Protocolo comparativo de purificación de la enzima glutamil

Introducción histórica

La enzima ?-glutamil-transpeptidasa (GGT ó GGTP) fue descrita en riñón de oveja por primera vez en 1950 (Hanes et al). Según este grupo investigador, dicha enzima era capaz de catalizar la transpeptidación de grupos ?-glutamil en aceptores de aminoácidos y péptidos, en presencia de sustrato. Con posterioridad se demostró que el sustrato de hidrólisis era paulatinamente inhibido conforme progresaba la transpeptidación, al incrementarse la concentración de dichos aceptores. La ?-glutamil transpeptidasa cataliza la reacción de transferencia de los grupos ?-glutamil del glutathión y de otros péptidos ?-glutamil a receptores tales como aminoácidos, formando así compuestos ?-glutamil. Se trata de una transferasa localizada en la membrana celular que está presente en la mayoría de los órganos parenquimatosos.

Una enzima con características similares fue también identificada en 1960 a partir de tejidos humanos, por Orlowski y Szewszuk. En esa misma década fue descrita en diferentes órganos, tejidos y fluidos de animales de laboratorio, como hígado, riñón, páncreas, pulmón, bilis, orina, suero, incluso en los eritrocitos (Goldbarg et al, 1963; Orlowski y Meister, 1965). Aunque es similar su distribución orgánica en los diferentes animales, no es exactamente igual, y tiende a encontrarse con preferencia en determinados tejidos dependiendo de la especie (Braun et al, 1983). Aunque su actividad máxima parece ser renal, ello no es óbice para que clínicamente su determinación sea en casos de enfermedad hepática, de ahí que sea la enzima de mayor sensibilidad para test hepáticos.

La actividad de la enzima en el suero de pacientes con daño hepático fue investigada por Szczeklin et al en 1961. Sus hallazgos fueron corroborados por el grupo de Pineda, Goldbarg y Rutenburg, atribuyéndole importancia en el diagnóstico de la enfermedad hepatobiliar pancreática y confirmando la elevación de la enzima en el suero de pacientes caracterizados por un cuadro con afección hepatobiliar y pancreática (Rutenburg et al, 1963); estos completaron el estudio realizando el diagnóstico de la patología mediante un examen microscópico tisular. Aparte, esta enzima fue evaluada en relación con episodios de daño isquémico cardiaco post-infarto (Agostini et al, 1965; Hedworth-Whitty et al, 1967; Ravens et al, 1969).

Mediante la identificación de esta enzima en suero se puede describir la obstrucción hepática y diferenciarla de un proceso meramente inflamatorio, en un caso de patología infecciosa (Aronsen et al, 1965) o neoplasia (Aronsen et al, 1970). Villa et al (1966), pronosticaron la actividad de la enzima en concordancia con sus niveles séricos en dos enfermedades hepáticas: a) la toxicidad hepática debida a tetracloruro de carbono producía un leve aumento de ésta; b) en la hepatitis viral, pese a que se halla poco incrementada la enzima en la primera etapa de la enfermedad, alcanza un valor máximo durante la fase de recuperación clínica.

Es importante recordar que, al ser una enzima presente en la membrana del hepatocito, se eleva antes que otras en caso de daño hepático. Según Zein et al (1970), no se trata de una enzima específica de hígado sensu stricto, es útil en alteraciones derivadas de la ingesta de alcohol, y es confirmatoria de hepatomas primarios y secundarios, en ausencia de ictericia.

Breve descripción de la enzima. Interés en el diagnóstico de patologías

La ?-glutamil-transpeptidasa es una enzima transferasa situada en la membrana celular, presente en la mayoría de los órganos de tipo parenquimatoso; es más abundante en hígado, vías biliares y páncreas. La deficiencia de esta enzima se caracteriza por el aumento de la concentración de glutathión en plasma y orina. Al igual que la fosfatasa alcalina sérica (FAS), sirve de indicador en casos de colestasia. Su función es la transferencia de grupos ?-glutamil entre péptidos (p.ej. de glutathión a otros péptidos o aminoácidos).

