Patogenicidad de aislamientos chilenos de Beauveria bassiana en adultos de Asynonychus cervinus (boh.) (coleoptera: curculionidae) (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

Adultos de A. cervinus fueron colectados en los meses de marzo y abril de 1998 en un huerto de frambuesas (Rubus idaeus L.) de cuatro años de edad, ubicado en la localidad de Parral, VII Región (36º7’ lat. Sur; 71º49’ long. Oeste). El ensayo se realizó en el Centro Regional de Investigación Quilamapu, dependiente del Instituto de Investigaciones Agropecuarias, ubicado en la ciudad de Chillán. Los adultos se mantuvieron en una cámara de incubación a 18°C y oscuridad y dentro de cajas plásticas con poliestireno de baja densidad como sustrato inerte, se alimentaron con hojas y brotes de frambuesas desinfectados con hipoclorito de sodio al 0,05% por 1 min y posteriormente lavados con agua destilada estéril. El alimento se suministró diariamente ad libitum.

Para el estudio de la concentración letal del 50 y 90% de la población (CL50 y CL90), se utilizaron cuatro aislamientos de Beauveria bassiana (Cuadro 1) seleccionadas por su mayor letalidad a larvas de A. cervinus (France et al., 2000). Los aislamientos fueron multiplicados en placas Petri con agar Sabouraud (AS); una vez cubiertas las placas con el hongo se colectaron las conidias y se prepararon concentraciones de 104, 105, 106, 107 y 108 conidias mL-1, en agua destilada estéril más 0,1% de humectante (Tween 20); también se incluyó como testigo agua destilada estéril con el humectante. En cada tratamiento se sumergieron cinco adultos de A. cervinus por 3 s, luego fueron incubados dentro de cajas plásticas con papel absorbente humedecido, y mantenidos en cámaras con temperatura de 18°C en oscuridad (Butt y Goettel, 2000). El comportamiento de los individuos y la mortalidad se evaluó diariamente, mediante incubación de los cadáveres en cámaras húmedas, el consumo de alimento fue medido mediante el forrajeo de brotes de frambuesa desinfectados como se describió en el párrafo anterior. Diariamente se reemplazó el alimento por brotes frescos, y cada cinco días se midió la diferencia entre la cantidad proporcionada y el remanente de alimento a las 24 h como peso húmedo.

Cuadro 1. Origen de los aislamientos de Beauveria bassiana utilizadas en los ensayos. Table 1. Origin of the Beauveria bassiana isolates used in the experiment.

Para identificar los cuatro aislamientos de Beauveria a nivel de especie, se realizaron 50 mediciones de conidias y conidióforos, junto con observar las características de las colonias en medio AS (Lecuona, 1996).

El diseño del experimento fue completamente al azar con cuatro repeticiones. Los resultados de mortalidad obtenidos a diferentes concentraciones de inóculo fueron sometidos a análisis probit e interpolación desde la curva para el cálculo de la CL50 y CL90. El efecto de distintas concentraciones de inóculo sobre la mortalidad, fue evaluado el día que en que el primer aislamiento alcanzó 95% de mortalidad. El consumo de alimento de los insectos tratados con diferentes aislamientos fue medido en forma acumulativa sobre la misma unidad experimental, por lo cual fueron analizados como observaciones correlacionadas que perdieron su independencia, impidiendo el análisis probit. En reemplazo se utilizó la distribución de Weibull, función que describe la tendencia a través del tiempo para datos correlacionados (Marcus y Eaves, 2000), calculándose el tiempo para alcanzar el 50% del consumo (TA50) y sus respectivos intervalos de confianza.

La comparación entre las curvas de mortalidad para las diferentes concentraciones de inóculo, se realizó mediante un análisis de varianza de las pendientes de las regresiones obtenidas de cada repetición. El tratamiento testigo no se incluyó en el análisis de varianza, debido a que no presentó mortalidad durante el tiempo que duró el ensayo. Los análisis se realizaron con el programa estadístico Minitab 13 (Minitab Inc., State Collage, Pennsilvania, USA).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los primeros síntomas que presentaron los adultos de A. cervinus tratados con los cuatro aislamientos de Beauveria, fue el menor consumo de alimento y disminución de sus movimientos. Esto pudo deberse a que este hongo se caracteriza por producir toxinas, tales como bassianolide y beauvericinas, que actúan como inhibidoras de las reacciones de defensa del hospedero, destruyen la hemolinfa y núcleos de las células (Tanada y Kaya, 1993; Lecuona, 1996; Alves, 1998).

