Evaluación de la técnica más apropiada para la diferenciación

INTRODUCCIÓN

La amibiasis es una enfermedad que se presenta en el 10% de la población mundial aproximadamente. Esta se produce por la presencia de Entamoeba histolytica, la cual es idéntica morfológicamente a Entamoeba dispar (no patógena). La amibiasis invasora resulta en aproximadamente 50 millones de casos y hasta 100.000 muertes por año. Por esta razón es importante realizar una revisión bibliográfica acerca del protozoo causante de esta enfermedad y las técnicas empleadas para diferenciar estas dos especies.

Actualmente se están empleando técnicas moleculares para estudiar la ecología de una gran variedad de organismos.

Estas técnicas representan las herramientas importantes para el estudio de la sistemática, genética de la población, biogeografía y ecología de parásitos con la capacidad de identificar los organismos de interés con precisión. Además, se utiliza para el diagnóstico eficaz y detección de parásitos y las enfermedades parasitarias. En el caso de la diferenciación entre especies, necesario para el diagnostico de la amibiasis ha sido importante la aplicación de técnicas de PCR, ELISA, ISOENZIMAS, para la diferenciación entre E. dispar y E. histolytica.

ANTECEDENTES HISTORICOS

En 1875, Entamoeba histolytica, fue reconocida por Losch en un paciente con disentería, sin establecer la relación causa-efecto entre la amiba y los síntomas del paciente. (Chac Bonilla, 2001).
En 1887, Kartulis demostró por primera vez su papel como patógeno.
En 1903, Schaudinn introduce el nombre de la especie.
En 1925, Emilé Brumpt propuso el concepto de que E. histolytica comprendía dos especies morfológicamente idénticas, una no parásita (denominada E. dispar) y otra parásita responsable de la amibiasis invasiva (E. dysenteriae) por lo cual era posible la existencia de portadores asintomáticos. Sin embargo, este concepto no fue ampliamente aceptado. (Chac Bonilla, 2001).
En 1961 Hoare afirmó la existencia de dos tipos diferentes de amiba histolítica: "Es seguro que al lado de las cepas activamente patógenas, en los países cálidos, existen en todas las regiones del globo, cepas constantemente avirulentas que son totalmente inofensivas para el hombre en regiones templadas." (Chac Bonilla, 2001).
En 1978, Sargeaunt empezó a analizar el patrón electroforético de las isoenzimas de la hexoquinasa de E. histolytica, estableciendo su gran valor para el estudio de la relación hospedador-parásito. Logró determinar dos tipos de patrones electroforéticos, los cuales denominó: zimodemos parásitos" y "zimodemos no parásitos". (Chac Bonilla, 2001).
En 1982 postula (dado los hallazgos encontrados durante su investigación) que en la amibiasis estaban involucradas dos especies, una parásita y otra no parásita, y que la propuesta de Brumpt debía ser aceptada. (Chac Bonilla, 2001).
Los estudios de Sargeaunt, junto con otros que se realizaron en la época, permitieron llegar a la conclusión de que la amiba clínicamente conocida como E. histolytica en realidad comprende dos especies morfológicamente idénticas: E. histolytica responsable de la enfermedad y E. dispar que es un comensal intestinal. (Chac Bonilla, 2001).
Estudios genéticos recientes han demostrado una divergencia genética entre las dos amibas, hallazgo que constituye una evidencia irrefutable de la existencia de dos especies diferenciables por métodos bioquímicos, inmunológicos y genéticos. Esta redefinición de la clínica E. histolytica revoluciona el conocimiento que se tenía de la relación hospedador-parásito. (Chac Bonilla, 2001).

2. CARACTERIZACION DE Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar

La Entamoeba histolytica es uno de los eucariotes más primitivos, clasificado de la siguiente

Las Entamoebas se caracterizan por presentar cariosoma compacto, pequeño y cromatina distribuida por la parte interna de la membrana nuclear.. La especie histolytica se reconoce por tener el cariosoma en el centro del núcleo y la cromatina en gránulos de tamaño uniforme y regularmente dispuestos (Chac Bonilla, 2001). Morfológicamente, las Entamoebas se definen como microorganismos unicelulares que pueden existir en dos formas: trofozoito y quiste.

