Determinación de la capacidad biodegradadora de hidrocarburos aromáticos policiclicos de los hongos (página 2)

Dentro de las fuentes de carbono importantes para este trabajo de investigación se puede mencionar la Glucosa, Sacarosa, y como fuentes de carbono sustitutivas está el Crudo de Petróleo y los Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HPAs).

Glucosa

Es un monosacárido que tiene seis átomos de carbono como se puede observar en la figura #04, es el monosacárido originario del que se derivan muchos más. La D-glucosa es el combustible principal para la mayor parte de los organismos, y es también la unidad estructural básica de los polisacáridos más abundantes, tales como el almidón y la celulosa (Lehninger, 2005).

Figura # 04. Estructura química de la D-Glucosa. Fuente: Lehninger, 2005

Sacarosa

Comúnmente conocida como azúcar de caña, es un disacárido de la Glucosa y de la Fructosa. Abunda sobremanera en el reino vegetal y es familiar como azúcar de mesa. Al contario de muchos disacáridos y oligosacáridos, la sacarosa no contiene átomo de carbono anomérico libre; los de ambas hexosas se hallan unidas entre sí. La sacarosa, por tanto, no experimenta mutarrotación ni reacciona con la fenilhidracina para formar osazonas, ni siquiera es un azúcar reductor. La hidrólisis de la sacarosa a D-glucosa y D-fructosa se denomina frecuentemente inversión, ya que va acompañada de un cambio neto de rotación óptica, de dextro a levo, en cuanto se ha producido la mezcla equimolar de glucosa y de fructosa; esta mezcla se denomina frecuentemente azúcar invertido. La hidrólisis de la sacarosa que es catalizada por la enzima invertasa observar la figura #05 (Lehninger, 2005).

Figura # 05. Estructura química de la sacarosa. Fuente: Lehninger, 2005

Hongos

Son talófitos carentes de clorofila y de sistema vascular que, por su estructura vegetativa y su sistema de reproducción, se diferencian de las algas y aun más de las plantas superiores. Características morfológicas fundamentales los separan también de las bacterias, pues son organismos constituidos de muchas células, todas provistas de núcleos típicos. En la mayoría de los hongos el cuerpo vegetativo consiste en numerosos filamentos alargados, tabicados o no, denominados hifas, y el conjunto de estas recibe el nombre de micelio. Existen dos tipos de micelio: en uno la presencia de tabiques divide a las hifas en muchas células independientes y es característico tanto de formas superiores (ascomicetes y basidiomicetes) como inferiores (deuteromicetes); el otro, con hifas indivisas, es decir cenocíticos, es propio de los ficomicetes, que presentan unas de las clases menos evolucionadas de este grupo. Entre los hongos más frecuentes están: Penicillium, Zygorhynchus, Fusarium, Mucor, Aspergillus y Rhizopus. Hanson JR. (2008).

Claves de identificación de los hongos

Existen claves de identificación de hongos, las cuales en su mayoría son dicotómicas. Entre las principales características macroscópicas de identificación se encuentran diámetros de las colonias, coloración del anverso y reverso de las mismas, presencia de esclerocios, presencias de gotas de exudados, presencia de pigmentos difusibles y textura de las colonias. Y como principales características microscópicas de identificación se pueden mencionar disposición de las médulas o filiadas sobre la vesícula, longitud y anchura de los estipes, forma y diámetro de las vesículas, longitud y anchura de las médulas o filiadas, forma, diámetro, ornamentación y color de los conidios, forma, tamaño y color de las células de Hulle, forma, tamaño y color de las ascosporas. Hanson JR. (2008).

Hongos Ligninolítico

Son aquellos que han desarrollado un sistema enzimático único y no específico que funciona en el ambiente extracelular. El mecanismo del sistema degradador de lignina está basado en la producción de radicales libres. Este mecanismo permite que estas enzimas sean catalíticamente activas sobre una gran diversidad de sustratos orgánicos. La enorme diversidad estructural de los contaminantes que son degradados por estos hongos, les confiere un uso potencial en biorremediación. Estos hongos han sido efectivos en la degradación de una diversidad de contaminantes ambientales peligrosos (Davila, G. Vázquez, R 2006).

