Cultivo de células aplicados a bioinsecticidas

En la actualidad el uso de tecnologías que sean amigables con el medio ambiente representan una alternativa importante para mitigar el daño ambiental, en esto es que el ser humano entra a ser una pieza fundamental en la implementación y desarrollo de dichas tecnologías.

Como es de saber muchas de las prácticas humanas degradan en cierta medida al medio ambiente, ejemplo claro de esto lo vemos reflejado en la agricultura, donde no solo se da un impacto a la diversidad si no que también se envenena con plaguicidas a el ambiente todo gracias a las malas practicas agrícolas que se acostumbran a utilizar.

Para esto se busca desarrollar técnicas donde se reemplacen dichos insecticidas químicos los cuales atacan tanto plagas como animales benéficos para las plantas (polinizadores), también acaban con la vida del suelo atacando baterías que se encuentran allí también, y que pueden de la misma forma causar graves daños en la salud de los humanos.

Por todo lo anteriormente mencionado se emplea el estudio y desarrollo de bioinsecticidas para reducir el impacto al entorno, buscando el control de plagas de forma biológica para lo cual existe una larga lista de especies de hongos y bacterias que controlan insectos plagas. Bacillus thuringiensis es el microorganismo más conocido y de más trayectoria en aplicaciones agrícolas, mientras que especies de hongos como Entomophthora virulenta y Verticillium lecanii pertenecen a un grupo de productos comerciales más recientes pero de rápido crecimiento en los mercados internacionales. Bacillus thuringiensis destaca por su alto grado de toxicidad para los insectos por lo cual sus llamados cry genes que codifican delta-endotoxinas se han introducido en diversas plantas genéticamente modificadas. Las nuevas generaciones de productos biológicos a base de hongos entomopatógenos infectan los insectos sin la necesidad de que sean ingeridos como en el caso de Bacillus thuringiensis.

Microorganismos entomopatógenos sorprenden a los insectos con nuevas toxinas y maneras de atacar y matarlos mientras que los insectos adquieren resistencias o demuestran cambios en el comportamiento para evadir la acción letal. El resultado de esta carrera evolutiva es una gran variedad de cepas de hongos y bacterias con propiedades de control muy específicas. 

Hasta la fecha solamente para Bacillus thuringiensis se han reportado casos de resistencia provocados por el uso de bioinsecticidas. Esta es una razón importante por la cual los microorganismos entomopatógenos constituyen una alternativa viable para los insecticidas químicos. Su uso está creciendo rápidamente dado que los bioinsecticidas no dañan al agricultor, consumidor o al medio ambiente.

A continuación se mostraran una serie de estudios realizados donde se utilizaron cepas de microorganismos entomopatógenos en distintas condiciones con el fin de medir su capacidad insecticida.

Cultivos de células en suspensión de Azadirachta indica para la producción de bioinsecticidas

A. indica (árbol del neem) es originario de las zonas áridas de India, Pakistán y África, donde se ha cultivado por miles de años. Su actividad bioinsecticida representa un interés particular para el control de insectos plaga, en este sentido la azadiractina (Aza) es reconocida como el compuesto activo más importante. Sin embargo, existen limitaciones agroclimáticas para su producción tradicional a partir de semillas, por lo que su producción a partir de cultivos de células vegetales in vitro surge como una alternativa promisoria. En el presente documento se presenta una revisión de los usos del árbol del neem, los metabolitos secundarios que produce y del estado que guarda el conocimiento sobre el cultivo de las células de A. indica. Además se identifican las estrategias usadas para mejorar el crecimiento y la producción de Aza.

Las sustancias producidas por el neem afectan algunos ostráceos y entre 400 y 500 especies de diferentes órdenes de insectos, entre los cuales se incluyen Blattodea, Caelifers, Dermaptera, Diptera, Ensifera, Hetroptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Phasmida, Phthiraptera, Siphonoptera y Thysanoptera. Estas sustancias tienen un efecto repelente, antialimentario e insecticida sobre especies herbívoras, el modo de acción es dependiente de la dosis y de la especie.