Trofozoito

Forma móvil del parásito, que ejerce la acción patógena. Es un anaerobio facultativo de 10-40m m de diámetro, que emite un pseudópodo y puede detectarse en las deposiciones recién emitidas (Chac Bonilla, 2001). Es extraordinariamente pleomórfico, ya que su aspecto y movilidad están muy influidos por los cambios de pH, potencial redox y osmolaridad. Se multiplica por fisión binaria y es muy sensible al jugo gástrico y a los agentes externos. Su hábitat comprende la luz y pared del colón, y especialmente sigma y recto. El trofozoito se nutre por fagocitosis y digestión intracelular de nutrientes a expensas de los tejidos disueltos y hematíes, y se ayuda de los pseudópodos. (Pumarola.; Rodríguez Torres; Garcia Rodríguez; Piedrola Angulo,1987)

Las formas mas pequeñas corresponden a las <<no invasivas>> y se encuentran habitualmente en los casos asintomático . Las de mayor tamaño son las <<formas invasivas>> que a diferencia de los anteriores no aparecen en la luz intestinal y poseen en el endoplasma restos celulares y hematíes. (Pumarola, et al.,1987)

La pared periférica del trofozoito, el ectoplasma, es hialino y retráctil. Los pseudópodos son prolongaciones del ectoplasma y proporcionan una movilidad a parásito de aproximadamente 50 um/seg. Carece de algunos organelos que se encuentran en la mayoría de los eucariontes como son: citoesqueleto estructurado, microtúbulos citoplasmáticos, mitocondrias y sistema de lisosomas primarios y secundarios (La Entamoeba histolytica y la Amibiasis, ). El núcleo, que sólo es visible con tinciones, es excéntrico, redondo y posee un pequeño cariosoma central. La cromatina aparece repartida periféricamente de forma uniforme y adosada a la membrana nuclear, y contiene un pequeño cariosoma central puntiforme.

Fig. 1. A. Dibujo perfecto de un trofozoito B. Dibujo del quiste de E. histolytica (Fuente: Intestinal Protozoa, 2005)

Quiste

Los quistes son formas redondas o ligeramente ovaladas de 8 a 20m m de diámetro, las cuales, en muestras sin teñir, se pueden ver como cuerpos hialinos con pared refringente. Su citoplasma es incoloro permitiendo la visualización de los llamados cuerpos cromatoides (que contienen principalmente ácidos nucleicos y fosfatos) y nucléolos en número de uno a cuatro. Posee una pared de 0.6 um y es resistente al jugo gástrico, factores ambientales externos, y cifras habituales de cloro del agua. (La Entamoeba histolytica y la Amibiasis ).

Los quistes jóvenes poseen 1 o 2 núcleos, algunos cuerpos cromatínicos y vacuolas de glucógeno. Cuando el quiste madura, posee cuatro núcleos y desaparecen los cuerpos cromatínicos . Solo los quiste maduros son infecciosos . (Pumarola, et al.,1987)

Los quistes son una forma de resistencia de la E. histolytica, ya que pueden sobrevivir fuera del huésped por semanas o meses en un ambiente húmedo. Es sumamente resistente a las condiciones del medio y a los jugos del tubo digestivo. (La Amibiasis, 2005)

2.1 CARACTERISTICAS BIOLÓGICAS QUE DISTINGUEN E. histolytica de E. dispar (Ackers ,2002).

Patrones de isoenzimas, particularmente la hexocinasa.
Epitopos específicos, reconocidos por la reacción con varios anticuerpos monoclonales.
Diferentes secuencias en el rDNA del episoma.
Diferencias significativas en las secuencias entre genes homólogos (2-18%).
Un número pequeño de genes, por ejemplo ariel (Willhoeft et al 1999 citado por Ackers, 2002) y cp5 (Bruchhaus et al 1996; Willhoeft et al 1999 citados por Ackers, 2002) aparecen mas lejos en E. histolytica.
Ha sido mas fácil adaptar E. histolytica al crecimiento axénico. Los cultivos axénicos de E. dispar son extremadamente difíciles y solo se ha logrado una cepa (Clark 1995, citado por Ackers, 2002).
Al realizar una examinación con el microscopio electrónico de los cultivos axénicos de ambas especies se aprecian diferencias significativas en la superficie (Clark et al 2000, citado por Ackers, 2002). Esto puede relacionarse a la evidente carencia superficial de lipofosfoglicano (LPG) de E. dispar.(Bhattacharya et al 2000, citado por Ackers, 2002).

CICLO DE VIDA

El ciclo de vida es relativamente sencillo. La infección se inicia con la ingesta de quistes provenientes de agua o alimentos contaminados con materia fecal. En el intestino delgado ocurre la llamada exquistación, que consiste en liberación de una amiba de 4 núcleos, metaquiste que finalmente se divide en 8 trofozoitos.