Lignina

Según (Davila, G. Vázquez, R 2006) la lignina, después de la celulosa, es el mayor componente de la materia vegetal y la forma más abundante de material aromático en la biosfera. La madera y otros tejidos vasculares contienen alrededor del 20-30% de lignina (Lin, S. Y, Dence 1992). La mayor parte de ésta se encuentra dentro de las paredes celulares, entremezclada con las hemicelulosas y formando una matriz que rodea las ordenadas microfibrillas de celulosa. Este compuesto provee de rigidez a las plantas superiores ya que actúa como pegamento entre las fibras de celulosa formando la lámina media (Kirk, T. K, Farrell 1987). Además, protege a los carbohidratos fácilmente degradables (celulosa, hemicelulosa) de la hidrólisis enzimática microbiana, (Fritsche, W. Hofrichter, M. 1999). Ver la figura #06

Figura # 06. Estructura parcial de la lignina Fuente: Higuchi (1990)

Enzimas ligninolíticas de hongos

Según (Davila, G. Vázquez, R 2006) A partir de los estudios realizados con hongos ligninolíticos en los años setenta, se comprobó que la degradación de la lignina daba lugar a productos que provenían de la ruptura oxidativa de anillos aromáticos. Por lo que se pensó que las oxigenasas extracelulares podían estar involucradas en la transformación de la lignina (Kirk, T. K, Chan, G. 1975). Algunos años después, tres grupos reportaron de manera independiente, el descubrimiento de una ligninasa capaz de oxidar y despolimerizar la lignina y compuestos modelo (Glenn, J. K, Morgan 1983), y cuya actividad enzimática depende del peróxido de hidrógeno (HB2BOB2B). Se calcularon pesos moleculares de entre 41-42 kDa y se encontró que contenía un grupo prostético hemo, (Tien, M. Kirk, T.1984). Estudios espectroscópicos mostraron que esta ligninasa era distinta de las oxigenasas P450, compartía algunas características con las hemoproteínas transportadoras de oxígeno y que era en realidad una peroxidasa (Kirk, T. K., Ferrell, R. L.1987). A esta enzima se le denomina ahora como lignino peroxidasa (LiP).

A partir de este hallazgo, se encontró la producción de dos hemoperoxidasas más: la manganeso peroxidasa (MnP) que oxida el MnP2+P a la especie oxidante MnP3+P (Gleen, J.K., Gold, M.H.1985), mientras que recientemente en los géneros Pleurotus y Bjerkandera se ha descrito una MnP versátil (VP). Esta enzima conjuga las propiedades catalíticas de LiP y MnP (Heinfling, A., Ruiz-Dueñas, F.J., Martínez, M. J. 1998).

Además de estas peroxidasas, se detectó la producción en estos hongos ligninolíticos de una cuarta enzima, una fenol oxidasa denominada lacasa. Esta enzima reduce el oxígeno molecular a agua, y a través la utilización de ciertos compuestos redox puede ser capaz de ampliar su espectro de sustratos, logrando así la oxidación de porciones no fenólicas de la lignina (Bourbonnais, R., Paice, M. G.1990).

Estas enzimas ligninolíticas pueden actuar separadas o en cooperación, dependiendo de si el hongo es capaz de producir una o más.

Lignino peroxidasa (LiP) y manganeso peroxidasa (MnP)

Estas dos peroxidasas involucradas en la despolimerización de la lignina fueron descritas por primera vez en el hongo ligninolítico P. chrysosporium. De este organismo se han purificado diez isoenzimas, nombradas H1 a H10, de acuerdo a su orden de elución de una columna de intercambio aniónico. De ellas, seis fueron identificadas como isoenzimas de LiP, mientras que cuatro correspondieron a isoenzimas de MnP. Ambas son capaces de oxidar a la lignina, y derivados de la misma, además de una variedad de compuestos modelo, (Wariishi, H. Valli, K. 1991).

Estas enzimas comparten la estructura del grupo prostético férrico protoporfirina IX (grupo hemo) presente en su sitio activo. Normalmente en las hemo peroxidasas, el átomo de hierro se encuentra penta coordinado. Cuatro posiciones de coordinación son ocupadas por los átomos de nitrógeno de los anillos pirrólicos. La quinta posición se localiza en el lado proximal (por "debajo") del grupo hemo y es comúnmente ocupada por un nitrógeno perteneciente al anillo imidazol de un residuo de histidina. La sexta posición de coordinación en la enzima en su estado basal está vacante y se ubica en el lado distal (por "arriba") del grupo hemo. Esta cavidad distal es la región en la que ocurren muchas de las reacciones de las hemoperoxidasas.

A pesar de la baja homología en secuencia entre diversas peroxidasas (menor al 20%), el plegamiento y la estructura secundaria se encuentran conservadas (Banci, L.1997). La enzima se divide en dos dominios estructurales (proximal y distal) que envuelven al grupo prostético y su estructura está conformada principalmente por 10-11 a-hélices.

Las LiP presentan masas moleculares de aproximadamente 40 kDa, están glicosiladas y tienen puntos isoeléctricos y pH óptimos ácidos. Además su ciclo catalítico es común para diversas peroxidasas (Wariishi, H. Valli, K. 1991).

