muchos otros miembros e la familia del Bacteroides fragilis son catalasa negativa. Propionibacterium acnes es catalasa positiva y sin embargo, Eubacterium lentum (Eggerthella lenta) es negativa. El B.thetaiotaomicron convierte el ácido litocólico en éster etílico. El ácido litocólico puede ser un promotor de tumores.

8.1.11 SPS:

El Polyanethol – sulfonato de sodio (SPS), un anticoagulante comúnmente usado, inhibe ciertas bacterias tales como el Peptostreptococcus anaerobius y el aerobio Gardnerella vaginalis. Los discos de papel impregnados con el SPS al 5% se pueden utilizar como herramienta para distinguir P. anaerobius de otros cocos anaerobios.

El P. anaerobius da generalmente una zona muy grande de inhibición (> 166 mm), mientras que otros cocos anaerobios que son susceptibles al SPS dan zonas más pequeñas.

El Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual recomienda que todos los laboratorios deban ser capaces de identificar los anaerobios al menos hasta el nivel 1, lo cual es definido como "Identificación presuntiva para platos primarios". Esta información incluye parámetros simples como reacción al Gram, morfología y algunas pruebas bioquímicas básicas.

• Causas de error en la investigación de anaerobios :

• 1. Aceptación para cultivo de muestras no recomendadas para anaerobios.

• 2. Falla en excluir flora normal durante la colección.

• 3. No evitar la entrada de aire durante la colección y transporte de la muestra.

• 4. Falla en los catalizadores e indicador.

• 5. No mantener los platos anaerobios en incubación por más tiempo.

• 6. Utilizar el método de Kirby-Bauer en la sensibilidad.

Anaerobios de mayor importancia clínica

A – Bacilos GramNegativos

a) Bacteroides fragilis ( 12-23% )

b) Bacteroides melaninogenicus

c) Fusobacterium nucleatum

B- Bacilos GramPositivos Esporulados

a) Clostridium perfringes ( 5-10% )

C- Bacilos GramPositivos No Esporulados

a) Propionibacterium acnes ( 5-10% )

D- Cocos Gram Positivos

a) Peptococcus asaccharolyticus ( 9-10%)

b) Peptococcus anaerobius ( 8-9% )

• Breve descripción de los anaerobios de mayor importancia :

Al presente existen más de una docena de géneros de los bacilos Gram negativos anaeróbicos estrictos. Sin embargo, en la mayoría de las infecciones clínicas, solo los géneros Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella y Fusobacterium, deben ser considerados.

9.1.1 Bacteroides sp:

Bacteroides sp es tal vez la bacteria mas numerosa del intestino, y también la bacteria anaeróbica estricta de mayor importancia clínica. Descrita originalmente en 1898 es un anaeróbico estricto, Gram-negativo, pleomórfico, que no se podrían asignar convincentemente a ninguna otro género. El análisis fisiológico de este género reveló heterogeneidad considerable con respecto a sus características bioquímicas, indicando que estas bacterias no representaban un grupo filogenético verdadero. De acuerdo con esta información, se ha repartido los miembros grupo Bacteroides original en tres géneros: Bacteroides, Prevotella, y Porphyromonas. Esta definición restringe el Bacteroides a diez especies.

El B. fragilis es el organismo anaerobio más común aislado de infecciones clínicas y los casos no tratados tienen un índice de mortalidad del 60% , especialmente por su capacidad de hacer resistencia a los antibióticos. Esta mortalidad se puede disminuir grandemente con uso de la terapia antimicrobiana apropiada.

9.1.1.1 Factores de virulencia del Bacteroides.

• Cápsula polisacárida

• Enzimas histolíticas

• Lipopolisacárido

• Tolerancia al oxígeno

• Aglutininas

• Beta lactamasa

 La Cápsula Polisacárida es detectable mediante tinción y técnicas inmunológicas. La cápsula es antifagocítica y favorece a la formación de abscesos. Los B. frágiles encapsulados se adhieren a las superficies peritoneales con mayor efectividad que las no encapsuladas, por sus aglutininas, por lo que éste microorganismo se asocia a más del 80% de las infecciones intraabdominales. Es probable que la adherencia interfiera con la eliminación de las bacterias mediadas por macrófagos.

9.1.1.2 Características fundamentales de infecciones por bacteroides son:

• Origen endógeno.

• Aparecen como infecciones mixtas con otros gérmenes.

• Tendencia a formar abscesos.

9.1.1.3 Sindromes clínicos:

• B .fragiles se asocia con supuración, peritonitis por lesión intestinal, osteomielitis, neumonías, endocarditis, septicemia y abscesos en pulmón, tubo digestivo, ATO (absceso tubo ovárico).

• Establecida la infección, la población se puede extender desde las superficies mucosas hasta los tejidos o líquidos estériles sobre todo en casos de traumatismo o enfermedad previa.

• Las bacterias encapsuladas como B. fragiles desempeñan un papel destacado en infecciones y conducen a la formación de abscesos.

• Las infecciones se localizan en zonas próximas a las mucosas colonizadas.

Se aísla en el 15 al 20% de infecciones pleuropulmonares, en dos tercios de infecciones pélvicas supuradas y en todas las infecciones intraabdominales con formación de abscesos.

9.1.1.4 Diagnóstico de laboratorio:

El examen microscópico de las muestras puede tener utilidad cuando se sospecha una infección por anaerobios. Aunque las bacterias quizá se tiñen poco y de forma irregular, la presencia de bacilos Gram negativos pleomórficos puede suponer una información preliminar útil.

B. fragilis se puede identificar además por la resistencia a Kanamicina, Vancomicina y Colistina y el crecimiento en bilis al 20%. Es indol negativo, catalasa positiva, hidrólisis de esculina positiva, fermenta la glucosa y lactosa.

9.1.1.5 Susceptibilidad a los antimicrobianos:

La terapia antibiótica combinada con intervención quirúrgica supone la estrategia principal para controlar las infecciones serias por anaerobios. Producen B-lactamasa por lo que son resistentes a penicilinas y cefalosporinas. Sin embargo se pueden emplear concentraciones altas de Carbenicilina, Piperacilina, inhibidores de la B-lactamasa y otros antibióticos B-lactámicos seleccionados como: Cefoxitina, imipenem. El Metronidazol es activo contra la mayoría de los Bacteroides.

El Bacteroides es potencialmente resistente a una amplia gama de antibióticos. La resistencia a Clindamycina y a Eritromicina ha aumentado lenta pero constantemente durante los últimos años. Metronidazol también es una posibilidad terapéutica.