Los trofozoitos se dirigen al intestino grueso, donde alcanzan el colón , lo colonizan, ahí se alimentan de bacterias y restos celulares (La Entamoeba histolytica y la Amibiasis ). Allí ellos maduran, transformándose en los llamados "trofozoitos de la luz intestinal", se dividen por fisión binaria, se eliminan con las heces y se destruyen en el medio ambiente.

Otras veces, se transforman en quistes inicialmente uninucleados, que después maduran y son igualmente eliminados por las heces . En algunas ocasiones, la maduración de del quiste tiene lugar en el medio externo.

Fig 2: Ciclo de vida de E. histolytica y manifestaciones clínicas de infección en humanos. (FUENTE: Huston, Haque, and Petri, 1999)

Ya en el medio ambiente, los quistes son impulsados por el viento y contaminan vegetales, frutas y agua potable, y cuando son consumidos transmiten la enfermedad, completándose así el ciclo. (La Amibiasis,2005).

En determinadas circunstancias, los trofozoitos anteriores, adquieren capacidad invasiva y , por la acción de proteasas, hialuronidasas y mucopolisacaridasa, erosionan la mucosa y a veces la ulceran y alcanzan incluso la submucosa. Estos trofozoitos o <<trofozoitos tisulares>> son de mayor tamaño, poseen mayor movilidad, son hematófagos, no se transforman en quistes y no suelen salir por las heces. A través del sistema portal pueden alcanzar el hígado u otros órganos (Pumarola, et al.,1987).

4. LA AMIBIASIS

La Organización Mundial de la Salud ha definido a la amibiasis: "como la condición de portar el parásito Entamoeba histolytica con o sin manifestaciones clínicas". Se sabe desde hace mucho que muchas personas aparentemente infectadas con E. histolytica nunca desarrollan síntomas y eliminan sus infecciones espontáneamente.

Esto lo interpretaron muchos investigadores como una indicación de que el parásito tenía una virulencia variable. La E. histolytica puede causar enfermedad invasora intestinal y extraintestinal, contrario a E. dispar. La confirmación de la distinción de estas dos especies es posiblemente el mayor logro en el campo de la investigación de la amibiasis.

4.1 EPIDEMIOLOGÍA

Se estima que el 10% de la población mundial está infectada por E. dispar o por E. histolytica, lo que resulta en aproximadamente 50 millones de casos de amibiasis invasora y hasta 100.000 muertes por año. La prevalencia de infección amibiana puede ser tan alta como 50% en ciertas áreas de los países en desarrollo. Tasas elevadas de infección amibiana ocurren en el subcontinente indio, Africa occidental, lejano oriente y Centroamérica. La prevalencia de la infección amibiana depende de hábitos culturales, edad, nivel de saneamiento, hacinamiento y condición socioeconómica (La Entamoeba histolytica y la Amibiasis, 2005 ).

En Colombia, la amibiasis es un problema endémico, si se aplican las tasas de prevalencia de amebiasis de la Encuesta Nacional de Morbilidad de 1980, se encuentra que aproximadamente 3.025.000 colombianos son portadores asintomáticos de E histolytica y 1.075.000 han sufrido algún tipo de enfermedad amebiana intestinal o extraintestinal. Por tanto es importante conocer los factores de riesgo epidemiológicos relevantes para la adquisición de la infección, el desarrollo de la enfermedad y así poder identificar los pacientes con amibiasis, así como las técnicas apropiadas para la diferenciación de Entamoeba. Introducción

5. TÉCNICAS EMPLEADAS PARA LA DIFERENCIACION DE Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar

El diagnóstico de la amibiasis intestinal está basado en el examen de heces o en la biopsia. El examen microscópico no permite diferenciar E. histolytica de E. dispar, excepto cuando los trofozoítos de E. histolytica presentan eritrocitos fagocitados, que es una condición altamente asociada con la amibiasis invasora. En las infecciones por E. dispar no hay trofozoítos hematófagos. De este modo las técnicas utilizadas para la diferenciación de estas dos especies son:

5.1 ELISA

La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal : es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre (Pumarola, et al.,1987).

La técnica ELISA ha sido muy usada para determinar diferencias entre E. histolytica y E. Dispar: En los años posteriores a 1978, se desarrollaron anticuerpos monoclonales contra varios antígenos que permiten diferenciar las cepas invasoras de las no invasoras. Dentro de estos se encuentran: la lectina de adherencia Gal/GalNac (GIAP), un antígeno de superficie de 96 kDa, un antígeno proteínico interno de 81-84 kDa, una proteína hidrofílica de membrana de 29 kDA/30 kDa, así como el antígeno aislado de los gránulos electrodensos (EDG) producidos al interactuar trofozoitos del parásito con colágeno "in vitro" (Reyes y León,2002).