El consumo de alimento de los insectos tratados con la concentración de 105 conidias mL-1 de Beauveria (concentración equivalente al CL50) mostró una tendencia lineal decreciente para los cuatro aislamientos seleccionados (Figura 1). Esta disminución se hizo estadísticamente diferente (P £ 0,05), con respecto al testigo, al cabo de 10 días postinoculación. Luego de 35 días postinoculación, las diferencias entre el tratamiento testigo y aquellas inoculadas con Beauveria fueron en promedio 70% menos de consumo de alimento (Figura 1). El 50% de disminución en el consumo de alimento (TA50) se alcanzó aproximadamente a los 20 días de tratados los insectos, incluido el testigo, sin embargo, el consumo promedio al tiempo TA50 (CA50) fue notoriamente diferente entre el testigo y los insectos tratados con B. bassiana, los que disminuyeron en promedio 58% su consumo diario de alimento (Cuadro 2). El modelo de Weibull indicó que no existieron diferencias entre los aislamientos de B. bassiana, pero sí con el testigo, el cual fue el único tratamiento que no traslapó sus límites de confianza (95%). La disminución del consumo de alimento en el tratamiento testigo se debió, probablemente, al envejecimiento de los insectos ya que el testigo no presentó mortalidad durante el ensayo.

Figura 1. Consumo promedio de hojas de frambuesa (peso húmedo) a través del tiempo por adulto de Asynonychus cervinus tratado con 105 conidias mL-1 de Beauveria bassiana. Aislamientos (< ) Qu-B179, (▲) Qu-B299, (&uml; ) Qu-B314, (· ) Qu-B323 y ( ) testigo. Figure 1. Average fresh raspberry leaf consumption (fresh weight) over time per adult of Asynonychus cervinus treated with Beauveria bassiana (105 conidia mL-1). Isolates (< ) Qu-B179, (▲) Qu-B299, (¨ ) Qu-B314, (· ) Qu-B323 and ( ) control.

Cuadro 2. Tiempo para alcanzar el 50% de consumo de alimentos (TA50), consumo diario de alimento al tiempo TA50 (CA50) y límites de confianza para CA50 de Asynonychus cervinus tratados con diferentes aislamientos de Beauveria bassiana. Table 2. Time to reach 50% of food consumption (TA50), daily food consumption at TA50 time (CA50), and upper and lower confidence limits for the CA50 of Asynonychus cervinus treated with different Beauveria bassiana isolates.

El menor consumo de alimento pudo deberse al daño que causa Beauveria, tanto en el sistema circulatorio como en el digestivo. En el primero, Beauveria puede utilizar la hemolinfa como substrato, la que representa de 10 a 40% del peso de la mayoría de los insectos. En el sistema digestivo se producen problemas tales como regurgitación, diarreas y pérdida de apetito. Otro efecto se presenta en el sistema respiratorio, donde se obstruyen los espiráculos del insecto, lo que causa un aumento del consumo de energía para mantener la tasa de respiración (Alves, 1998).

Para evaluar el porcentaje de mortalidad a distintas concentraciones de inóculo, se utilizaron los resultados del día 35 postinoculación, debido a que fue el primer día que se alcanzó 95% de mortalidad con uno de los tratamientos (108 conidias mL-1 de Qu-B179). Los cuatro aislamientos estudiados mostraron una tendencia lineal respecto a la mortalidad, la cual fue directamente proporcional a la concentración de inóculo (Figura 2). Además, estos aislamientos no mostraron diferencias (P £ 0,05) entre ellos en cuanto a mortalidad inicial y tasas de mortalidad. El testigo no presentó mortalidad mientras duró el experimento.

Figura 2. Mortalidad de adultos de Asynonychus cervinus 35 días después de tratados con distintas concentraciones de Beauveria bassiana. Aislamientos (< ) Qu-B179, (▲) Qu-B299, (¨ ) Qu-B314 y (· ) Qu-B323. Figure 2. Mortality of Asynonychus cervinus adults 35 days after treatment with distinct concentrations of Beauveria bassiana. Isolates (< ) Qu-B179, (▲) Qu-B299, (¨ ) Qu-B314 and (· ) Qu-B323.

Utilizando las regresiones de la Figura 2, se obtuvieron como resultado valores promedios para la CL50 entre 1×104,8 y 1×105,2 conidias mL-1 para los cuatro aislamientos, en tanto la CL90 requirió entre 1×108,3 y 1×109,2 conidias mL-1 (Cuadro 3). El aislamiento Qu-B299 requirió la menor concentración de inóculo para eliminar 50% de la población tratada. Sin embargo, el análisis de las pendientes indicó que no existieron diferencias estadísticas entre los distintos aislamientos (Cuadro 3).

Cuadro 3. Pendiente de las regresiones de mortalidad por concentración, y concentraciones letales de cuatro aislamientos de Beauveria bassiana para matar el 50 (CL50) y 90% (CL90) de la población de Asynonychus cervinus. Table 3. Regression slope of mortality by concentration, and lethal concentration of four Beauveria bassiana isolates to kill 50 (CL50) and 90% (CL90) of Asynonychus cervinus population.