A. indica produce más de 300 metabolitos secundarios, un tercio de los cuales son tetranortriterpenoides (limonoides) de interés comercial y científico por sus efectos biológicos. Muchas de sus aplicaciones se basan en el conocimiento empírico, es decir, se realizan sin identificar los ingredientes activos, tal como se presentó en la sección anterior.

Actualmente existen más de 300 patentes relacionadas con A. indica.

La Aza es uno de los metabolitos principales utilizado especialmente para el control de insectos. Además de la Aza, se reporta que el meliantrol y el salanin hacen que los insectos dejen de alimentarse. El nimbin y nimbidin poseen actividad antiviral. El deactilazadiractinol, se encuentra en menor concentración, funciona como antihormona y paraliza el sistema digestivo del insecto. El 3-deacetilsalanin y el salanol, están relacionados químicamente con el salanin y también son antialimentarios.

La Aza es efectiva contra cerca de 200 especies de insectos, no afecta a los mamíferos o a los animales que consumen estos insectos, ni tampoco a los insectos útiles para la polinización o que son benéficos para la planta.

En este trabajo, se presenta el estado del conocimiento del desarrollo del cultivo de células de A. indica y se analizan las estrategias usadas para mejorar el crecimiento y la producción de Aza. Se destacan los estudios del uso de agentes permeabilizantes de la membrana celular para liberar la Aza intracelular, la adición de precursores biosintéticos, los efectos del régimen de luz, la temperatura y la formulación de medios. A nivel de biorreactores, el tanque agitado se destaca como la configuración más reportada y los estudios abordan la evaluación de impulsores y la posibilidad de operación en un régimen por lote alimentado. Las productividades calculadas de los reportes, muestran una transferencia de los cultivos de matraces a biorreactor satisfactoria tecnológicamente y permiten vislumbrar el escalamiento futuro de los cultivos de células de A. indica para la producción de un bioinsecticida.

El uso de agua de mar como fuente de sales en los medios de cultivo a base almidón de soja y frijol, para la producción de bioinsecticidas Bacillus thuringiensis

Con el fin de reducir el costo de producción de Bacillus thuringiensis bioinsecticida, un nuevo medio único compuesto de almidón, soja y agua de mar diluida, sobre todo proporcionando 7,5 g / l de NaCl, se ha optimizado. Los resultados obtenidos con los cultivos realizados en 1000 matraces agitados ml mostraron un 7% de mejora de la producción de delta-endotoxina en el medio barato, en comparación con la que contiene una mezcla de minerales puros en lugar de agua de mar. Curiosamente, este nuevo medio formulado ha demostrado ser eficiente para la producción de delta-endotoxina por varias cepas de B. thuringiensis mostrando las diversas actividades larvicida hacia dípteros o lepidópteros. Por otra parte, el uso de tal medio para la producción a gran escala de bioinsecticidas se evidenció también en un sistema automatizado completo fermentador controlado. Para lo que se demostró que el agua de mar no afecta tales requisitos y tienen un efecto positivo sobre el crecimiento, la esporulación y la síntesis de la delta-endotoxina. Esto debería contribuir a una reducción significativa de la costo de B. thuringiensis bioinsecticida producción y utilización.