Como ya se ha dicho con anterioridad, la GGT está presente en las membranas celulares de muchos tejidos, incluyendo los riñones, el conducto biliar, páncreas, hígado, bazo, corazón, cerebro, y vesículas seminales, como ocurre también con las transaminasas y la lactato-deshidrogenasa (LDH). Está involucrada en la transferencia de aminoácidos a través de la membrana celular y en el metabolismo de los leucotrienos. La enzima juega un papel clave en el ciclo de la ?-glutamil, una vía para la síntesis y degradación de glutathión y de destosificación de drogas y xenobióticos. Su papel principal radica en el metabolismo del glutathión mediante la transferencia de la fracción ?-glutamil a una variedad de moléculas aceptoras como el agua, algunos L-aminoácidos y péptidos, dejando el producto cisteína para preservar la homeostasis intracelular del estrés oxidativo. Dicha reacción se resume:

(5-L-glutamil)-péptido + aminoácido ? péptido + 5-L-glutamil

El rango normal en humanos va desde 0 a 30 UI/ml. Sus niveles son similares en niños y adultos, y no se ven afectados durante el embarazo. Si tenemos en cuenta otras especies, los valores son diferentes: en bovinos está entre 20 y 27 UI/ml; en perro entre 5-6 UL/ml; en caballo entre 15-17 UI/ml, y en pequeños rumiantes entre 32-35 UI/ml.

Su principal valor está en otorgarle especificidad (origen hepático) a las elevaciones de fosfatasas alcalinas. Sin embargo, hay otras causas que pueden producir elevaciones de GGT en ausencia de enfermedad hepática, como el consumo de ciertos medicamentos (p. ej. anticonvulsivantes) y el consumo de alcohol. En ocasiones se han detectado elevaciones esporádicas de GGT en pacientes diabéticos.

La GGT tiene varios usos como marcador diagnóstico en la clínica. Unos valores séricos elevados pueden ser evidentes en enfermedades hepáticas, pancreáticas y biliares. Su incremento, unido al de la FAS sugiere una alteración a nivel biliar; no se ha concretado aún cuál de las dos es más sensible a daño colestásico. La utilidad de la elevación de la GGT frente al de FAS yace en descartar una patología a nivel óseo.

La GGT también se eleva posteriormente al consumo excesivo de alcohol; una elevación aislada y desproporcionada en comparación con el aumento de otras enzimas hepáticas puede indicar abuso de alcohol o hepatitis alcohólica. El aumento puede permanecer incluso 3-4 semanas después de la ingesta. El alcohol puede aumentar la síntesis de GGT vía inducción microsomal o la salida de la enzima directamente desde los hepatocitos.

Hepatitis alcohólica, evolución de varias enzimas, días 0-40 [Whitfield et al, 1972].

A modo de resumen, un incremento en los valores de la GGT está relacionado con:- Tóxicos hepáticos: en casos leves aumenta en pequeña cuantía; en cuadros agudos presenta una elevación superior a la que aparece en hepatitis crónicas y es similar al nivel que habría de transaminasas.

– Hepatitis vírica aguda: la GGT aumenta menos que las transaminasas, aunque es la última en volver a sus niveles originales normales.

– Hepatitis crónica: se encuentra con una elevación superior al de las transaminasas.

– Ictericia obstructiva: incremento más alto y rápido que el de leucin-aminopeptidasa (LAP) y FAS.

– Metástasis hepática: directamente proporcional a su extensión y evolución. La elevación puede ser moderada a alta.

– Pancreatitis aguda y crónica: sobretodo al obstruir las vías biliares. También en casos de nefrosis lipoidea y cáncer renal.

– Infarto de miocardio: a partir del 4º-5º día se ve incrementada, estableciendo un pico máximo el 10º día post-isquemia.

Trabajos escogidos. Comentario crítico

– WU, Q.; XU, H.; ZHANG, L.; YAO, J. y OUYANG, P. (2006). Production, purification and properties of ?-glutamyl-transpeptidase from a newly isolated Bacillus subtilis NX-2. J Mol Cat B Enz 43, 113-117.

– SHUAI, Y.; ZHANG, T.; MU, W. y JIANG, B. (2011). Purification and characterization of ?-glutamyl-transpeptidase from Bacillus subtilis SK11.004. J Agric Food Chem 59, 6233-6238.

El proceso de purificación y aislamiento de la enzima GGT varía con dependencia de numerosas variables. Entre ellas estaría el organismo del que se parte para realizar la extracción (bacteria, hongo, etc.). Por supuesto hay que valorar los conocimientos existentes en la actualidad y los de hace cincuenta años, no es lo mismo analizar un trabajo desarrollado en este sentido en los años sesenta, como el de Orlowski y Meister (1965). De ahí que el presente trabajo estudio se base en el análisis de la enzima GGT a partir de una bacteria concreta (Bacillus subtilis) y los trabajos de partida sean relativamente recientes (2006 y 2011).

