Evaluación de extractos diversos de ambos en la viabilidad y expresión fimbrial de Escherichia coli enterotoxigénica.
RESUMEN
El trabajo analiza las causas que motivaron los resultados contradictorios precedentes en cuanto a la expresión fimbrial de K88 y la viabilidad de E. coli G7 frente a extractos de Eucalyptus. En la experiencia se utilizaron 8 cepas entéricas (7 de referencia K88+ y una cepa salvaje CFA/I +). Se ensayaron 10 extractos (5 decocciones, 3 infusiones y 2 extractos acuosos) de Eucalyptus citriodora y Eucalyptus saligna elaborados a diferentes concentraciones.
Se pudo comprobar que el efecto sobre la viabilidad depende de la especie de Eucalyptus, la concentración del extracto y la cepa bacteriana tratada. Ninguno de los extractos de E. citriodora tuvo acción sobre la viabilidad bacteriana. En los elaborados a partir de E. saligna este efecto fue proporcional a la concentración. El efecto inhibitorio de los extractos sobre K88 está relacionado con la especie de Eucalyptus y la concentración de los extractos. Todos los extractos que inhibieron K88 tuvieron un comportamiento semejante sobre CFA/I. El trabajo propone un modelo para el estudio de extractos de plantas que afecten la expresión fimbrial en el que los fenómenos de autoaglutinación no interfieren y no es imprescindible la utilización de técnicas de microscopia electrónica.
ABSTRACT
Causes provoking contradictory results concerning Eucalyptus extracts effects upon K88 fimbrial expression and viability in E. coli G7 are discussed. Eight enteric strains (seven from K88+ and one wild trait CFA/I+) were studied. Ten extracts (five decoctions,
three infusions, and two aqueous extracts) from E. citriodora and E. saligna prepared at different concentrations were analyzed. It was confirmed that extract effect upon viability depended on Eucalyptus species, extract concentration values, and bacterial strain under treatment. No E. citriodora extracts affected bacterial viability. E. saligna extract effect depended on concentration values. Extract inhibitory effect upon K88 depended on Eucalyptus species and extract concentration values. All extracts inhibiting K88 showed a similar effect upon CFA/I. A model to study plant extracts affecting fimbrial expression is suggested. This model does away with self-agglutination phenomena interferences and the use of electronic microscope techniques.
PALABRAS CLAVES: E. coli, E. coli enterotoxigénica, Eucalyptus, diarrea, fimbrias
INTRODUCCIÓN
Las diarreas constituyen un serio problema para la salud humana y animal. En las debidas a Escherichia coli enterotoxigénica (ECET) la colonización del intestino delgado constituye un paso previo imprescindible que tiene lugar gracias a la adhesión bacteriana a receptores del epitelio intestinal del hospedero. Se trata de una unión específica en la que participan estructuras bacterianas denominadas factores de colonización (Ørskov y Ørskov, 1983), destacándose entre ellas las fimbrias (Padilla et al., 1988).
En los últimos años diversas experiencias han tenido como objetivo el bloqueo de la adhesión mediante la elaboración de vacunas antifimbriales (Levine, 1990; Idania Wong et al., 1992, 1995, 1996, Moon y Bunn, 1993) y el empleo de determinados antibióticos en concentraciones subletales (Barreto et al., 1994), entre otros (Isaacson, 1980).
El Eucabev es un medicamento elaborado a partir de corteza de Eucalyptus para el tratamiento de la enfermedad diarreica aguda (EDA) en diversas especies animales, y el hombre (Berta Velásquez et al., 1991). Los reportes sobre la acción antimicrobiana de esta planta son muy contradictorios (Roig, 1974; Dellacassa et al., 1989; Niurka Sóñora et al., 1992; Misleidi Martín et al., 1993; Barreto et al., 1993b). Ensayos a partir de decocciones de corteza mostraron que las mismas carecían de acción bactericida y/o bacteriostática, al menos en concentraciones semejantes a las empleadas en el Eucabev (Niurka Sóñora et al., 1992; Misleidi Martín et al., 1993; Barreto et al., 1993; Barreto et al., 1995a). Estos resultados conllevaron a pensar que la acción de este medicamento estuviera relacionada con un bloqueo de la adhesión fimbrial, aspecto que se demostró en un ensayo que involucró a las cepas de referencia G7 (08K87, K88ab) y B44 (portadora de la fimbria K99) (Barreto et al., 1993a). Sin embargo, en trabajos posteriores, se obtuvieron resultados contradictorios en lo relativo a la adhesina K88 (Misleidi Martín et al., 1993; Barreto et al., 1995a).