Se demostró que esta cepa podría crecer fácilmente en grandes amplia gama de sustratos, gracias a sus enzimas hidrolíticas propias. Por lo tanto, para formular nuevas bioinsecticidas de producción barata los medios de cultivo que podrían ser utilizados en todo el mundo, la glucosa y la papilla es eficiente sustituido por el almidón de la calidad comercial en el medio complejo previamente optimizado. Por otra parte, el pescado fue sustituido por la soja que tiene origen vegetal. En cada concentración de almidón, se debe tomar en cuenta el mejor equilibrio entre la producción delta-endotoxina y el rendimiento de la síntesis de la toxina en relación con las células en esporulación. De hecho, con altas concentraciones de soja, en relación con el rendimiento de la síntesis de la toxina se redujo debido a la alta producción de biomasa. La principal limitación de la producción de bioinsecticida que es la regulación represiva de síntesis delta-endotoxina, causada por una mayor concentración de fuentes de carbono, fue significativamente menor expuesto en base de almidón medio que en la glucosa o de los medios de comunicación basada en papilla. Esta es, probablemente, debido a las diferencias en las tasas de asimilación de almidón por la creciente de células. Por otro lado, el agua de mar que contiene la mayoría de los minerales (NaCl, MgSO4, MnSO4, FeSO4, etc), sumado a B. thuringiensis producción de bioinsecticida-medios de cultivo, sustituido perfectamente la oferta individual de todos los minerales en el medio de cultivo. Curiosamente, con el uso de agua de mar actividad proteolítica producida concomitantemente con delta-endotoxina, se reduce considerablemente. Esto mejoraría la calidad de bioinsecticidas, ya que las proteasas pueden afectar la estabilidad de las proteínas de cristal de insecticidas.

Caracterización molecular de una cepa Colombiana de Bacillus thuringiensis con actividad frente a Tecia solanivora (Lepidoptera: Gelechiidae)

La polilla guatemalteca de patata (Tecia solanivora)(Lepidoptera: Gelechiidae), fue descrito por primera vez en América Central y es el agente entomológico mas importante de plagas que afectan a la papa (Solanum tuberosum) en América Central y el norte de América del Sur. El ataque de sus larvas a los tubérculos, tanto en el campo y en el almacenamiento causa perdidas que van desde 50 a 100%.

El control de plagas se hace generalmente por el uso intensivo de productos químicos insecticidas, lo que puede generar resistencia a los insectos y causar problemas asociados con el medio ambiente.

Bacillus thuringiensis, es una alternativa útil y un enfoque complementario en aplicaciones de plaguicidas químicos en la agricultura comercial.

Durante la esporulación, las células de B. thuringiensis producen inclusiones cristalinas herbáceas proteina-integrado por d-endotoxinas (llamados cristales de proteína o proteínas Cry), que específicamente matan las larvas de insectos. Cuando los insectos ingieren los cristales proteicos, el pH alcalino de su tracto digestivo activa la toxina Cry, la cual se inserta en el epitelio del intestino del insecto, provocando poros en el epitelio. El poro causa una lisis celular y la posterior muerte del insecto.

Cada tipo de toxina Cry tiene un único espectro de actividad y se centra sólo en una pequeña gama de especies de insectos. Dentro de este rango pequeño de hospederos blanco, hay grandes diferencias en la potencia entre las especies que suelen estar estrechamente relacionados.

Con el fin de tener las mejores proteínas Cry para el control de insectos y para prevenir o reducir la aparición de resistencia de insectos a las actuales d-endotoxinas disponibles, es importante identificar nuevas cepas de B. thuringiensis que contienen proteínas Cry con alta toxicidad frente a T. solanivora. Aunque, se ha informado que la toxina Cry1Ac de B. thuringiensis subsp. kurstaki es activo frente a este insecto, no se sabe que proteína tóxica que es la más específica y cual presenta mejor actividad frente a T. solanivora.

En este estudio se reporta la identificación de un nativo de B.thuringiensis cepa aislada en Colombia, con actividad tóxica alta contra T. solanivora. La cepa se caracterizó por secuenciación de los genes y la inmunolocalización de la las proteínas Cry en el insecto estado infectado. La disponibilidad de esta cepa y los genes proporciona nuevas alternativas para el control de este insecto y su uso como agentes de control de otras plagas.

