Aclimatización del Marañón

(Anacardium Occidentale l.)

1. Resumen
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
5. Referencias

RESUMEN

Con el propósito de garantizar alta supervivencia durante la transición de plantas de marañón cultivadas in vitro a condiciones semicontroladas, se desarrolló el proceso de aclimatización. Este se sustentó en mantener alta humedad relativa, al inicio, mediante dos tipos de cámara húmeda; posteriormente, fue regulándose hasta igualarse a la existente en condiciones naturales. Se evaluaron variables que definieron el crecimiento, desarrollo y la aptitud de las plantas para ser establecidas en el campo. La observación estomática resultó ser un indicador valioso para saber que las plantas se habian adaptado a las nuevas condiciones de cultivo. Se alcanzó un 87% de supervivencia, lo que demostró la efectividad de la aclimatización, sobre todo en una especie con extrema sensibilidad a que se le dañe el sistema radical durante su manipulación.

Palabras clave: Marañón, Anacardium occidentale, Aclimtatización, Cámara húmeda.

ABSTRACT

With the purpose of guaranteeing high survival during the transition of cashew plants cultivated in vitro to greenhouse conditions, the acclimatization process was developed. It was sustained in maintaining high relative humidity, at the beginning, by means of two types of humid camera; later on, it was being regulated until being equaled to the existent one under natural conditions. Variables evaluated that defined the growth were evaluated, development and aptitude of the plants to be established in the field. The stomata observation turned out to be a valuable indicator to know that the plants had been adapted to the new cultivation conditions. Around 87% of survival was reached, it showed the effectiveness of the acclimatization, mainly in a species with extreme sensibility to damaged the radical system during its handling.

Keys words: Cashew, Anacardium occidentale, Acclimatization, Humid camera.

INTRODUCCION

El marañón (Anacardium occidentale L.) es un frutal tropical de la familia anacardiácea, originario de la región norte de Brasil, y encuentra en Cuba envidiables condiciones edafoclimáticas para su crecimiento y desarrollo: incluidos abundantes suelos empobrecidos y semiáridos, donde prácticamente no sobrevive otro frutal y, sin embargo, son los preferidos por A. occidentale (Aguilera et al., 2001). No obstante, encabeza la lista de especies frutales tropicales arbóreas amenazados desde hace más de 15 años en nuestro país (Anderez, 1984), y se necesitan tomar medidas urgentes de conservación y manejo de los genotipos silvestres que habitan en los campos y sabanas; los cuales están dispersos y se encuentran cercanos al declive fisiológico.

Uno de los problemas que afecta la propagación sexual del marañón es el aborto de embriones; lo cual es causado por el incompleto desarrollo de los mismos, mutaciones en estructuras que cubren al embrión o un tipo recalcitrante de dormancia (Nambiar y Thankamma, 1980). Ellis et al. (1985) clasifican al marañón como especie ortodoxa y señalan su germinación baja y fuertemente demorada. Esta limitación puede ser resuelta a través del cultivo in vitro de embriones zigóticos, o mediante alguna otra biotécnica que permita la micropropagación de la especie.

Las plantas procedentes del cultivo de tejidos, presentan un desenvolvimiento anatómico y fisiológico anormal, si se comparan con las propagadas tradicionalmente de forma natural (Debergh, 1991). De modo, que la terminología aclimatización, según este autor, implica la transición desde las condiciones in vitro a las in vivo, bajo la intervención y guía de la mano del hombre. Preece y Sutter (1991) consideran a las cualidades intrínsecas de las plantas, como el factor más importante y de éxito en el traslado de estas, de las condiciones in vitro a in vivo. Paques (1991) estima a la vitrificación o hiperhidratación como el síntoma más frecuentemente calificado con el adjetivo anormal, en torno al comportamiento de las plantas cultivadas in vitro. No obstante, existen ciertas características anatómicas que diferencian a las plantas cultivas in vitro de las que se desarrollan en condiciones naturales; tales como hojas más pequeñas y finas, y pobre desarrollo del parénquima y de la cutícula con una considerable cantidad de espacios de aire en el mesófilo (Debergh, 1991).