Otros métodos más específicos utilizan la lectina denominada GIAP. Esta lectina de 260 kDa presenta dos subunidades: una pesada de 170 kDa unida por puentes disulfuro con otra subunidad liviana de 35 kDa. La subunidad de 170 kDa es antigénicamente conservada y además es inmunogénica, por el contrario la de 35 kDa no desarrolla una respuesta inmune . Por lo anterior, el antígeno de 170 kDa ha sido utilizado tanto para la detección de anticuerpos , como para el desarrollo de anticuerpos monoclonales que permiten su identificación directamente en las heces. Se ha desarrollado anticuerpos monoclonales contra esta subunidad y establecido la presencia de al menos 6 epitopos importantes como posibles herramientas para la diferenciación de E. Histolytica / E. dispar. Dos de estos anticuerpos monoclonales reconocen dos epitopos presentes en ambas especies y los cuatro restantes reconocen epitopos que se encuentran sólo en la especie patógena (Reyes y León,2002).

5.2 PCR

En el estudio de la función y la estructura genética se requiere para su análisis suficientes cantidades del DNA de interés. Esto es accesible gracias a una técnica, que no requiere el uso de microorganismos, conocida como reacción en cadena de la Polimerasa (PCR). Este es el nombre que se ha dado a la amplificación in Vitro de secuencias especificas de ácidos nucleicos mediante ciclos repetidos de síntesis dirigidos por cebadores. El mecanismo, es básicamente el utilizado por las células durante la replicación; la desnaturalización capacita a la enzima Polimerasa a generar una copia complementaria a la hebra de DNA parental a partir de desoxirribonucleótidos trifosfato en (dNTPs) solución.

La secuencia de un único gen puede ser localizada entre una abundancia de otras secuencias de DNA, incluso en lisados crudos, y será amplificada de una forma exponencial hasta rendir una cantidad analizable (Walker y Gingold, 1997)

Para la separación de las dos cadenas que forman la molécula de

ADN que se quiere amplificar, se debe calentar el ADN a altas temperaturas que pueden ser próximas a la ebullición (950c). Cada una de estas cadenas actuará como molde para fabricar su complementaria. A continuación se baja la temperatura (600c) para conseguir que cada cebador se una a su región específica dentro de la cadena de ADN. El último paso consiste en la generación de la cadena de ADN complementaria por acción de la ADN Polimerasa a una temperatura elevada (720c). Cada una de las moléculas de ADN hijas pueden volver a entrar en el proceso y servir como molde para fabricar más copias. Así tras 20 ciclos de reacción se puede obtener hasta 1 millón de copias de una molécula de ADN.

5.2.1 AP – PCR

Según García y Yara, 2002, Wiliams descubrieron una técnica llamada AP – PCR (PCR de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente) que emplea un solo primer de oligonucleótidos de secuencia aleatoria pero con un mínimo contenido de GC de 60%, este primer se anilla a regiones arbitrarias del DNA blanco a 37 0C durante el PCR. Según García y Yara (2002), Welsh y McClelland (1990) descubrieron una técnica similar, AP-PCR (PCR preparado arbitrariamente), en el cual un primer largo es anillado a temperaturas bajas durante los ciclos iniciales del PCR. Ambas técnicas dependen del anillamiento de las primeras regiones complementarias a través del genoma.

Con cualquiera de las técnicas de la región entre los dos sitios de anillamiento del primer será amplificada si el extremo 5’ de los sitios de anillamiento ( o el extremo 3’ de los primers anillados) se encuentra cara a cara con la cadena opuesta de DNA. Además los sitios de anillamiento pueden ser suficientemente estrechos para que la región que interviene pueda ser amplificada durante una rutina de PCR. Ambas técnicas son similares en sus condiciones de reacción y la forma de los datos que producen. Una región amplificada por cualquiera de las técnicas será flanqueada por repeticiones invertidas que son en su mayoría complementarias a los primers y separadas por no mas de 2.5 – 3.0 Kb. Los polimorfismos revelados por estas técnicas son por consiguiente expresados como la presencia o ausencia de un fragmento de un tamaño particular entre individuos. Los polimorfismos genéticos revelados por AP son usados en una gran variedad de diferentes áreas de la genética, incluyendo impresiones digitales del DNA, genética de poblaciones y mapeo del genoma (García y Yara, 2002)

5.2.2 PCR como método de diferenciación entre E. histolytica y E. dispar

Desde los inicios de los años 90, se ha venido utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual ha demostrado ser muy eficaz para la diferenciación de ambas especies pero cuyo empleo se haya limitado a estudios epidemiológicos o experimentales pero no a nivel diagnóstico rutinario.