Para esto se toman once cepas de B. thuringiensis aisladas en Colombia, con genotipos conocidos anteriormente. El serotipo de B. thuringiensis kurstaki cepa HD-1 se utilizó como control positivo. Las cepas fueron suministradas por la Unidad de Biotecnología y Control Biológico de la CIB. Las cepas fueron cultivadas en medio M1 a 30 º C durante 48 h. Para solubilizar el protoxinas esta cultura se centrifuga a 6000 rpm en una centrífuga Sorvall-Kendro, durante 10 minutos, el precipitado se resuspendió en 50 mM de NaOH, 10 mM EDTA y se incuba a 30 º C durante 2 h. Esta solución se centrifugó a 6000 rpm durante 15 min a 4º C y el sobrenadante se recogió. La concentraciónde proteínas totales de la protoxinas solubilizadas se determinó por ensayo de Bradford usando albúmina de suero bovino como estándar.

Entre los más importante de este trabajo se destaca la presencia de dos genes de codificación nativa para Cry1Ac24 y proteínas Cry2Aa13 que se han aislado y caracterizado de la cepa de B. thuringiensis con elevada actividad frente a uno de los más importantes plagas de papa en el norte de América del Sur (T. solanivora). Algunos cambios en los aminoácidos podrían ser responsables de la elevada actividad frente a T. solanivora. El aislamiento y la secuencia análisis de estos genes representan un nuevo hallazgo para aumentar el desarrollo del uso de proteínas Cry en insecticidas biológicos. Este nuevo aislamiento de B.thuringiensis en el futuro será esencial para de encontrar alternativas óptimas para el control de este insecto, disminuyendo así los problemas asociados con los insecticidas químicos.

Establecimiento de cultivo in vitro de Ipomoea intrapilosa y evaluación de su actividad insecticida contra Trialeurodes vaporariorum (Homóptera, Aleyrodidae)

Trialeurodes vaporariorum, conocida vulgarmente como mosca blanca o mosca blanca de los invernaderos, es una especie de insecto  que habita en las regiones cálidas. Puede llegar a convertirse en una plaga en muchos cultivos agrícolas de frutas, hortalizas y plantas ornamentales, se encuentra frecuentemente en invernaderos y en otras estructuras agrarias de protección de los cultivos. 

Los extractos de semillas de Ipomoea intrapilosa presentan actividad insecticida contra insectos plaga de importancia en la agricultura. Como una alternativa biotecnológica, en este trabajo se estableció el cultivo de callos y células en suspensión de l. intrapilosa y se evaluó la actividad insecticida de los extractos orgánicos obtenidos de semilla y de los cultivos in vitro contra mosquita blanca de los invernaderos Trialeurodes vaporariorum (Homóptera, Aleyrodidae).

El cultivo de callos se inició a partir de explantes de hipocotilos y fue inducido en medio Murashige y Skoog suplementado con ácido ocnaftalenacético (ANA, 13.57 IJM) Y sacarosa (30 9 L-1), bajo fotoperiodo de 16 h (iluminación de 32 W/m2) y a 25ºC. El cultivo de células en suspensión se inició a partir de la transferencia de tejido calloso a matraces, utilizando la misma composición del medio de cultivo, a 25ºC en agitación orbital (100 rpm), bajo iluminación constante (32 W/m2). Se realizaron cinéticas de crecimiento de los callos y de los cultivos en suspensión; para los callos, se determinó que alcanzan la fase estacionaria a los 37 días y tienen un índice de crecimiento de 7.21; en tanto que las células en suspensión requieren solamente 15 d, pero presentan índice de crecimiento 6 veces menores. En los cultivos en suspensión se evaluaron concentraciones de 60 y 150 9 PF L-1• Al final, tanto índice de crecimiento como la velocidad de crecimiento fueron superiores cuando el inóculo fue de 60 9 PF L-1. Se caracterizó el tamaño de las células individuales y de los agregados celulares obteniéndose un valor de la mediana de 0.014 y 0.016mm2 respectivamente.

Respecto a las pruebas de toxicidad de los extractos, se observó que la mayor mortalidad de T. vaporariorum se presenta con los extractos hexánicos y clorofórmicos de las semillas (72 y 70% respectivamente). Además, los cultivos in vitro mantienen la actividad insecticida registrándose el efecto más alto con los extractos metanólicos de los callos (68%). Particularmente, resulta importante que los tres extractos evaluados de las células en suspensión, mantuvieran un nivel de mortalidad alrededor del 40%.