Los valores de pendientes corresponden a porcentaje de mortalidad por log (concentración). CL50 evaluado al día 35 postinoculación. Valores entre paréntesis indican intervalos de confianza de CL50 (P £ 0,05). NS: no significativo.

Todos los adultos muertos e incubados en cámara húmeda presentaron signos del hongo luego de 72 h, los que se manifestaron a través de un micelio blanco algodonoso emergido a través de la unión de los élitros. Transcurridos cinco días de muertos se observó esporulación a través de conidióforos que cubrieron totalmente la superficie corporal de cada insecto parasitado, los cuales fueron semejantes al de los aislamientos de Beauveria inoculados. Estos signos fueron similares a lo observado por otros autores y para diferentes hospederos (Vasicek et al., 1995; Alves, 1998).

En estudios similares realizados en condiciones de laboratorio con coleópteros (Vasicek et al., 1995), se encontró 92% de mortalidad de insectos tratados con B. bassiana en concentración de 2,3´ 106 conidias mL-1. Gerding et al. (2000) encontraron resultados similares con aislamientos chilenos de Metarhizium para el control de Otiorhynchus sulcatus (gorgojo de la frutilla), donde la CL50 fluctuó entre 6,5 y 7,9 conidias mL-1. Esta alta mortalidad observada en condiciones de laboratorio, no siempre es equivalente a la obtenida en condiciones de campo, donde la cantidad de inóculo que atrapa el insecto es menor; además influyeron las condiciones meteorológicas (Alves, 1998).

Los cuatro aislamientos fueron identificados como Beauveria bassiana, las dimensiones de sus conidias fluctuaron en promedio entre 2,32 y 2,42 m m de largo, y 2,00 a 2,20 m m de ancho, mientras que los conidióforos fueron simples, de base globosa, irregularmente agrupados en racimos, cuyas mediciones variaron entre 8,20 a 9,20 m m para la parte más ancha del conidióforo. La parte superior del conidióforo o raquis presentó forma de zig-zag, con un largo de 4,00 a 5,35 m m para los distintos aislamientos (Cuadro 4). Estas medidas junto con las características macroscópicas de las colonias, tales como crecimiento circular formando anillos concéntricos, la presencia de un micelio compacto, rastrero, de apariencia polvorienta y de color blanco a levemente rosado, fueron semejantes a las mencionadas en las claves de Samson et al. (1988), Humber (1996) y Barnett y Hunter (1998) para Beauveria bassiana.

Cuadro 4. Dimensiones promedios (m m) de conidias y conidióforos de los cuatro aislamientos seleccionados de Beauveria bassiana. Table 4. Average measurements (m m) of conidia and conidiophore of the four selected Beauveria bassiana isolates.

Cabe destacar que la temperatura de incubación en los ensayos fue de 18°C, obteniéndose altos porcentajes de mortalidad. Sin embargo, Alves (1998) señaló que la temperatura óptima para el crecimiento de Beauveria varía entre 23 y 28°C, lo que podría indicar que con temperaturas más altas que las del ensayo se podrían obtener diferentes resultados respecto a la CL50 y CL90, ya que se favorecería la germinación y crecimiento del hongo. Sin embargo, también es útil contar con aislamientos patogénicos a bajas temperaturas, lo que permitiría su uso en las condiciones más frías del sur de Chile.

Los resultados de este trabajo pueden ser de utilidad para implementar un sistema de control biológico de esta plaga, que ha venido adquiriendo mayor importancia en los cultivos y plantaciones frutales de la zona centro sur y sur de Chile. Sin embargo, nuevas pruebas deben ser realizadas en condiciones de campo para establecer concentraciones óptimas y las condiciones en las cuales pueden ser diseminados estos hongos benéficos.

CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas de inoculación, se puede concluir que los cuatro aislamientos de Beauveria utilizados fueron similares en su capacidad para disminuir el consumo de alimentos de adultos de Asynonychus cervinus. Comparados con insectos sin inocular, estos aislamientos lograron disminuir el consumo de brotes de frambuesa, en promedio, 30% a los 10 días y 70% a los 35 días postinoculación. Además, estas cuatro cepas produjeron mortalidad de los adultos a tasas de 10% a medida que se aumentó en forma logarítmica la concentración de inóculo, lográndose CL50 de 1×104,7 conidias mL-1 cuando se utilizó el aislamiento Qu-B299. Los cuatro aislamientos resultaron ser la especie Beauveria bassiana, de acuerdo a su morfometría y características de crecimiento.

LITERATURA CITADA

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Andrés France2, Marcos Gerding2 y Alicia Sandoval2 2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigaciones Quilamapu, Casilla 426, Chillán, Chile.