Peroxidasa versátil (VP)

Según (Davila, G. Vazquez, R 2006) Como se mencionó, tanto la (LiP) como la (MnP) fueron descubiertas en cultivos del hongo P. chrysosporium y estudiadas extensivamente. Recientemente se describió una tercera peroxidasa ligninolítica en los géneros Pleurotus y Bjerkandera. A esta enzima se le denominó versátil peroxidasa (VP). La VP, diferente de la MnP y LiP de P. chysosporium, es capaz de oxidar Mn2+ a Mn3+, y catalizar reacciones sobre sustratos aromáticos en ausencia de Mn2+ (Martine, M. J, Ruiz.1996). Además se encontró que posee una alta afinidad hacia el Mn2+, hidroquinonas y colorantes. También es capaz de oxidar al alcohol veratrílico (a veratril aldehído), dimetoxibenceno y dímeros de lignina, aunque con menor afinidad que la LiP (Caramelo, L. Martínez, M. 1999).

El ciclo catalítico de la VP combina los ciclos de la LiP y la MnP . Sus características básicas son comunes a la mayoría de la peroxidasas. Sin embargo, la VP es única ya que es capaz de oxidar sustratos aromáticos como el alcohol veratrílico (AV) a su correspondiente radical AV•, el Mn2+ a Mn3+ y sustratos que la LiP sólo oxida en presencia de alcohol veratrílico. El ciclo de la VP incluye la sustracción de dos electrones de la enzima en estado basal por el peróxido de hidrógeno para producir el compuesto IA (C-IA), que contiene un oxo-Fe IV=O y un radical catiónico en la porfirina. La reducción en dos reacciones de un electrón produce el compuesto IIA (C-IIA), que contiene un oxo-Fe IV=O. Y después, la forma basal de la enzima. El ciclo también incluye el compuesto IB (C-IB), que contiene un oxo-Fe IV=O y un radical triptófano (Trp•) y el IIB (C-IIB), que contiene un Fe III y un Trp• involucrado en la oxidación de AV y otros compuestos aromáticos de alto potencial redox (C-IB y C-IIB están en equilibrio con C-IA y C-IIA, respectivamente). El porcentaje de las formas A y B en las dos reacciones puede ser variable y su participación en la catálisis dependerá de los sustratos disponibles. En otras palabras, los compuestos IA y IIA predominarán durante la oxidación de Mn2+, mientras que un porcentaje del Trp• será necesario durante la oxidación de AV. El triptófano activo en C-IB y C-IIB es el W164 en la VP de P. eryngii (Pérez-Boada, M. Ruiz-Dueñas, F. 2005).

Es importante mencionar que esta enzima oxida directamente hidroquinonas y fenoles sustituidos, los cuales no son oxidados eficientemente por la LiP o la MnP en ausencia de veratril alcohol o Mn2+, respectivamente. Incluso oxida colorantes de alto potencial redox, los cuales solo son catalizados por la LiP en presencia de veratril alcohol (Heinfling, A. Martínez, M. 1998). Para esta enzima, los pH óptimos para la oxidación de Mn2+ y sustratos aromáticos son diferentes. Para la oxidación de Mn2+ el óptimo es pH 5, mientras que para los compuestos aromáticos y colorantes es 3. Estos parámetros son similares a los de MnP y LiP, respectivamente (Martínez, A. T.2002).

Lacasa

Según (Davila, G. Vazquez, R 2006) Las fenol oxidasas son enzimas que catalizan la oxidación de un amplio espectro de compuestos fenólicos y aminas aromáticas utilizando el oxígeno molecular como aceptor de electrones, reduciéndolo a agua (Shah, V. Nerud, F. 2002)

La lacasa es una fenol oxidasa que debe su nombre a que fue descubierta, hace más de un siglo, en el árbol japonés de la laca: Rhus vernicifera (Yoshida, H. 1883). Esta enzima contiene átomos de cobre y se encuentra ampliamente distribuida en las plantas superiores, diversas clases de hongos y algunas bacterias (Gianfreda, L., Xu, F., Bollag, J. M.1999). Todas las lacasas son glicoproteínas extracelulares [78] con pesos moleculares entre 60 y 80 kDa, y del 15 al 20% de su peso molecular esta dado por carbohidratos, (Shah, V. Nerud, F. 2002).

La lacasa fúngica (bencendiol: oxígeno oxidorreductasa es una fenol oxidasa extracelular producida por el micelio de basidiomicetos, ascomicetos y deuteromicetos, (Bollag, J.M. Leonowicz, A.1984) Los mejores productores de esta enzima son los hongos ligninolíticos (Leonowicz, A., Cho, N. S. 2001). Bioquímicamente, la lacasa es una enzima que oxida una variedad de compuestos aromáticos. Cataliza la remoción de un electrón y un protón de hidroxilos fenólicos o de grupos amino aromático, para formar radicales libres fenoxilo y radicales amino, respectivamente. Este grupo de enzimas, posee cuatro átomos de cobre en su estado de oxidación 2+ que les confieren una coloración azul.

Esta enzima oxida no solamente ácidos fenólicos y metoxifenólicos, sino que también los descarboxila, (Agematu, H., Shibamoto, N. 1993) y ataca sus grupos metoxilo mediante la desmetilación (Leonowicz, A. Edgehill, R. U. 1984) o desmetoxilación (Potthast, A., Rosenau, T. 1995). Todas estas reacciones pueden representar un paso importante en la transformación inicial de la lignina.

