Eucalyptus saligna y Eucalyptus citriodora (página 2)

Enviado por Dr.C. Guillermo Barreto Argilagos

Partes: 1, 2

RESULTADOS

La infusión 9 y la decocción 10 de E. saligna (140 mg/mL y 70 mg/mL, respectivamente) fueron las de mayor efecto inhibitorio en la viabilidad de las cepas estudiadas (Tabla 3). Sin embargo, el análisis estadístico efectuado, puso de manifiesto que los extractos 3 (decocción, 140 mg/mL) y 5 (extracto acuoso, 140 mg/mL) de E. saligna tienen un efecto similar (Tabla 4).

En el ensayo preliminar, efectuado para establecer la acción inhibitoria de los extractos sobre la expresión del factor de colonización fibrilar K88, se constató un resultado positivo en 1; 4; 6; 7 y 8; dudoso para 2 y 10, por la aparición de cepas autoglutinantes; y negativo para 3; 5 y 9 (Tabla 5).

El ensayo definitivo, realizado con los extractos que tenían acción bloqueadora positiva (y dudosa) sobre la expresión de K88, demostró un mayor efecto de la decocción (6; 17,5 mg/mL) e infusión (7; 8,75 mg/mL) de E. saligna, seguidos de la decocción de E. citriodora (1, 70 mg/mL). La presencia de variantes autoaglutinantes enmascaró los restantes resultados (Tabla 6).

Todos los extractos inhibidores de K88, también lo fueron del factor CFA/I que además, resultó inhibido por el extracto 10, a diferencia de K88 (Tabla 6). En las experiencias efectuadas con la cepa portadora de CFA/I, no se observaron variantes autoaglutinantes.

Los ensayos de ELISA, efectuados con las variantes autoaglutinantes, demostraron la ausencia total de K88 en la variantes tratadas con el extracto acuoso de E. citriodora (4). En los restantes casos los resultados no son concluyentes, dada la imposibilidad de realizar este ensayo a todas las variantes autoaglutinantes (Tabla 7).

Las principales acciones de los extractos sobre E. coli G7 se resumen en las Tablas 8 y 9.

DISCUSIÓN

En la investigación realizada sólo algunos extractos elaborados a partir de E. saligna afectaron la viabilidad de las cepas tratadas (Tabla 3). Su efecto inhibidor estuvo proporcionalmente relacionado con la concentración (Tabla 4). Este es un resultado que ha sido muy contradictorio en trabajos precedentes. Roig (1974) refiere la acción antimicrobiana del Eucalyptus. Sus resultados se concretan a experiencias efectuadas a partir de hojas de esta planta. Dellacassa et al. (1989) efectuaron un estudio que abarcó 17 especies de Eucalyptus. En el mismo constataron una acción diferencial sobre la viabilidad bacteriana que estaba condicionada tanto por la especie de Eucalyptus, como de las bacterias estudiadas. Esta investigación se limitó también a los aceites esenciales obtenidos de hojas de Eucalyptus.

Barreto et al. (1995b) demostraron la acción bactericida in vitro de tinturas elaboradas de corteza Eucalyptus sobre cepas de Pseudomonas aeruginosa polirresistentes en las que la acción bactericida no era debida al alcohol presente en los extractos y sí a su capacidad de extracción de los metabolitos (o metabolito) responsables del efecto bactericida. Los estudios relativos a la acción antibacteriana de decocciones, infusiones y extractos acuosos de la corteza de esta planta son muy escasos y no coincidentes. Bertha Velázquez et al. (1989) por primera vez, establecieron la acción de decocciones de cortezas de Eucalyptus en el tratamiento de diarreas agudas debidas a ECET. Este colectivo no encontró efectos bactericidas en las decocciones utilizadas. Posteriormente, Barreto et al. (1993a), establecieron la acción inhibitoria de estos extractos en la expresión de los factores fibrilares de colonización K88 y K99, sin que se afectara la viabilidad bacteriana.

Resultados similares, en lo referente a la no afectación del crecimiento bacteriano, reportaron Barreto et al. (1993b). En estos trabajos no se identificó la especie de Eucalyptus utilizada. Más adelante se pudo precisar que se trataba de hibridaciones en que no participaban E. saligna y E. citriodora (Misleidi Martín et al., 1993; Barreto et al., 1995a). Los resultados del presente estudio, ponen de manifiesto la participación de 3 factores en el fenómeno analizado: a) especie de Eucalyptus, b) concentración del extracto y c) cepa bacteriana. El método de extracción, en las condiciones de esta investigación, no influyó (Tablas 3 y 4).

En los tamizajes fitoquímicos efectuados a E. saligna (Yadila Gómez et al., 1994) y E. citriodora (Mayra Castells et al., 1994) se ha constatado la presencia de taninos, flavonoides y quinonas, tanto en las decocciones como en los macerados acuosos. Estos metabolitos, teniendo en cuenta lo reportado por Cuellar (1983) pueden estar vinculados con los efectos sobre viabilidad anteriormente analizados.