Establecimiento de cultivos in vitro de Ipomoea intrapilosa en luz y oscuridad para la producción de sustancias con actividad insecticida contra Spodoptera frugiperda, (Lepidóptera, Noctuidae), plaga de interés agrícola

En el presente trabajo se reporta el efecto insecticida de los extractos hexánicos, clorofórmicos y metanólicos obtenidos de callos, generados a partir de explantes de hipocotilo de Ipomoea intrapilosa, sobre larvas neonatas de Spodoptera frugiperda (plaga de interés agrícola). A partir de plántulas asépticas provenientes de semillas se obtuvieron los callos en medio MS adicionado con ANA 13.57 + cinetina 1.1 &µM y ANA 18.09 &µM, en condiciones de luz y oscuridad constante. En condiciones de luz constante se obtuvieron callos de consistencia compacta, mientras que los callos mantenidos en oscuridad fueron blancos y de consistencia friable. Con relación a los extractos, para callos obtenidos en luz y oscuridad constantes, se encontró que la concentración de los sólidos totales fue mayor en los metanólicos; sin embargo, los hexánicos y clorofórmicos fueron los que mostraron mayor actividad insecticida. En los callos compactos, crecidos en luz constante, se observaron células parenquimatosas isodiamétricas, sin espacios celulares, elementos traqueales en formación, restos de haces vasculares del explante original y segmentos de pared secundaria. En el caso de los callos friables crecidos en condiciones de oscuridad, se observaron de manera similar células parenquimáticas, pero con abundantes espacios intercelulares y con incipiente crecimiento de elementos traqueales. Se concluye de manera general, que la actividad bioinsecticida que presenta I. intrapilosa se mantuvo en los callos obtenidos in vitro, bajo condiciones de luz y oscuridad. No hubo diferencias notables en la estructura general de los tejidos, la morfología celular permitió reconocer que no hubo una rediferenciación clara de las células, aunque con ANA 13.57 &µM se observaron elementos traqueales de novo.

Perspectivas para alterar rango de hospederos de baculovirus

Bioinsecticidas desarrollados a partir de los patógenos de insectos específicos son alternativas prometedoras a los insecticidas químicos, pero actualmente sólo representan una pequeña parte del plaguicida del mercado. Entre los más utilizados son insectos específicos las toxinas de Bacillus turingiensis (Bt), pero cada vez hay más interés en insecticidas baculovirus. Una de las principales ventajas de bioinsecticidas es su especificidad de huésped. Por el contrario a los insecticidas convencionales que puedan dañar los vertebrados o matar indiscriminadamente a los artrópodos, que objetivo específico poblaciones de plagas de insectos. Esta característica los hace compatible con el clásico control biológico en la gestión integrada estrategias de manejo de plagas y los hace particularmente útil para controlar las plagas de insectos en zonas sensibles áreas. A pesar de bioinsecticidas son atractivos desde una perspectiva ambiental, paradójicamente, su limitada especificidad de huésped hace menos atractiva económicamente.

Debido a los diferentes productos pueden ser necesarios para controlar complejos de plagas de insectos, los costos para los productores se aumento. Este problema podría ser aliviado mediante el desarrollo de bioinsecticidas que el objetivo específico complejos de plagas. La gama de huéspedes de los virus es determinada por su capacidad para entrar en las células y los tejidos de un organismo huésped, se replican y den la liberación de nuevas partículas de virus infeccioso.

Los baculovirus son un excelente recurso para el desarrollo bioplaguicidas altamente específica. Se han realizado progresos considerables para mejorar sus propiedades insecticidas. Su velocidad de muerte ha aumentado considerablemente, aunque son necesarias más odifiaiones. Adicionalmente la tarea es elaborar insecticidas baculovirus específicos para especies de plagas. Varios genes han sido identificados en su especificidad de huéspedes.