La lacasa también reacciona con polifenoles y otros compuestos aromáticos derivados de la lignina, los cuales, pueden ser polimerizados o despolimerizados, o incluso actuar como mediadores redox de bajo peso molecular, (Bourbonnais, R., Paice, M. G. 1995). La utilización de sistemas mediador-lacasa es una alternativa promisoria para procesos biotecnológicos con aplicaciones ambientales. Entre ellos, los de blanqueo de la pulpa de papel [84, 85], la decoloración de colorantes textiles, (Rodriguez, E., Pickard, M. A. 1999) y la oxidación de hidrocarburos polinucleoaromáticos (Pickard, M. A., Román, R.1999)

Los compuestos como el pireno, benzo(a) pireno, acenafteno, fenantreno, antraceno y fluorantreno pueden ser oxidados por enzimas como la LiP (Hammel, K. E.1986), la MnP (Bogan, BW, Lamar RT.1995) la VP (Wang, Y., Vazquez-Duhalt R., 2003) y la lacasa, (Johannes, C. Majcherczyk A. 2000).

La habilidad de estas enzimas para oxidar los HPAs depende del potencial de ionización (PI) de cada compuesto.

Hidrocarburos.

Definición de Términos Básicos

Adaptación: Adquisición de factores para vivir en un entorno particular en el curso de la evolución. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Agar: El agar-agar es un solidificante que se utiliza en la mayoría de los medios de cultivo ya que no tiene valor nutritivo para los microorganismos. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Agua Destilada: Es aquella que como todo tipo de agua su composición se basa en la unidad de moléculas H2O, solo que se le han eliminado las impurezas e iones mediante la destilación. Depool, B. (2010)

Asa: Un asa siembra o asa bacteriológica es un instrumento de laboratorio tipo pinza que consta de una base de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina en aro o en punta. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Aseptado: Micelio sin esporos. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Asexual: Estado anamorfo, reproducción sin intervención de cariogamia y meiosis. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Asimilación: La habilidad para usar una fuente de carbono o nitrógeno para crecer con oxígeno. La asimilación es leída como la presencia o ausencia de crecimiento. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Aspergillus: Es un género de alrededor 200 hongos (mohos), y es ubicuo. Es un hongo filamentoso compuesto de cadenas de células llamadas hifas. Antequera, A. (2010)

Basidia: Una estructura portando sobre su superficie un número definido de basidiosporos generalmente 4. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Basidiosporo: Un esporo que nace sobre la parte exterior de una basidia que desarrolla por cadiogamia y meiosis. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Biomasa: Es el nombre dado a cualquier materia orgánica de origen reciente que haya derivado de animales y vegetales como resultado del proceso de conversión fotosintético. La energía de la biomasa deriva del material vegetal y animal, tal como madera de bosques, residuos de procesos agrícolas y forestales, y de la basura industrial, humana o animales. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Caja de Petri: Es un recipiente de vidrio consistiendo de una caja plana, circular con lados verticales y una cubierta similar, pero ligeramente más grande que se fija sobre ella; es un equipo modelo para el crecimiento de microorganismos en cultivo puro. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Carbohidratos: Son los compuestos orgánicos más abundantes de la biosfera y a su vez los más diversos. Normalmente se los encuentra en las partes estructurales de los vegetales y también en los tejidos animales, como glucosa o glucógeno. Estos sirven como fuente de energía para todas las actividades celulares vitales. Joint, W. (2003)

Cámara de Neubauer : Es un instrumento utilizado en medicina y biología para realizar el recuento de células en un medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, etc. Rodríguez, M. (2008).

Colonia: Es un grupo de individuos de la misma especie viviendo en cerrada asociación; en hongo se refiere usualmente a muchas hifas creciendo de un punto y formando un talo redondo o globoso. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Compuestos: Son sustancias formadas por la combinación de elementos. Los compuestos pueden descomponerse en los elementos por medios químicos apropiados. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Conidia: (algunas veces se conoce como conidio esporas), son no móviles y se forman en las puntas de hifas especializadas llamados conidióforos. Algunos hongos forman una sola conidía mientras que otros forman cadenas de esporas asexuales. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Conidióforo: Hifa especializada que da origen o aporta conidios. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Consorcio Microbiano: Es un grupo de diferentes especies de microorganismos que actúan conjuntamente como una comunidad, en un sistema complejo donde todos se benefician de las actividades de los demás. Medina, M. et al (2000).

Cultivo: Es el recurso didáctico más sensible y especifico, es por eso que es el método más usual, se utiliza para el crecimiento e identificación de agentes infectantes. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Densidad óptica: Es la absorción de un elemento óptico por unidad de distancia, para una longitud de onda dada. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Ecología: Ciencia enfocada en el comportamiento natural de los hongos. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Enzimas: Son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: Una enzima hace que una reacción química que es energéticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. Dávila, G. Vásquez, R. (2006).