Las bacterias del género Bacillus spp. presentan extracelularmente la enzima GGT. En el trabajo de Wu et al (2006) se partió de muestras de tierra con antecedentes de presencia de B. subtilis. Para que estas bacterias produjeran la enzima, se les suministró un medio de cultivo enriquecido con glucosa, levadura, extracto de maíz triturado, sulfato magnésico y fosfato dipotásico, y se incubó en aerobiosis a 32ºC y agitación durante 38 h. En cambio, en el trabajo de Shuai et al (2011) no se obtuvo el concentrado bacteriano del suelo, sino de un macerado de gambas, como ya hicieron en un estudio anterior (Shuai et al, 2010); el medio de cultivo también difiere del utilizado por los primeros investigadores (tiene sacarosa en lugar de glucosa, triptona, y carece de levadura, el resto es idéntico). La incubación se efectuó igualmente en aerobiosis, pero a 37ºC y en agitación sólo durante 16 h.

En ambos artículos se referenciaron una serie de pasos para la purificación de la enzima y posterior valoración proteica. En el de Wu et al (2006), tras centrifugar el cultivo obtenido a 10,000 rpm durante 20 min a 4ºC, se procedió a precipitar el sobrenadante mediante la adición del mismo volumen de acetona durante 10 min a 0ºC. Posteriormente centrifugó durante 30 min a 4ºC a una velocidad de 8,000 rpm, disolviendo el nuevo precipitado en una solución buffer Tris-ácido clorhídrico con sulfato amónico, a pH 8. Lo que quedó insoluble fue retirado tras otra centrifugación. Mientras este primer trabajo separaba claramente las etapas de purificación, el de Shuai et al (2011) englobó todo el proceso en un punto del apartado "Materiales y métodos". Las diferencias entre este segundo trabajo y el de Wu et al (2006), en cuanto a la primera fase de purificación enzimática, estriban en detalles como la centrifugación del cultivo (30 min, en lugar de 20 min) a la vez que utiliza una malla de filtración de 0.45 µm, el nuevo producto lo precipita también con sulfato amónico (al 60-80%) y luego añade el buffer Tris-ácido clorhídrico, tras centrifugar 20 min a 10,000 rpm. Finalmente deja dializando el producto contra esta solución buffer toda la noche a 4ºC, en vez de centrifugar.

En la siguiente fase, ambos estudios purificaron el extracto crudo enzimático con columnas de sepharosa: el del año 2006 con CL4B-Sepharose pre-equilibradas con buffer Tris-ácido clorhídrico y sulfato amónico; el de 2011 utilizó DEAE-Sepharose con buffer Tris-ácido clorhídrico suplementado con cloruro sódico. El de Wu et al (2006) procedió a lavar las columnas con el mismo buffer y resuspendió las proteínas que habían quedado unidas a la membrana de sepharosa con una solución gradiente de sulfato amónico añadida al mencionado buffer (Tris-ácido clorhídrico). El de Shuai et al (2011) concentra las fracciones con GGT mediante una centrifugación a alta velocidad en una membrana Amicon PM-10 y luego resuspende el producto obtenido en una columna Superdex 75 con buffer Tris-ácido clorhídrico, a 5ºC. Mediante el protocolo seguido por este segundo trabajo se puede hallar la masa molecular de la enzima utilizando la columna Superdex 75, que ha sido calibrada previamente con las proteínas más frecuentes a modo de referencia (albúmina sérica bovina -BSA-, ovoalbúmina, ribonucleasa, aprotinina y vitamina B12). El azul dextrano, inocuo, se une a las fracciones vacías de la columna a modo de cemento para facilitar la reacción. Las fracciones con actividad GGT fueron recogidas y analizadas mediante electroforesis (SDS-PAGE) como recoge otro estudio previo (Laemmli, 1970), con una especial modificación para la GGT (Albert et al, 1961). En el trabajo de Wu et al (2006), la fracción inicial obtenida en las columnas de sepharosa se purificó mediante la técnica de cromatografía de intercambio iónico en otra nueva columna similar (DEAE-Sepharose), pre-equilibrada con el mismo buffer Tris-ácido clorhídrico. Se efectúa un primer lavado con el buffer para luego establecer un gradiente de disolución con agua Milli-Q y el buffer (suplementado con cloruro sódico) en cinco fases, es decir, en un principio se añade exclusivamente agua Milli-Q, luego una solución con un 80% de agua Milli-Q y un 20% del buffer, y así hasta llegar, en fracciones del 20%, hasta el 100% del buffer, en el que se resuspendió el producto con actividad ?-glutamil. El extracto purificado fue analizado igualmente con electroforesis (SDS-PAGE), pero basándose en otro trabajo anterior (Weber y Osborn, 1969).