A través de PCR, se establecieron diferencias entre E. histolytica y E. dispar no sólo a nivel bioquímico y antigénico sino también desde el punto de vista genético principalmente en secuencias altamente repetitivas de ADN circular extracromosomal, así como diferencias en genes codificantes para la actina, la cisteína proteinasa, la superóxido dismutasa ( Reyes y León, 2002).

La habilidad del PCR para amplificar específicamente grandes cantidades de DNA patógeno ha revolucionado el diagnostico de muchas enfermedades infecciosas, y ha hecho de este una técnica ideal para diferenciar entre numerosas secuencias de genes homólogos en E. histolityca y E. dispar. varios métodos han sido publicados, pero no todos cuentan con la amplificación de regiones únicas de SSUrRNA en el episoma. Su alto número de copias provee elevada sensibilidad. Sin embargo, en el proceso original el producto fue frecuentemente detectado por electroforesis en gel seguido de visualización con bromuro de etidio, detección colorimétrica que usa pruebas específicas y que ahora es frecuentemente empleada.

Los ciclos de PCR han sido aplicados para la diagnosis de la amibiasis utilizando trofozoítos cultivados in vitro. De este modo, se ha desarrollado la identificación de cepas al igual que especies, sin embargo es importante tener en cuenta las desventajas de este método. Primero, se requiere la separación en tres pasos: extracción de DNA, amplificación y detección del producto. Segundo, con todos los métodos de PCR, se debe eliminar el riesgo de falsos positivos debido a la contaminación por productos preparados anteriormente.

En la práctica la alta sensibilidad teórica del PCR es balanceada por la velocidad y la conveniencia de un Kit y la escogencia del método dependerá de las preferencias y los recursos locales (Ackers, 2002).

5.3 ISOENZIMAS

Técnica que se fundamenta en la migración electroforética diferencial de las isoformas de una enzima, las cuales conservan su actividad catalítica pero se diferencian en su estructura primaria. Como son la expresión directa del genoma son un buen indicador de la variabilidad genética de una población (Acquaah, 1992 citado por García y Yara, 2002). Las características más importantes de las isoenzimas son:

Múltiples formas moleculares de enzimas (isoenzimas) comunes en los organismos
Comparten una actividad catalítica común
Con frecuencia exhiben especificidad en tejidos o células
La heterogeneidad molecular de las enzimas confiere flexibilidad, versatilidad y precisión sobre un organismo en términos de funciones metabólicas
Son caracteres monofactoriales

La electroforesis de isoenzimas puede aplicarse a problemas en sistemática de parásitos si se interpretan correctamente los patrones de bandeo en los geles. Esta interpretación requiere un conocimiento previo de la estructura cuaternaria de las enzimas usadas y las muestras de los individuos de estudio. En general hay dos métodos de descripción e interpretación de los patrones electroforéticos en los geles: independiente de la ploidía o modo de reproducción del organismo bajo estudio. Ellos son la aproximación al zimodemo y la aproximación alozímica.

5.3.1 Electroforesis de isoenzimas como método de diferenciación entre E. histolytica y E. dispar

Gracias a la técnica de electroforesis de isoenzimas actualmente se ha logrado establecer lo siguiente:

Todas las especies de amibas del intestinos humano pueden ser diferenciadas por patrones isoenzimáticos. Este resultado incluye la importante verificación de la existencia de la E. hartmanni, antes llamada la forma minuta de la E. histolytica, como especie distintiva.
Más de veinte patrones isoenzimáticos de E. histolytica han sido encontrados en cuatro continentes.
Las amibas cultivadas de muestras obtenidas de casos bien definidos de amibiasis invasora (disentería amibiana o absceso hepático) se agrupan en siete diferentes patrones de isoenzimas, caracterizados por la presencia de bandas específicas en la enzima fosfoglucomutasa, y por bandas "rápidas" en la enzima hexoquinasa (Son todas las amebas invasoras, 2005).

BIBLIOGRAFÍA

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ONEIDA ESPINOSA ALVAREZ

estudiante VI semestre BIOLOGÍA,

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA – IBAGUE

GINA MARCELA GALLEGO LOPEZ

estudiante VI semestre BIOLOGÍA, UNIVERSIDAD DEL TOLIMA – IBAGUE

KARINA ALEXANDRA GUTIERREZ DIAZ

estudiante VI semestre BIOLOGÍA, UNIVERSIDAD DEL TOLIMA – IBAGUE

DIANA KARINA ROJAS BRIÑEZ

estudiante VI semestre BIOLOGÍA, UNIVERSIDAD DEL TOLIMA – IBAGUE

IBAGUE

2005