Especie: La unidad de clasificación; un grupo de individuos estrechamente relacionados, semejando unos a otros en ciertas características. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Esporas: Espora en biología designa un mecanismo reproductivo, generalmente haploide y unicelular. La reproducción por esporas permite al mismo tiempo la dispersión y la supervivencia por largo tiempo en condiciones adversas. La espora produce un nuevo organismo al dividirse por mitosis sin fusión con otra célula, produciendo un gametofito pluricelular. La espora es parte importante de los ciclos vitales biológicos de plantas, hongos y algas. El término deriva del Griego Antiguo sp??a, semilla. Las esporas se pueden clasificar según su función, estructura, origen del ciclo vital o por su movilidad. Hanson JR. (2008)

Esporo: Unidad de reproducción y de mantenimiento de la especie de los hongos. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Estipe: El tallo de un basidiocarpo o ascosporo. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Estrategia ecológica: Ciclo de vida optimizado por la relación devector/reservorio para la supervivencia de la especie en un hábitat determinado. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Exudado: Son gotitas que se forman sobre la superficie de la colonia. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Fitoplancton: Es el conjunto de los organismos acuáticos autótrofos del plancton, que tienen capacidad fotosintética y que viven dispersos en el agua. El nombre proviene de los términos griegos, f?t?? (phyton, "planta") and p?a??t?? ("plánktos", "vagabundo" o "el que va dando tumbos") Thurman, H. (1997).

Fructificación: Cualquier estructura fungal que contenga o porte esporos o conidias. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Género: Una categoría taxonómica que incluye un número de especies. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Hábitat: Ambiente donde residen los hongos. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Hidrocarburos: Son compuestos que solo contienen dos elementos, hidrogeno y carbono. Partiendo de su estructura, se dividen en dos clases principales: Alifáticos y aromáticos.

Hifa: Elemento vegetativo de un hongo. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Inocular: Introducir en el medio, organismo por medios artificiales, una pequeña cantidad de un producto que contiene bacterias y que se toma, por ejemplo, para hacer un cultivo, una resiembra o infectar determinados animales de experimentación. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Inóculo: Adición e un producto en el sentido estricto o bacterias crecidas en un fermentador aisladas del mismo sitio donde se van a aplicar. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Micelio: Término colectivo para un grupo o masas de hifas. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Peptona: Cualquiera de las sustancias producidas por la transformación de las albúminas mediante la acción de la pepsina contenida en el jugo gástrico. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Petróleo: El petróleo es una mezcla que, se presenta en la naturaleza compuesta predominantemente de hidrocarburos en fase sólida, líquida o gaseosa; denominando al estado sólido betún natural, al líquido petróleo crudo y al gaseoso gas natural, esto a condiciones atmosféricas. Pérez, G. Zarate, P.(2010).

Proteínas: Son macromoléculas compuestas por carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. La mayoría también contienen azufre y fósforo. Las mismas están formadas por la unión de varios aminoácidos, unidos mediante enlaces peptídicos. El orden y disposición de los aminoácidos en una proteína depende del código genético, ADN, de la persona. Kerstetter, J. et al (2005).

Reino Protista: También llamado Protoctista, es el que contiene a todos aquellos organismos eucariontes que no pueden clasificarse dentro de alguno de los otros tres reinos eucarióticos: Fungi (hongos), Animalia (animales) o Plantae (plantas). En el árbol filogenético de los

organismos eucariontes, los protistas forman varios grupos monofiléticos separados, o incluyen miembros que están estrechamente emparentados con alguno de los tres reinos citados. Se les designa con nombres que han perdido valor en la ciencia biológica, pero cuyo uso sería imposible desterrar, como «algas», «protozoos» Cavalier, T. (2006).

Rhizopus: Es un género de mohos que incluyen especies cosmopolitas de hongos filamentosos hallados en el suelo, degradando frutos y vegetales, heces animales, y residuos. Zheeng, R. (1998).

Quinona: Es uno de los dos isómeros de la ciclohexanodiona o bien un derivado de los mismos. Su fórmula química es C6H4O2. Dávila, G. Vásquez, R.(2006).

Septado: Son cruces de paredes. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Septo: Un cruce de pared en una hifa. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Sustrato: Medio en el que se desarrollan una planta, un animal o un microorganismo fijo. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

CAPITULO III

Marco metodológico

Tipo de investigación

Según Fidias Arias (2006) una investigación de tipo descriptiva consiste en la caracterización de un hecho, fenómeno, individuo o grupo con el fin de establecer su estructura o comportamiento, ubicándose los resultados de este tipo de investigación en un nivel intermedio en cuanto a la profundidad de los conocimientos se refiere.