Otra característica de las plantas obtenidas por cultivo de tejidos, es no ser fotoautotróficas; sino más bien mixotróficas o heterotróficas, pues los hidratos de carbono los toman del medio de cultivo y los cloroplastos se encuentran deprimidos. Estos factores afectan la fotosíntesis, la cual debe jugar un papel importante en la aclimatización y la supervivencia (Deberg, 1991). La apertura y cierre estomático ha sido definida por el propio autor, como el elemento de mayor implicación en la desecación o deshidratación de las plantas llevadas a condiciones semicontroladas procedentes del cultivo in vitro. Esto lo relaciona con el pobre funcionamiento de los estomas, el anormal desarrollo de las células oclusivas y a la poca selectividad en la acumulación de Na, K y Mg en dichas células durante el cultivo in vitro.

Todas son razones, que condujeron a la realización de este trabajo, cuyo propósito está enfocado a obtener un procedimiento e indicadores anatómicos y fisiológicos, que permitan alcanzar altos índices de supervivencia en plantas de marañón, procedentes del cultivo in vitro de embriones zigóticos maduros, durante el proceso de aclimatización.

MATERIALES Y METODOS

La experiencia con el marañón (Anacardium occidentale L.), se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Investigaciones Agropecuarias "Jorge Dimitrov", perteneciente al Ministerio de Ciencia, Tecnología y Medio Ambiente de Cuba.

Las plántulas, procedentes del cultivo in vitro de embriones zigóticos maduros, se extrajeron cuidadosamente de los erlenmeyers, y se lavó el sistema radical, hasta remover los restos de agar, sin provocarse daños mecánicos. Posteriormente se transplantaron, de forma individual, a bolsas de polietileno negro de 1 005 cm3 de capacidad, las cuales contenían un sustrato formado por una mezcla de suelo, arena y materia orgánica en proporción de 2:1:1, respectivamente. El suelo fue Oscuro Plástico, la arena de río y la materia orgánica humus de lombriz.

Se emplearon dos tipos de cámara húmeda: una compuesta por frascos de cristal de 250 ml de capacidad, de color verde claro, colocados como cobertura encima las plantas y sostenidos sobre el sustrato. La otra consistió en campanas de cristal totalmente transparentes, muy amplias, bajo las cuales y en cada una ellas, se situaron cuatro plantas y un frasco destapado con agua. En el ambiente de aclimatización las temperaturas oscilaron entre 28 y 32° C, la humedad relativa alrededor del 50%, la intensidad luminosa fue de 30 m Em-2S-1, y el fotoperíodo de 16 horas luz. Dentro de las cámaras húmedas, la humedad relativa al inicio fue tan alta como en condiciones in vitro, pero al estas suspenderse en la segunda, tercera y cuarta semana por espacio de 3, 6 y 12 horas diarias, respectivamente; la humedad relativa se redujo notablemente dentro de las mismas, hasta aproximarse a la existente en el ambiente natural, la cual era de 70 a 75%.

Durante ese período se regaron con agua, solamente, para humedecer el sustrato sin provocar encharcamiento. Al término del tiempo señalado, se liberaron definitivamente de la cámara húmeda. Estuvieron una semana bajo observación, y se comenzaron a someter, diariamente, a condiciones naturales bajo sombra natural durante otra semana.

Se evaluó la longitud de las plantas (LP) en cm, el número de hojas nuevas por plantas (NHN), el número de hojas totales (NHT), la longitud de los estomas (LE) en m m, el ancho de los estomas (AE) en m m y la frecuencia estomática (FE) en estomas/mm2. Las tres últimas variables, se determinaron también en plantas cultivadas in vitro y en plantas en condiciones naturales, para hacer un análisis comparativo. En todos los casos se tomaron huellas epidérmicas de la haz y del envés de la tercera hoja, contada del ápice hacia la base de la planta, pues estas presentan una estructura anatómica definida con máxima actividad metabólica (Fahl, 1989). La técnica se aplicó en la parte central de las hojas, por ser menos variable la FE en esta área, y se basó en la utilización de acetato de celulosa diluido en ácido acético, colocado como una película muy fina; al secarse al aire, se procedió a separarla y extenderla en un porta objeto. Después se fijó al mismo, el cubre objeto con bálsamo de Canadá, y posteriormente se realizaron los conteos y mediciones al microscopio ocular según sugiere Medina (1961).