La acción de los extractos sobre la expresión del factor de colonización K88, en la experiencia preliminar, demostró un efecto inhibitorio ante la decocción (1) y el extracto acuoso (4) de E. citriodora, y las decocciones (6 y 7) e infusión (8) de E. saligna. Los restantes extractos promovieron autoaglutinaciones o no inhibieron la expresión de K88 (Tabla 5).

Tanto en esta experiencia preliminar como en la definitiva (Tablas 5 y 6) se pudo comprobar que todos los extractos elaborados a partir de E. citriodora inhibían la expresión de la fimbria K88. Con los extractos de E. saligna sólo se logró este efecto en los de concentraciones inferiores a 21 mg/mL, siendo máximo en la decocción (6) e infusión (7) (Tabla 6). Este aspecto se analizará más adelante.

Todos los extractos con acción inhibitoria sobre K88, también bloquearon la expresión de CFA/I, además del 10, que sólo reprimió a este último pues, debido a las autoaglutinaciones su resultado sobre K88, hasta este momento de la investigación, se toma como negativo (Tabla 6). El factor de colonización I (CFA/I) es de los más frecuentes en ECET que afectan al humano. Posee un alto contenido de aminoácidos hidrofóbicos que le confieren a la bacteria una elevada hidrofobicidad superficial. Blanco y Blanco (1993) describen esta fimbria con un patrón de hemoaglutinación manosa resistente frente a hematíes humanos, de terneros y de pollos; de allí, la elección de los primeros para evaluar la posible acción inhibitoria de los extractos en su expresión. Como se trata de una cepa salvaje, no de referencia, su estudio es sólo preliminar. Por ello, no se realizaron réplicas, como en las investigaciones en que estuvo involucrada la cepa G7 que, además de ser una cepa de referencia, ha estado involucrada en los estudios anteriores sobre esta temática.

La inhibición de los factores de colonización, ha sido una opción investigada en E. coli asociadas a infecciones del tracto urinario (UTIEC). Al respecto, se han utilizado concentraciones subletales de antibióticos (Padilla et al., 1988; Padilla, 1991). Prieto et al. (1995) inhibieron la expresión de la fimbria P con extractos de Lepidium virginicum. Barreto et al. (1998) lograron efectos similares con tinturas de Achirantes aspera. En P. aeruginosa también se han obtenido resultados semejantes mediante la utilización de quinolonas en concentraciones subletales (Nobile et al., 1992). Barreto et al. (1994) lograron la inhibición de la expresión de la fimbria K88 de E. coli G7 mediante el uso de aminoglucósidos en concentraciones subletales. Concentraciones de sodio, a partir de 40 g/L, estimulan la formación de una seudocápsula en cepas de E. coli uropatógenas que recubre sus fimbrias, inhibiendo así su contacto con los receptores de eritrocitos y células uroepiteliales (Padilla, 1989).

Misleidi Martín et al. (1993) concluyeron que los extractos de E. saligna no inhibían la expresión de K88. Este colectivo utilizó extracto acuoso e infusión, ambos con una concentración de 70 mg/mL. En el presente trabajo se constató que, aún a concentraciones de 21 mg/mL, tampoco se produce este efecto que, en el caso de las infusiones, tiene lugar a concentraciones menores o iguales a 17,5 mg/mL (Tablas 8 y 9). Niurka Sóñora et al. (1992), no lograron inhibir la expresión de esta adhesina utlizando decocciones de Eucalyptus, en tanto que Barreto et al. (1993) sí. En ambos casos no se precisa la especie de Eucalyptus utilizada.

Barreto et al. (1993a) reportaron inhibiciones de la fimbria K88 de E. coli G7 frente a extractos de Achirantes aspera. Este colectivo (1995) había obtenido efectos similares con extractos de E. citriodora, no así con los efectuados a partir de E. saligna. En todas estas experiencias estuvo presente la cepa E. coli G7. Los resultados obtenidos posibilitan establecer que en la inhibición de K88 influyen: a) la especie de Eucalyptus y b) la concentración de extractos. No existen elementos para asegurar que el método de extracción tenga influencia.

La aparición de variables autoaglutinantes, inducidas por el tratamiento con los extractos, constituyó un elemento enmascarador de los resultados de experiencias precedentes (Misleidi Martín et al., 1993; Barreto et al. 1995a), así como de ésta. La imposibilidad de utilizar técnicas de miscroscopia electrónica, obligó a una confrontación de las variantes autoaglutinantes frente a un ELISA tipo Sandwich. Los resultados obtenidos evidenciaron la pérdida de K88 en todas las variantes

autoaglutinantes ensayadas (Tabla 7). Estos resultados, tienen un valor comparable al logrado con la microscopia electrónica ya que el AcM 11/70 detecta la subunidad FaeG, que constituye el componente principal de la fimbria K88 y, al mismo tiempo, comprende su elemento de adhesión (Kusters y Gaastra, 1994; Mol y Oudega, 1996).