Mediante el concepto anterior, se podría decir que esta investigación es de tipo descriptiva ya que no solo consiste en la determinación de las especies fúngicas presentes en las aguas de la zona en estudio, sino también su capacidad. Además de lo antes mencionado se clasifica como investigación correlacional, ya que se tratara de establecer el comportamiento biodegradador de las especies fúngicas en relación a la concentraciones de hidrocarburos. Pérez, G. Zarate, P. (2010).

Diseño de la Investigación

La estrategia general de diseño de investigación es del tipo experimental ya que consiste en someter el objeto de estudio a variables, condiciones controladas y conocidas por el investigador para observar los resultados que cada variable ejerce sobre el objeto bajo estudio (Sabino C, 2001). En la realización de la investigación experimental se manipularon los datos obtenidos mediante la creación de condiciones de laboratorio para determinar el potencial biodegradador de la microflora fúngica, así como también su comportamiento en diferentes medios de cultivos y aguas libres de contaminantes. Tal como en este proyecto se mostraron registros de los diferentes resultados obtenidos en las pruebas de laboratorio y el estudio continúo de dichos hongos.

Población y muestra

Población

Según Chávez (1991), una población es finita cuando está conformada por menos de cien mil elementos, siendo la cantidad de especie de hongos degradadores de hidrocarburos conocidos menor a esta cantidad, razón por la cual en esta investigación se estará trabajando con una población finita.

La población objeto de esta investigación son las especies fúngicas biodegradadoras localizada en las aguas superficiales de Punta Cardón, Amuay y las aguas superficiales de la playa El Pico.

Muestreo

La muestra es un subconjunto representativo de la población, se utilizara un muestreo no probabilístico, ya que según Sampieri (1998) se tiene que este es aquel en que no sigue el proceso aleatorio, estos se caracterizan porque el investigador selecciona sus muestras siguiendo algunos criterios que le permitan realizar dicha investigación.

Para determinar la cantidad de muestreo para este trabajo se tomo en cuenta la cantidad de kilómetros de costa en la zona y los sectores donde se observaba posible contaminación por hidrocarburos, a partir de allí se determinaron por dos estaciones con 4 puntos de muestreo para cada zona (Punta Cardón y Amuay) y otra estación con un solo punto en la playa El Pico como zona fuera del área de influencia.

Sistema de Variables

Variable Independiente; medios de cultivo, condiciones de temperatura, pH, concentración de antraceno

Variable Dependiente; metabolización del antraceno.

Se establecieron las variable de esta manera debido a que para que se observe la metabolización del antraceno (Variable Dependiente), se necesitas que los hongos se desarrollen o crezcan en ambientes que los favorezcan como las temperaturas cálidas donde su velocidad de crecimiento es mayor que en bajas temperaturas y en pH básicos, además de la capacidad de contaminante (antraceno) que puedan soportar.

Instrumentos y técnicas de recolección de datos

Loa valores de temperatura y pH se midieron en el campo, mientras que el oxigeno disuelto, salinidad, conductividad, sólidos en suspensión y sólidos totales fueron calculados a través de las normas COVENIN para aguas. Los valores para determinar las concentraciones de antraceno se realizaron a través de espectrofotometría U.V.

Entre las técnicas utilizadas para la recolección de datos se encuentran la revisión bibliográfica de apuntes escritos tales como revistas, patentes, artículos científicos y textos especializados, así como también trabajos de investigación y artículos publicados en Internet, el principal instrumentos de recolección de datos son las tablas.

Fases de la Investigación

Fase I: Toma de Muestras

Se colectaron 9 muestras, determinadas de esta manera debido a los kilómetros de costa que abarca cada zona tomando las muestras en las cercanías a las refinerías, donde se observaba posible contaminación con hidrocarburo, dichas muestra fueron repartidas en, 4 estaciones para la zona sur de playa de Amuay y 4 estaciones para la zona norte en Punta Cardón, y una estación de muestreo en playa el pico como zona no influenciada. Se realizaron dos campañas de muestreo en las cuales se tomaron 27 muestras por campaña para un gran total de 91 muestras, las cuales fueron separadas en tres grupos, uno para los análisis fúngicos, la otra para espectrofotometría, dichas muestras fueron colectadas en recipientes de vidrios de 475 ml previamente esterilizados en un autoclave (ver anexo #13 pág. 86) a 15 Psig y 121ºC durante 30 minutos, protegidos con tapas seguras y recubiertas con papel estéril y la tercera para los análisis fisicoquímicos, las cuales se colectaron en recipientes de plástico de color ámbar de 1litro previamente curadas. Para visualizar mejor esta información pueden observar la figura #07, y los anexos del 1 al 10 ubicados en la páginas desde la 80 a la 84.