Otro paso fundamental en este esfuerzo fue la identificación de genes esenciales necesarios para la expresión génica tardía y la replicación del ADN baculovirus. La determinación de las funciones de estos factores y sus interacciones con los componentes celulares para apoyar la replicación del virus proporcionará el marco para la comprensión de especificidad de acogida del baculovirus. La capacidad de baculovirus para superar las defensas del huésped es también un factor importante de la amplia acogida como lo demuestran las funciones de la apoptosis supresores. El desarme de las defensas de insectos, tanto en el celular y los niveles de organismos puede proporcionar un medio para modificar rango de hospederos del baculovirus.

Para lograr su considerable potencial como bioinsecticidas, es necesario, por lo menos no la reducción de los costos de producción.

También es una necesidad aislar y estudiar las especies de baculovirus con la especificidad de diferente hospedador para su uso del desarrollo como cepa insecticida y como un recurso adicional para estudios de rango de hospederos del baculovirus y patogenia.

Crecimiento, metabolismo y producción de baculovirus en cultivos en suspensión de una línea celular del insecto lepidóptero Anticarsia gemmatalis

Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera: Noctuidae) es una de las principales plagas defoliadoras de los cultivos de soja en Latinoamérica. Este insecto es efectivamente controlado con un baculovirus, el virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV). Actualmente, la producción comercial de AgMNPV está basada en la propagación viral in vivo sobre larvas del insecto. Esta tecnología ha demostrado ser robusta y económicamente competitiva como para satisfacer los requerimientos de este bioinsecticida hasta el presente. Sin embargo, previsiones de una creciente demanda, y la posibilidad de introducir baculovirus genéticamente modificados que no se propaguen eficientemente en larvas, han estimulado el interés por desarrollar procesos alternativos de producción basados en la propagación viral in vitro en cultivos de células de insecto. Una característica relevante de estos procesos es que su rendimiento económico mejora a medida que aumenta en escala, haciéndolos atractivos para la producción industrial de baculovirus. Además, un mejor control de proceso y una calidad superior del producto son atractivos adicionales de los procesos de producción de baculovirus en cultivos celulares.

La selección de una línea celular susceptible a la infección viral y capaz de producir elevados rendimientos volumétricos de poliedros, el fenotipo viral con propiedades insecticidas, es el primer requisito para desarrollar un proceso factible para la producción de un baculovirus insecticida en cultivos de células de insecto. La replicación de AgMNPV ha sido evaluada en diferentes líneas celulares. Del análisis de esta información parece evidente que la línea celular homóloga UFL-AG-286 exhibe una mayor susceptibilidad a la infección y mayores niveles de producción viral que el resto de las líneas celulares evaluadas. Por lo tanto, la línea celular UFL-AG-286 podría constituir un sustrato promisorio para desarrollar un proceso industrial de producción de

AgMNPV in vitro.

Con el objetivo de caracterizar las propiedades tecnológicas de esta línea celular, y evaluar la factibilidad de su uso para la producción industrial de AgMNPV, las células UFL-AG-286 fueron adaptadas al cultivo en suspensión agitada. En medio TC-100 suplementado con 10% de suero fetal bovino, los cultivos adaptados crecieron con un tiempo de duplicación de 28,9 horas, y alcanzaron una densidad celular máxima de 3,70 x 106 células.ml-1. La glucosa del medio de cultivo fue consumida casi totalmente, pero sin producción de lactato. Los aminoácidos, con la excepción de glutamina, asparagina, metionina y leucina, fueron consumidos en una muy baja proporción respecto a sus respectivas concentraciones iniciales en el medio de cultivo, o bien incrementaron su concentración.

Por otro lado, las células UFL-AG-286 parecen no producir alanina como una vía metabólica para la eliminación de amonio, que se acumula en el sobrenadante de cultivo. La infección sincrónica de los cultivos en suspensión de UFL-AG-286 con AgMNPV durante la fase de crecimiento temprano, que generó altos rendimientos específicos de las dos progenies virales (virus brotados y poliedros), redujo las demandas nutricionales celulares específicas con respecto a los cultivos no infectados.