El tamaño de muestra fue igual a 10, y los datos de LP, NHN y NHT, obtenidos a las cuatro semanas de iniciada la aclimatización, se analizaron mediante la prueba de T-Student, y el p£ 0.001. El experimento se repitió en tres veces, bajo similares condiciones.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los dos tipos de cámara húmeda (CH) empleadas, aunque distintas (Fig. 1), tuvieron como función impedir la deshidratación de las plantas, al sufrir un cambio brusco de condiciones de cultivo, debido a ser extraídas de su ambiente in vitro para ser establecidas en uno semicontrolado. Con ambos tipos de CH la supervivencia fue del 87%. Sin embargo, las plantas crecieron y emitieron más hojas en presencia de la campana, y superaron con diferencia altamente significativa a las que se aclimatizaron bajo frascos (Tabla 1).

La formación de las hojas ocurrió lentamente, no sólo en las plantas cultivadas in vitro, sino también en las plantadas en condiciones semicontroladas. Se observó que dicho proceso estuvo relacionado, con el tipo de CH a que estuvieron sometidas las plantas durante la aclimatización. El número de hojas nuevas (NHN) formadas, bajo la acción de la campana, fue superior en más de 1.5 hojas a las desarrolladas bajo el efecto de la otra CH. Lo que condicionó, a que el número de hojas totales (NHT) —con el cual finalmente contaron las plantas para ser llevadas a su sitio definitivo en el campo— fuera de casi 3.5 hojas de diferencia al compararse los dos tipos de CH.

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 Fig. 1 Muestra de las cámaras húmeda usadas en la aclimatización del marañón.

Debe reconocerse que tanto una como la otra CH, fueron capaces de mantener en su interior la humedad relativa alta, lo cual se apreció por el agua condensada que se observó adherida a las paredes de ellas. Incluso las muertes ocurridas, las cuales no sobrepasaron el 13%, se pueden atribuir más bien a individuos con un sistema radical deficiente y dañado durante la manipulación al trasladarse de condiciones in vitro a semicontroladas. Estos, al parecer, no pudieron emitir nuevas raíces o, simplemente, las raíces dañadas no fueron capaces de garantizar la nutrición de las plantas hasta que se formaran otras nuevas, produciéndoles gradualmente la muerte.

Tabla 1. Influencia del tipo de cámara húmeda en el crecimiento y

desarrollo de las plantas de marañón durante la aclimatización.

T-Student: diferencia significativa entre las columnas (p<0.001).

En los últimos años se ha iniciado una corriente que se inclina al transplante sin raíz de condiciones in vitro hacia las condiciones semicontroladas; práctica no aconsejable en el cultivo del marañón, pues parte de las causas de su buen comportamiento al proceso de aclimatización a que se sometió, obedeció a disponer de un sistema radical, no extremadamente profuso, pero si con raíces bien formadas. Los individuos que se transplantaron sin raíz murieron de inmediato. Esto le da certeza al criterio formulado por Mohammed y Videver (1990), los que aseguran, que la presencia de raíces en plantas leñosas garantizan alta supervivencia en la aclimatización.

El crecimiento y desarrollo superior obtenido con la campana, debió basarse en el mayor volumen de este tipo de CH, proporcionándole más posibilidad a los gases de poderse difundir e intercambiar, y concentrar más CO2 para contribuir a un proceso fotosintético más efectivo. Kosai (1990) indica la importancia de concentraciones de CO2 suficientes para que las plantas procedentes del cultivo in vitro alcancen su autotrofismo. También el cristal de las campanas es transparente, y el de los frascos color verde claro, lo cual pudo influir en la mejor calidad de la luz que llegó hasta las plantas cultivadas bajo las campanas, y este también ser un elemento con posible beneficio sobre la fotosíntesis. Otro aspecto a considerarse es que cada campana cubrió a cuatro plantas, mientras los frascos se le colocaron a las plantas individualmente. De este modo, en las campanas las plantas pudieron establecer algún tipo de colaboración a través del intercambio gaseoso, lo cual no fue posible en la otra CH. No obstante, a pesar de lo acontecido en una u otra CH, debe recalcarse que las dos permitieron la aclimatización de las plantas, y que a falta de campanas, u otro medio que las simule, pueden emplearse frascos como una buena alternativa.