El tipo de muestreo es simple con un patrón de muestreo de transepto, con una frecuencia de una vez por semana durante dos (2) semanas, dichas muestras se tomaron en aguas superficiales, debido a que la mayoría de los hidrocarburos se concentran en la superficie del agua formando una película de aceite que impide el proceso fotosintético el cual desoxigena el agua y altera el ecosistema. Se cuantificaron, la cantidad de hidrocarburos que se encontraron en dichas zonas, para lo que se establecieron dos (2) tipos de muestras: una (1) la, muestra problema y la segunda (2) el blanco que corresponde a una muestra que se tomo fuera del área de influencia del sitio en estudio.

Con la finalidad de darle mayor solides al estudio, y para determinar el ambiente en viven las especies fúngicas, no solo se analizó la posible presencia de aromáticos policíclicos, sino que también se evaluaron los siguientes parámetros físicos y químicos: temperatura a la cual se colectaron las muestras, el pH del ambiente marino en el momento de la selección muestrearía, oxigeno disuelto, sólidos totales en suspensión así como el contenido de salinidad.

Figura # 07 Ubicación geográfica del área de muestreo.

Fase II: Identificación y Cuantificación de las especies fúngicas provenientes de las muestras colectadas

En esta fase se preparó Agar Sabouraud con 5 gramos de peptona, 20 gramos de glucosa, 20 gramos de agar pesados en una balanza (ver anexo #12 pág.) en 1 litro de agua destilada. Se esterilizaron a 15 libras de presión 121 grados centígrados por 15 minutos. Se prepararon un total de 18 placas de Petri, 9 para cada muestreo, a las cuales se le agregaron 15 ml de la solución preparada, como las muestras fueron por triplicado a las placas se les realizó por el lado reverso una división de tres partes iguales, donde se sembraron dichas muestras de agua colectadas en las zonas de estudio.

Al transcurrir una semana se observó crecimiento de microorganismos entre ellos hongos los cuales se aislaron en tubos de ensayos con la solución preparada de agar Sabouraud en cuñas, en una campana de flujo laminar (ver anexo#11, pág. 85)

Después de una semana se aplico el método de Riddel: se tomó una placa de Petri por cada hongo, dentro de esta placa se colocó una varilla de vidrio en forma de U, y encima de esta una lámina porta objeto con un cuadrito de 1cm2 de agar Sabouraud al cual se le inóculo el hongo en estudio, luego se colocó una lámina cubre objeto y para proporcionarle humedad y se facilite la esporulación se le agregaron 8cc de agua esterilizada y se tapó. Estas placas se incubaron a temperatura ambiente hasta que ocurrió la esporulación, allí se tomó la lámina con el hongo y se identificó con el microscopio electrónico del laboratorio LIADSA/UNEFM.

En esta fase se llevo a cabo el crecimiento de los hongos, según el método descrito por Klich y Pitt (1988), a partir de las muestras elegidas, para luego identificar las características macroscópicas y los parámetros fisicoquímicos.

Los resultados obtenidos se trataron aplicando estadística descriptiva, con un modelo aleatorio, como la T de Student

Fase III: Cuantificación de la capacidad biodegradadora de las especies fúngicas identificadas en el estudio y observar su comportamiento durante 20 días

De las cepas encontradas se seleccionaron tres, y se sembraron en cuña cuatro botellas de vidrio transparente de 1 litro previamente esterilizadas, con 120 ml de Agar de papa para cada hongo, siendo en total 12 botellas.

Para la realización del ensayo de biorremediación se colectaron 88 botellas de vidrio transparentes de 250 ml, donde 24 de ellas se les agregó 20 ml de Czapek líquido con sacarosa, a 32 botellas 20 ml de Czapek liquido con 150 ppm de antraceno como fuente de carbono y otras 32 botellas con 20 ml de Czapek liquido y con 300 ppm de antraceno, luego se procedió a esterilizar todas estas botellas.

Una vez hecho esto se procedió a sacar todas las esporas de los hongos sembrados en las botellas de 1 litro, agregándole 25 ml de agua destilada y estéril a dichas botellas para raspar toda la cuña de hongo visible, de allí se procedió a realizar el respectivo conteo de esporas usando la cámara de Neubauer( ver anexos #14 y 15 en la pág. 86, 87) , obteniendo valores entre 106 y 108 para cada hongo, tomando en cuenta que los resultados fueron favorables, se tomaron 2 ml de estas esporas para inocularlas en las botellas de 250 ml ya mencionadas anteriormente exceptuando 16 que eran el blanco en las diferentes concentraciones de antraceno

Dichas botellas se dejaron en observación durante 20 días, donde cada 5 días se destapaban 22 para determinar la cantidad de antraceno y el peso de los hongos, estas 22 botellas equivalen a 6 botellas de Czapek con 150 ppm 2 por cada hongo, 6 botellas de Czapek con 300 ppm 2 por cada hongo, 6 botellas con Czapek liquido y sacarosa con el fin de verificar que los hongos estuvieran vivos, y las 4 botellas restantes son los blancos debidos a que 2 llevan Czapek liquido con 150 ppm de antraceno sin hongo y las otras 2 llevan Czapek liquido con 300 ppm de antraceno sin hongo. observar anexo #25 y 26 en la pág. 92

A todas las botellas se les realizaron técnicas analíticas con el fin de determinar la concentración química de hidrocarburos totales (THs) presentes en las muestras y sometida a un proceso de extracción líquido – líquido con n- hexano agregándole 15 ml por cada botella con la finalidad de extraer el antraceno y leer el extracto en el espectrofotómetro y el líquido restante se filtró para determinar la masa fúngica. observar anexo #27 y 28 en la pág. 93

Nota: El medio Czapek líquido fue preparado con agua de mar.