El factor de colonización K88, además de prevalecer en las ECET que afectan a cerdos neonatos y postdestetados (Idania Wong et al., 1995, 1996), se ha caracterizado por mostrar una mayor estabilidad que las restantes estructuras de adhesión estudiadas en Escherichia coli (Barreto et al., 1993a) en tanto que la adhesina CFA/I es la más frecuente en cepas de ECET aisladas en pacientes de enfermedad diarreica aguda (Blanco y Blanco, 1993; Barreto, 1996). Esta entidad es la principal causa de EDA en los países en vías de desarrollo y se ha asociado a brotes de importancia en países desarrollados (Blanco et al., 1996; Roels, 1998; Mitsuda et al., 1998; Nishikawa et al., 1998) Teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto, este trabajo ha tenido como objetivos:
– Determinar las causas que han motivado un comportamiento contradictorio en la expresión de K88 y la viabilidad bacteriana de E. coli frente a extractos de corteza de Eucalyptus.
– Efectuar un estudio preliminar sobre la acción de estos extractos en la expresión de la fimbria CFA/I
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas
En la tabla 1 se recogen las principales características de las cepas utilizadas en la investigación.
Medios de cultivo
Se utilizaron los medios de cultivo: caldo Müeller Hinton y agar Müeller Hinton (OXOID, Gran Bretaña). En los ensayos en que se evaluó la acción inhibitoria de los extractos sobre la expresión de las fimbrias K88 y CFA/I se prepararon con el 50% del agua requerida, en el caso de los extractos 1; 2; 4; 6; 7 y 8, y con el 85% para los extractos 3; 5; 9 y 10. Luego de la esterilización se completó el volumen faltante con los extractos correspondientes, después de ser filtrados cada uno a través de filtros de Policarbonato Sartorius (SM 16508 B) para garantizar su esterilidad.
Inmunosueros
En las experiencias para determinar la acción inhibitoria de los extractos sobre la fimbria K88 se utilizó un inmunosuero anti-K88 de conejo policlonal monoespecífico. En el test de ELISA, utilizado para investigar las variantes autoaglutinantes, se emplearon, además del anterior, el anticuerpo monoclonal 11/70 antiK88ab y un conjugado anti-IgG de conejo en carnero.
Hematíes
Se utilizó sangre humana A en suspensión salina buferada (PBS) en proporción 1:4 y a pH 7,2 para los ensayos de hemoaglutinación manosa-resistente (Blanco y Blanco, 1993).
Extractos
El material vegetal fue secado en estufa con recirculación de aire a 40 0C durante 7 días. Luego fue reducido a polvo utilizando un molino con refrigeración por aire. Las decocciones se prepararon hirviendo el material vegetal en agua durante diez minutos. Pasado ese tiempo se dejó enfriar y se separó el material vegetal del líquido mediante filtración. Para las infusiones, se añadió el agua hirviendo sobre el material vegetal, se dejó reposar durante quince minutos, se enfrió y se separó el material vegetal de la infusión por filtración. En ambos casos, al final, se restituyó el volumen inicial mediante adición de agua destilada estéril. Los extractos acuosos fueron preparados por adición de agua destilada estéril al material vegetal, se maceró durante 24 horas, a 30 ºC y pasado ese tiempo se filtró para separar el material vegetal del extracto obtenido.
Las características de los extractos obtenidos por los métodos anteriormente descritos se recogen en la tabla 2. A cada extracto se le asignó un número, y con esa designación se utilizaron en la investigación sin que se conocieran sus particularidades.
Efecto de los extractos de Eucalyptus sobre la viabilidad bacteriana
Se utilizaron 8 cepas (todas caracterizadas en la tabla 1). El ensayo se realizó en placas Petri de 100 mm de diámetro a las que se adicionó 20 mL de agar Müeller-
Hinton en la siguiente forma: una primera capa (10 mL) con una concentración de agar-agar al 1,7%, a la que se agregó, una vez solidificada, una segunda capa (10 mL) con agar-agar al 1%. Cada placa se sembró por hisopaje a partir de las suspensiones bacterianas en agua destilada estéril, según lo establecido por Kirby y Bauer (Bio-Merieux, 1984). Con perforador se efectuaron, asépticamente, diez excavaciones en la capa superior de cada placa y, con el auxilio de una pipeta Eppendorf, se adicionó 25 µl de cada extracto en la excavación correspondiente. Todas las placas se incubaron a 37 ºC durante 24 horas. La experiencia constó de 3 réplicas. Se realizó un ensayo preliminar para determinar los extractos que inhibían la expresión de K88 en E. coli G7. Una vez establecidos los mismos, se repitió el ensayo con E. coli G7 y E. coli 158. Tanto en la experiencia preliminar como en la segunda se procedió de acuerdo a Barreto et al. (1993). El ensayo segundo contó con 5 réplicas en las experiencias realizadas con la cepa G7.
Confirmación de K88 en las variantes autoaglutinantes
A una parte de las variantes autoglutinantes de E. coli G7 se le investigó la presencia de K88 mediante un test de ELISA tipo Sandwich (Ana Campal et al., 1992).
Procesamiento Estadístico
A los resultados que se entendió pertinente se les aplicó el método de comparación de proporciones.
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