La CH se retiró a las cuatro semanas, pero se necesitaba conocer si verdaderamente las plantas serian capaces de permanecer viables, sin deshidratarse y con posibilidades de transpirar normalmente. Lo más práctico fue observar los estomas al cabo de 24 horas de haberse liberado las plantas de la CH. Entonces se confirmó que la vitalidad que las mismas manifestaban, era porque habían podido adaptarse al nuevo sustrato y condiciones ambientales; expresándolo no sólo por la formación de nuevos órganos hasta ese momento, sino además porque los estomas estaban semiabiertos y las células oclusivas turgentes. Todos estos elementos fueron suficientes para saber, que el período bajo el cual permanecieron las plantas sometidas a la acción de la CH, permitió que se endurecieran y ganaran independencia biológica, al aclimatizarse a las nuevas condiciones de cultivo, ya más parecidas a las naturales donde permanecerán hasta el final de su declive fisiológico.

Estos resultados permitieron confirmar, que es indispensable el tránsito de las plantas obtenidas in vitro, por condiciones semicontroladas, y ser manipuladas adecuadamente en dichas condiciones para evitar su deshidratación. Blanke y Belcher (1989) demostraron que los bajos grados de transpiración in vitro, se deben al pequeño gradiente de humedad entre los espacios intercelulares de las hojas y la atmósfera saturada de humedad en los recipientes de cultivo, lo cual es responsable de que los estomas se puedan considerar infuncionales en esas condiciones. Desjardins (1995) más bien califica el funcionamiento de los estomas in vitro como anormal; no obstante, reconoce que el inicial y principal estrés que obstaculiza la aclimatización de las plantas es la deshidratación, y la señala como inhibidora de la formación de la cera epicuticular de las hojas.

Las plantas se liberaron de la CH lentamente, para que sus mecanismos fisiológicos fuesen adaptándose a las nuevas condiciones de cultivo, lo cual se logró en cuatro semanas. Tanaka et al. (1992) disminuyeron gradualmente la humedad relativa durante 25 días, en especies ornamentales cultivadas in vitro para contrarrestar la excesiva transpiración y la posible deshidratación, y demostraron que la reducción de la humedad relativa en las CH, se asocia con alta resistencia de la parte abaxial de las hojas a la transpiración; puesto que se logra un mecanismo apropiado de apertura y cierre estomático. En el cultivo de la papa, observaron que al descender la humedad relativa hasta el 85%, las plantas resistieron el transplante ex vitro.

Los estomas no se comportaron de la misma manera en cada una de las fases de cultivo. Notándose en la Tabla 2, como la longitud de estos, fue mayor en las condiciones in vitro que en el resto de las condiciones. Sin embargo, el ancho que mostraron los estomas en plantas en fase de aclimatización fue mayor que el de los que procedieron de condiciones in vitro, y los menos anchos se registraron en condiciones naturales. Como mismo ocurre en otras muchas especies, en la parte adaxial o haz la frecuencia estomática fue menor que en la abaxial o envez. En esta, los estomas se ubicaron en toda su dimensión; mientras en la adaxial, los estomas se situaron aisladamente alrededor del nervio central de la hoja.

Tabla 2. Comportamiento de los estomas en plantas de marañón bajo distintas

condiciones de estudio.

 Al igual que el ancho de los estomas, la frecuencia estomática (FE) fue mayor en la fase de aclimatización, seguida de la obtenida en plantas cultivadas in vitro y la menor se determinó en condiciones naturales. Es posible que uno de los aspectos fisiológicos encargados de permitir que el marañón pueda vivir felizmente en condiciones semiáridas y de baja pluviometría (Cañizares, 1984) sea, precisamente, la posibilidad de reducir no sólo el ancho de los estomas, y por supuesto el tamaño del ostiolo; sino también la cantidad de estomas por unidad de superficie. De modo, que esto puede contribuir a que las plantas, en tales condiciones, se protejan de la sequía con mayor eficiencia al reducir las pérdidas de agua por transpiración y como consecuencia mantener reservas, de esta, suficientes en sus tejidos. Todo lo señalado, unido a la característica coriácea de las hojas de marañón, entre otras cosas, es lo que le confiere a dicha especie la propiedad de ser uno de los frutales tropicales arbóreos más resistentes a la escasez de agua. Levit (1987) relaciona un conjunto de cambios fisiológicos y anatómicos que tienen lugar en plantas tolerantes y resistentes a la sequía; donde se incluye la disminución del tamaño de los estomas y la reducción de su frecuencia.