El bloqueo de la expresión de la fimbria K88 puede deberse a una infinidad de causas que van, desde la represión del operón fae, hasta el bloqueo de los distintos sistemas enzimáticos vinculados con la transportación y ensamblaje de las subunidades que conforman la fimbria K88. En tal sentido, al igual que ocurre con los antibióticos bloqueadores de la síntesis proteica utilizados en concentraciones subletales, en los extractos analizados, deben estar presentes metabolitos que actúen de forma similar. Este es un aspecto por dilucidar en investigaciones posteriores; los flavonoides, quinonas y taninos, detectados en los tamizajes fitoqímicos realizados a las cortezas de estas plantas, constituyen opciones a valorar (Barreto et al., 2005).

La autoaglutinación es un fenómeno que, en bacterias gramnegativas, ocurre cuando se pierden las unidades repetidoras de monosacáridos de la envoltura externa (Tayot et al., 1981). Los flavonoides tienden a combinarse con diversos monosacáridos (Cuéllar, 1983) por ello, y teniendo en cuenta que están presentes en la corteza de las especies investigadas (Mayra Castells et al., 1994; Yadila Gómez et al., 1994) se puede inferir, como hipótesis, su participación en la formación de variantes autoaglutinantes.

Existe otra causa de autoaglutinación. La aglutinación se lleva a cabo en un medio salino donde la concentración óptima de electrólitos es 0,15 mol. Concentraciones mayores pueden neutralizar las cargas superficiales, que las bacterias y otros antígenos particulados poseen en su superficie a un pH neutro, y provocar aglutinación espontánea no específica (Margni, 1982).

Bertha Velázquez et al. (1989) establecieron que, una de las ventajas de los extractos de Eucalyptus usados como antidiarreicos, era su capacidad de restituir electrólitos perdidos en este síndrome multifactorial, por lo que, no se puede descartar su influencia en la aparición frecuente de cepas autoaglutionantes luego de su contacto con estos extractos. Este colectivo estableció la presencia de iones sodio y potasio en decocciones de corteza de esta planta. Se ha podido comprobar que el ion potasio estimula la adhesión bacteriana a sus receptores celulares (Vaca et al., 1989) en tanto que el sodio, como ya se mencionó, en altas concentraciones, induce la formación de seudocápsulas (Padilla, 1989). Es preciso profundizar en cuanto a la acción de estos dos iones a diferentes concentraciones

para poder definir su verdadero rol en el fenómeno analizado aunque, en el caso del sodio, nunca estaría en una concentración tan elevada que propiciara la producción de seudocápsulas.

La Tabla 8 recoge las principales acciones de los extractos investigados sobre la viabilidad y expresión de K88 en la cepa E. coli G7. En la misma se hacen correcciones a los valores del efecto inhibidor de K88 de extractos acuosos de E. citriodora, afectados por las autoaglutinaciones (Tabla 7). Esta tabla y la 9 constituyen una integración resumida de los resultados obtenidos en el presente trabajo, y brindan los elementos esenciales que han motivado las contradicciones en cuanto al efecto de extractos de Eucalyptus sobre la viabilidad y la expresión de K88 en E. coli G7 en los trabajos precedentes. Al mismo tiempo, señalan los aspectos aún pendientes de estudio.

Los resultados obtenidos en esta investigación, establecen las bases para la terapia de EDA debidas a ECET portadoras del factor de colonización K88 mediante 2 opciones:

– La forma convencional, que se sustenta en la acción de aquellos extractos que afectan la viabilidad de ECET.

– La inhibición del factor de colonización fibrilar K88, bloqueando así el primer paso en el desencadenamiento de esta etiología.

El estudio preliminar efectuado con la cepa E. coli 158 portadora de CFA/I, ofrece perspectivas semejantes, aunque es preciso estudiarla con el mismo rigor. Finalmente, dada la similitud existente entre ECET y V. cholerae, en cuanto a mecanismo de infección (Jones y Freter, 1976) y sus toxinas termolábiles (Tayot et al., 1981), así como el notable efecto de varios de los extractos sobre la viabilidad de esta especie bacteriana (datos no contemplados en este estudio) convierten a los mismos en opciones a considerar en el tratamiento del cólera, enfermedad que en las postrimerías del siglo XX regresó con nuevos bríos a cobrar vidas humanas.

CONCLUSIONES

El estudio efectuado con diversos extractos a partir de E. citriodora y E. saligna, permiten concluir lo siguiente:

• Su efecto sobre la viabilidad bacteriana depende de la especie de Eucalyptus, la concentración de los extractos y la especie o variedad bacteriana de que se trate.

• El efecto inhibitorio sobre el factor fibrilar K88 depende de: la especie de Eucalyptus y la concentración de los extractos.

• Todos los extractos que afectaron la expresión de K88 también inhibieron a CFA/I.

• En las variantes autoaglutinantes analizadas no estaba presente la fimbria K88.

RECOMENDACIONES

• Hacer extensivo este estudio a otras especies de Eucalyptus.

• Determinar la participación de flavonoides, taninos y quinonas, en los efectos sobre la viabilidad e inhibición de K88 constatados.

• Determinar la presencia de iones inorgánicos en los extractos evaluados con acción sobre K88. Evaluar la acción del ion sodio en este efecto.

• Establecer las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) de la viabilidad y la expresión de K88 de los extractos investigados, in vitro e in vivo.

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