En el trabajo primero (2006), para valorar la actividad de la GGT, hace referencia a un estudio previo (Meister et al, 1981), en el que se procede a incubar el producto obtenido con buffer Tris-ácido clorhídrico, ?-glutamil-?-nitroanilida y glicilglicina, a 37ºC durante 30 min, parando la reacción tras añadir ácido clorhídrico. La densidad óptica fue medida a 410 nm y se definió una unidad de enzima como la cantidad de la misma que liberaba 1 µmol/min de ?-nitroanilina de ?-glutamil-?-nitroanilida a través de la reacción de transpeptidación. El segundo trabajo (2011), reseña el artículo previo realizado por el mismo grupo investigador donde también se explicaba el método para determinar la actividad enzimática (Shuai et al, 2010). La mezcla que se añade al producto obtenido es muy similar a la que describe el trabajo de Wu et al (2006), tiene ?-glutamil-?-nitroanilida, glicilglicina, pero el buffer está compuesto por borato e hidróxido sódico. También lo incuba a 37ºC durante 30 min y detiene la reacción con ácido clorhídrico. La absorbancia y la definición de la unidad enzimática las evalúa de un modo idéntico al trabajo de Wu et al (2006). En cuanto a la concentración proteica, Shuai et al (2011) realiza el método de Lowry (Lowry et al, 1951), mientras que Wu et al (2006) hace lo propio con el método de Bradford, ambos con el mismo estándar, la BSA (Bradford, 1976).

Los resultados obtenidos en ambos artículos, por etapas y esquemáticamente, fueron:

Wu et al (2006)

Shuai et al (2011)

Protocolo de purificación de la enzima GGT

1.- Organismo y muestras de partida: Bacillus subtilis – muestreo efectuado en terrenos con antecedentes de dicha bacteria.

2.- Medio de cultivo: medio RPMI suplementado con L-Glutamina.

3.- Procedimiento de incubación: en agitación (60 rpm) en atmósfera con oxígeno (aerobiosis) a 37ºC durante 24 h.

4.- Centrifugación del cultivo obtenido a 10,000 rpm durante 30 min a 4ºC.

5.- Precipitación del sobrenadante con acetona durante 10 min a 0ºC.

6.- Centrifugación a 8,000 rpm durante 30 min, a temperatura de 4ºC.

7.- Adición de solución buffer 0.05 mol/l de Tris-ácido clorhídrico suplementada con 1 mol/l de sulfato amónico (70%), a pH 8. Dejar dializando toda la noche a 4ºC frente al buffer con sulfato amónico.

8.- Purificación del extracto crudo enzimático con columnas de sepharosa (Hiprep DEAE-Sepharose FF 16/10) con solución buffer 50 mM de Tris-ácido clorhídrico + cloruro sódico.

9.- Centrifugación a 15,000 rpm del producto obtenido en membrana Amicon PM-10 y resuspensión en columna Superdex 75 10/300 GL, con 50 mM Tris-ácido clorhídrico.

10.- Recolección de las fracciones con actividad GGT y análisis mediante electroforesis (SDS-PAGE) en gel de acrilamida (12%) durante 50 min a 20 mA.

11.- Valoración de la actividad de la GGT, a partir del producto con la fracción de GGT, al que se añade 50 mmol/l de solución buffer Tris-ácido clorhídrico (pH 8), 5 mmol/l de ?-glutamil-?-nitroanilida y 20 mmol/l de glicilglicina. Se deja incubando a 37ºC durante 30 min, y se detiene la reacción tras adicionar 0.1 mol/l de ácido clorhídrico.

12.- Medición de la absorbancia mediante espectrofotometría a 410 nm.

13.- Valoración de la concentración proteica mediante el método de Bradford en una placa de ELISA con 96 pocillos, tras realizar una curva patrón con BSA diluida a diversas concentraciones (0, 20%, 40%, 60%, 80% y 100%) en buffer fosfato salino (PBS). Del mismo modo, dilución del producto enzimático GGT en PBS a concentraciones seriadas (20%, 60% y 100%). Tanto la curva patrón como las muestras problema deben analizarse por partida doble.

Aquí se ve un ejemplo:

14.- Medición de la densidad óptica mediante espetrofotometría a 595 nm.

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Autor:

Isabel Mauriz Turrado

Facultad de Ciencias Biológicas y Ambientales. Universidad de León.

Martha Gutiérrez Ordás

Escuela Universitaria de Trabajo Social. Universidad de León.

José Manuel Martínez Pérez

Departamento de Sanidad Animal. Instituto de Ganadería de Montaña (León).