No fue sustancial la diferencia de la FE entre la fase in vitro y la de aclimatización (Tabla 2); lo que si ocurrió —como se comentó antes— en relación a las condiciones naturales. Existe diversidad de criterios al respecto y todo apunta a una marcada influencia de la especie con la cual se trabaje. Whish y Williams (1992) registraron una reducción de la FE, a medida que se disminuyó la humedad relativa hasta el 80% en la aclimatización. Mientras Gerhard et al (1992) indican que la FE puede ser mayor ex vitro, debido a que el área de las hojas in vitro es alterada por el intercambio gaseoso entre los recipientes de cultivo y la atmósfera ambiental, y ponen como ejemplo que hojas de rosa y de Spathipyllum desarrolladas in vitro contaron con 163 y 53 estomas/mm2, respectivamente; y en condiciones de casa vegetativa, sufrieron una reducción hasta 86 y 29 estomas/mm2 en cada caso. Sin embargo, Desjardens (1995) no encontró diferencias importantes de FE, en plantas de Pelargonium cultivadas in vitro y en condiciones naturales.

En las observaciones realizadas al microscopio, se pudo percibir cierta irregularidad en la conformación de las paredes de las células oclusivas obtenidas de plantas en condiciones in vitro, lo cual no se presentó en plantas cultivadas en las demás condiciones. Esto concuerda con similar planteamiento hecho por Debergh (1991). Considerarse el comportamiento estomático en el estudio de aclimatización, es un indicador eficiente; pues Whish y Williams (1992) aconsejan que es importante aplicar, durante dicha fase, técnicas que permitan conocer el estado de la turgencia celular y darle seguimiento al comportamiento estomático, para lograr una exitosa transición de las plantas in vitro hasta condiciones naturales.

Después de una minuciosa búsqueda de publicaciones internacionales, acerca de la aclimatización del marañón, solamente se encontró el artículo de Das et al. (1999), el cual hace referencia a que ese es el primer trabajo que oficialmente se da a conocer sobre el cultivo de embriones zigóticos y aclimatización de A. occidentale. Estas son razones que le dan distinción especial a la presente investigación, por lo novedoso de los resultados, y que no se diferencian de manera importante con los obtenidos por los citados autores. En su caso, utilizaron un sustrato compuesto por suelo:perlita (1:1) y mantuvieron a las plantas en un contenedor a manera de CH, con humedad relativa superior al 90%, fertilizaron semanalmente con el sustrato vegetal nutritivo comercial "Fostrogen". Redujeron gradualmente, durante dos meses, la humedad relativa, hasta valores similares a los existentes en condiciones naturales, las colocaron durante dos a cuatro meses en casa vegetativa, y después las trasladaron hasta su lecho definitivo en el campo. El manejo que le dieron a las plantas de marañón extraídas de las condiciones in vitro, fue extremadamente delicado, precisamente con el fin de evitar la deshidratación.

Dicho procedimiento fue muy parecido al descrito en este trabajo, con la diferencia de que emplearon entre cuatro y seis meses para liberar las plantas, y en ese periodo aplicaron un producto comercial; mientras en este, sólo mediaron cinco semanas sin la utilización de sustancias adicionales, simplemente con un sustrato enriquecido con humus de lombriz, como abono orgánico de bajo costo y de fácil adquisición. No obstante, los porcentajes de supervivencia están en correspondencia, al igual que el crecimiento y desarrollo de las plantas, y se evidencia lo valioso de la observación estomática para tener criterios sobre la aclimatización de las mismas, y no tener que someterlas un tiempo innecesario en condiciones semicontroladas.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo se desarrolló gracias al proyecto: "Conservación in vitro de germoplasma de frutales" ; con soporte financiero del CITMA.

REFERENCIAS

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Narciso Aguilera

Lubia Guedes

Asociación Cubana de Técnicos Agrícolas y Forestales (ACTAF). Capotico 208, Bayamo 85 100, Granma-Cuba.

E-mail:

N. Nerdo Rodríguez

Instituto de Investigaciones de Cítricos y Frutales. Güira de Melena. La Habana-Cuba.