Fase IV: Simular a nivel de laboratorio muestras contaminadas con antraceno y exponer las especies fúngicas seleccionadas anteriormente a dichas muestras

En esta fase se colectaron cuatro (4) botellas de vidrio de 2 litros, las cuales fueron preparadas para la realización del simulacro por alrededor de dos meses y medio, en dos botellas se le agregaron ½ litro de agua de mar con 150 ppm de antraceno y una de ellas se le agrego 50 ml de un consorcio de los 3 hongos ya seleccionados. A las 2 botellas restantes se les agregaron ½ litro de agua de mar con 300 ppm de antraceno y una de ellas se le agrego 50 ml de un consorcio de los 3 hongos seleccionado.

Al transcurrir los dos ( 2) meses y medio se procedió a realizar la extracción liquido – liquido con n- hexano con el fin de extraer el antraceno y leer el extracto en el espectrofotómetro y el líquido restante se filtró para determinar la masa fúngica.

CAPITULO IV

Resultados y análisis

Determinación de las características fisicoquímico in situ

Los puntos de muestreo seleccionados en Punta Cardón, se identificaron como P1, P2, P3, P4, los de Amuay como A1, A2, A3, A4 y en la playa El Pico como MB, estos resultados de los parámetros fisicoquímicos se pueden observar en la tabla numero 1y 2.

Tabla Nº 4 Determinación de las características fisicoquímico in situ (Primer Muestreo)

Fuente: Cáceres J. Lara H. (2011)

Tabla N° 5 Determinación de las características fisicoquímico in situ (Segundo Muestreo)

Fuente: Cáceres J. Lara H. (2011)

Con los valores observados en la tabla numero 4 y 5 correspondientes al primer y segundo muestreo respectivamente, los parámetros fisicoquímicos determinados in situ, se puede decir que estos valores son actos para el crecimiento de la microflora fúngica debido a que estas tienen un crecimiento acelerado en temperaturas cálidas y pH básicos.

Determinación de las características fisicoquímicas en el Laboratorio

Parte del volumen de las muestras colectadas fueron analizadas en el laboratorio químico CICBA/UNEFM para determinar el contenido de oxigeno disuelto, sólidos totales, sólidos en suspensión, conductividad, salinidad, estos resultados se pueden observar en las tablas número 6 y 7

Tabla Nº 6 Características fisicoquímicas en el Laboratorio

(Primer muestreo)

Fuente: Cáceres J. Lara H. (2011)

Tabla Nº 7 Características fisicoquímicas en el Laboratorio

(Segundo muestreo)

Fuente: Cáceres J. Lara H. (2011)

En términos generales los valores arrojados con comunes, y al no tener una norma para compararlos se puede decir que estos parámetros son aceptables, existe buena presencia de oxigeno vital para la vida marina entre ellos loa microorganismos fúngicos, donde los mismos toman la salinidad como nutrientes para su sobrevivencia.

Aislamiento de las especies fúngicas presentes en el agua

En la tabla Nº 8, se presenta a continuación el conteo de colonias de hongos aislados en los dos muestreos de agua colectada en la Costa Oeste de la Península de Paraguaná.

Tabla N° 8. Unidades Formadoras de Colonias (UFC)

Fuente: Cáceres J. Lara H. (2011)

En el primer muestreo las unidades formadoras de colonias fueron más abundantes que en el segundo debido a que en éste ultimo algunas de las placas sembradas con agua de mar para el aislamiento fueron contaminadas por abundantes bacterias que impidieron el crecimiento de hongos como se puede observar en la tabla anterior en el punto A2

Identificación de las especies fúngicas encontradas

Las especies fúngicas encontradas en las muestras de agua colectadas de los 9 puntos de estudio se identificaron macroscópicamente por observación directa y microscópicamente por medio del estudio morfológico de micro-cultivos, como se pueden observar en la tabla Nº 6.

Tabla N° 9. Características macroscópicas y microscópicas de las especies fúngicas

Fuente: Cáceres J. Lara H. (2011)

En la tabla numero 9 se puede observar que de los 27 hongos aislados, 14 son del genero Aspergillus de especie níger, 9 del genero Rhizopus de especie ssp y 4 del genero Aspergillus y de especie flavus, predominando en un 51,85% el Aspergillus níger .