Se logro en entrar que la línea celular UFL-AG-286 pudo ser adaptada al cultivo en suspensión a través de la selección de una subpoblación de células con capacidad para proliferar sin formar agrupaciones (saUFL-AG-286). Los cultivos adaptados crecieron con una cinética similar a otras líneas de células de insecto, pero exhibieron un perfil nutricional y metabólico característico.

Los rendimientos de AgMNPV en los cultivos de saUFL-AG-286 resultaron suficientemente elevados como para sostener la factibilidad del uso de esta línea celular en el desarrollo de un proceso industrial de producción del bioinsecticida. El desarrollo de este proceso sólo será posible luego de optimizar la producción viral en un medio de cultivo libre de suero de bajo costo.

Actividad Bioinsecticida de conidios y micelio secos en la preparación de dos cepas de Beauveria bassiana contra el barrenador de caña de azúcar Diatraea saccharalis

Beauveria bassiana es un hongo ampliamente distribuido en la naturaleza, cuyo potencial para controlar más de 70 plagas de insectos aumentó considerablemente su interés en la producción a gran escala para la aplicación en el campo. Por otra parte, este hongo también parece ser inocuo para la mayoría de los organismos no objetivo. La producción en masa de hongos patógenos de insectos es una requisito previo necesario para cualquier campo a gran escala aplicación de estos hongos. Sin embargo, muy poco información está disponible en la biotecnología de hongos entomopatógenos y su producción industrial sigue siendo relativamente poco sofisticada.

Está bien documentado que hay muchas alternativas para producir hongos entomopatógenos. La técnica más común y tradicional implica ya sea un estado sólido de bioprocesamiento o una etapa de cultivo. En este último caso, el hongo es crecido en un cultivo líquido y luego se deja esporular como un cultivo de la superficie en calma-líquidos o medio semisólido. Aunque muchos trabajos de investigación sugieren que el cultivo sumergido es el preferido, hongos imperfectos no producen conidios en estas condiciones, a pesar de que crecen mucho y producen micelio y blastoesporas en abundancia. Una nueva alternativa que se han desarrollado recientemente considera la posibilidad de producción de micelio seco, que es fácil y rápida producidos en serie y sigue siendo viables cuando son correctamente seca.

El objetivo de este trabajo fue evaluar el desempeño de dos aislamientos de B. bassiana para el control del barrenador de la caña de D. saccharalis. La importancia económica de este insecto plaga en

Argentina se centra en las importantes pérdidas que produce fundamentalmente a los cultivos de maíz. Dos diferentes tipos de medios de cultivo SSC y SBC fueron utilizados, y sus actividades bioinsecticidas se compararon a nivel de laboratorio.

Dos cepas de Beauveria bassiana (cepas Bb1 y Bb5) se cultivaron en estado sólido y en las cultivos sumergidas (SSC y SBC, respectivamente) con el fin de obtener preparaciones de conidios y micelios secos. Las muestras obtenidas en el laboratorio fueron probados como alternativas para una nueva utilización de micoinsecticides para controlar el barrenador de la caña de azúcar Diatraea saccharalis. Los rendimientos de esporas obtenidas en SSC indicó que la cepa Bb5 fue capaz de producir alrededor de tres veces más conidios por gramo de materia seca inicial (3.7 1010) que la cepa Bb1 (1.3 1010) en un medio sólido compuesto de salvado de trigo y salvado de la cáscara. En estas condiciones la cultivo, los primeros mostraron no sólo los rendimientos satisfactorios de esporas, si no también una mayor actividad bioinsecticida que el segundo. Laboratorio de bioensayos realizados con conidios de ambas cepas contra las larvas de D. saccharalis indicó que la cepa Bb5 promueve una mortalidad de insectos de 82,5% mientras que sólo el 21,3% de mortalidad se observó con la cepa Bb1. En cuanto a las muestras obtenidas en el SBC, en el que fue empleado un medio de cultivo a base de glucosa y extracto de levadura, es interesante señalar que, aunque las dos cepas mostraron comportamientos similares con un rendimiento de aproximadamente 1,50 *1010 conidios por gramo de micelio seco, no lo fue en su actividad bioinsecticida. A pesar de rendimientos satisfactorios, la actividad de las cepas bioinsecticidas BB1 y Bb5 fue disminuyendo drásticamente mostrando una mortalidad de larvas por debajo del 2%.

Mejora de la Producción de bioinsecticidas en cepas de Bacillus thuringiensis en respuesta a las tensiones en varios medios de bajo costo

El uso de bioinsecticidas, especialmente los producidos por sporeless cepas de Bacillus thuringiensis, ha demostrado ser una buena alternativa en el manejo de plagas. Dos tipos de mutantes sporeless se distinguen. Los mutantes asporogenicos que carecen por completo de esporas producen una inclusión regular de cristales bipiramidales. Los mutantes oligosporogenicos mantiene la capacidad de producir cristales de proteínas insecticidas. Sin embargo, la esporulación de los mutantes no era totalmente bloqueado y muy pocos de ellos aún podría producir esporas. Con el fin de mejorar la producción de bioinsecticidas, fue investigada la adaptación de las cepas sporeless al choque térmico y el estrés osmótico. Producción del delta-endotoxina en un 78% de los mutantes sporeless se ha mejorado significativamente por el estrés osmótico con una sobreproducción de alrededor del 17%, en comparación con el BNS3 cepa salvaje. Sin embargo, la producción de la toxina fue mejorada por sólo el 21% de los mutantes después de choque térmico, en un medio de bajo costo. El análisis estadístico demostró que la producción de delta-endotoxina, el crecimiento celular y formación de la espora de mutantes asporogenica y oligosporogenica dependía del tipo de tensión aplicada. Cada cepa tiene un potencial importante a la hora de aplicar la tensión adecuada. Por otra parte, la adaptación de los mutantes sporeless a NaCl puede permitir la sustitución de todos los minerales del medio por el agua de mar diluida que parecía ser una buena alternativa para la producción económica de bioinsecticidas a escala industrial, que es de gran importancia desde el punto de vista práctico.

Caracterización novel de Bacillus thuringiensis fenotipo posesión de varios apéndices adjuntos a un cuerpo parasporal

Bacillus thuringiensis es una bacteria conocida por su producción de cuerpos cristal compuesto por una o más proteínas Cry, que pueden ser tóxicos para los insectos, nematodos o las células cancerosas. A pesar de las cepas de B. thuringiensis Ocasionalmente se han observado con apéndices filamentosos unidos a sus esporas, los apéndices, en asociación con sus cuerpos parasporal son extremadamente raros. Este artículo se presenta la caracterización de Bt1-88, una cepa bacteriana aislada del Caribe, que produce un complejo espora-cristal que contiene seis apéndices de largo, cada una compuesta por numerosos filamentos más delgado de aproximadamente 10 nm de diámetro y 2,5 micras de longitud. Cada uno de los apéndices de múltiples filamentos se adjuntó a un solo cuerpo, pequeñas parasporal situado en un extremo de la espora bacteriana. Pruebas bioquímicas, la secuencia del gen 16S ADNr, y la identificación de dos proteínas Cry de la secuencia parcial de proteína (supuestamente Cry1A y Cry2A), identificado inequívocamente Bt1-88 como una cepa de B. thuringiensis. BT1-88 representa la segunda cepa de B. thuringiensis informó que posee un cuerpo parasporal fenotipo apéndice se caracteriza por uno o varios apéndices de largo, compuesta por numerosos filamentos en asociación con un organismo parasporal. Este hallazgo sugiere que Bt1-88 es un miembro de una nueva clase fenotípica de B.thuringiensis, en los que el cuerpo parasporal puede desempeñar un papel estructural a través de su asociación con dispositivos multi-filamento.

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Autor:

Jhon Jairo Ortiz R.