Practicas de microbiologia

Objetivos

El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiología y permitir la observación experimental de los conceptos aprendidos durante las clases de teoría.

Normas de seguridad

Aunque los microorganismos que vamos a manejar no son patógenos habituales, su ingestión masiva o el contacto con heridas puede provocar diversos problemas. Por ello hay que seguir unas cuantas normas de seguridad:

1) No se puede fumar ni comer en el laboratorio

2) Es obligatorio la utilización de la bata

3) La ropa y los objetos personales no deben mantenerse cerca de las zonas de trabajo

4) Al comenzar las prácticas conviene colocar un papel de filtro sobre la zona de manipulación, y retirarlo al terminar el día.

5) Lavarse las manos cuidadosamente antes de salir del laboratorio

CALIFICACIÓN

Cada alumno deberá completar un cuaderno donde anotará con detalle los fundamentos de la práctica correspondiente, los resultados obtenidos y la explicación de éstos.

ORGANIZACION

Las prácticas se desarrollarán por parejas en dos periodos de una semana cada uno. El programa diario que se describe a continuación puede ser sujeto a modificaciones dependiendo del calendario concreto de cada grupo.

Abreviaturas. An.AguasI, II, III, Rdo.) Análisis de aguas y resultados; Antib.) Antibiosis; Rdo.Antib) Resultado antibiosis; Conjug.I,II, Rdo.) Conjugación y resultados; CrecBact.) Crecimiento bacteriano; OMac) Observación macroscópica: OMicI) Observación por contraste de fases y tinción de Gram; RdoBacProb) Resultados de identificación de la bacteria problema. OMicII) Tinción de esporas; TVirus) Titulación de un virus bacteriófago; API) Ensayos bioquímicos estandarizados. Transduc) Transducción. AnYogur) Análisis microscópico de yogur.

Material por pareja

A cada pareja se le asignará una clave consistente en el número de la mesa seguido de una letra de la A a la D y dispondrá de una taquilla numerada. En esa taquilla debe de encontrarse el material para prácticas que se indica en el listado, y es responsabilidad de cada pareja comprobar su estado al principio de la práctica y asegurarse de que queda completo una vez concluidas éstas. Diariamente hay que abrir la taquilla con la llave localizada en el tablero junto a las pizarras ( ¡no dejeis las llaves puestas en los candados porque se doblan!).

Equipo:

Un trípode – Rejilla para trípode

Un cristalizador – Un puente de tinción

Unas pinzas – Un asa de siembra

Un rotulador – Un Microscopio

Una Propipeta

Colección de colorantes y reactivos.

Cristal violeta Lugol

Safranina Azul de metileno

Verde malaquita Etanol

Frasco lavador con agua – Aceite de inmersión.

——————————————

Medios de cultivo

Para empezar a trabajar en cualquier laboratorio de Microbiología se requiere disponer de una serie de medios de cultivo estériles. Aunque se darán ya preparados por falta de tiempo, resulta necesario conocer los métodos de preparación y esterilización utilizados habitualmente en el laboratorio.

Los medios de cultivo que vamos a utilizar son indefinidos o naturales, porque en su preparación siempre se incluye algún extracto de composición química desconocida. El más utilizado, el caldo común o su versión solidificada con agar, es un medio que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias que se van a utilizar en estas prácticas, pero también se emplean otros que contienen inhibidores semiespecíficos como el agar de McConkey, cuyas sales biliares inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas. En algunos casos, se utilizarán medios que contienen componentes tales como indicadores de pH que cambian de color cuando el microorganismo realiza una actividad metabólica preferente sobre substratos concretos (Ej: fermentación).

Preparación de medios de cultivo:

Caldo común. Composición por litro.

Extracto de carne 3 g

Peptona bacteriológica 10 g

Cloruro sódico 5 g

Para prepararlo, se añaden los distintos componentes en un matraz de dos litros, se disuelven en agua, se ajusta el pH a 7.2-7.4 (en nuestro caso no es necesario porque el pH queda ajustado directamente) y se lleva al volumen final correspondiente. Posteriormente, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 5 ml/tubo. El resto del medio se reparte en matraces con 50 y 75 ml. Los recipientes se aíslan con tapones metálicos o de algodón graso envuelto en gasa y se esterilizan a 1 atm de sobrepresión durante 20 minutos.

Agar nutritivo. La composición es la misma que la del caldo común, pero se añade antes de esterilizar 15 g de agar por litro, disolviéndolo durante la esterilización. Cuando aún está caliente, se agita para hacer la disolución de agar homogénea y se extiende en placas (a 45ºC) y en tubos, que seguidamente son inclinados para obtener una superficie más extensa.

Medio base para la fermentación de azúcares. Inicialmente se prepara un medio base pobre en aminoácidos de la siguiente composición por litro:

Extracto de carne 1 g

Peptona bacteriológica 10 g

Cloruro sódico 5 g

Una vez disueltos los componentes, se ajusta el pH a 7 y se añaden 2 ml de solución de púrpura de bromocresol (PBC: 1.6 g en 100 ml de etanol al 45%. Se disuelve inicialmente en etanol al 95 y posteriormente se diluye con agua) por litro. Este es un indicador de pH que vira a amarillo por debajo de pH 5.2, por lo que permite la detección de la producción de ácido en el medio. El medio se reparte en tres volúmenes iguales a los que se añade 10 g por litro de glucosa, lactosa (Gal-Glu) o sacarosa (Glu-Fru). Una vez disuelto, se reparten, utilizando una jeringa hasta acabar con todo el volumen, 7 ml/tubo, en el que previamente se ha introducido una campana Durham, pequeño tubo de ensayo que se dispone en posición invertida para detectar la presencia de gases. El medio ha de ocupar completamente el interior de estas campanas para poder detectar posteriormente el desprendimiento de gases en la fermentación. (No olvidar marcar cada tubo con la inicial del azúcar que contenga). Una vez taponados, se esterilizan a 0.5 atm de sobrepresión durante 20 min.

El resto de los medios utilizados ya vienen premezclados en forma deshidratada y listos para su reconstitución. Las principales características a destacar de su composición son:

Agar de McConkey. Contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro) que vira hacia rojo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada. Además, contiene sales biliares que inhiben el crecimiento de muchas bacterias, especialmente Gram positivas.

Agar al verde brillante (AVB). Contiene lactosa, sacarosa, una elevada concentración de aminoácidos, verde brillante como inhibidor de crecimiento de muchos fermentadores, y rojo de fenol como indicador de pH. Los oxidativos producen amonio a partir de los aminoácidos y generan color rosa. Los fermentativos o no crecen o dan color amarillo.

Agar de tres azúcares e hierro (TSI). Contiene lactosa, sacarosa y glucosa, citrato férrico y tiosulfato de sodio, elevada concentración de aminoácidos y rojo fenol como indicador. Se prepara en tubos inclinados pero de mucho volumen. Las bacterias se inoculan en picadura (microaerobiosis) y extensión superficial. Las fermentadoras generan color amarillo por acidificación y las oxidativas rosa sobre la superficie (basificación). Las sulfitoreductoras dan sulfuro de hierro que resulta en precipitados negros en la zona anaeróbica.

Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB). Se trata de un medio rico lactosado con dos colorantes, eosina y azul de metileno, que también funcionan como inhibidores del crecimiento de Gram positivos. En este medio E.coli crece como colonias negras con brillo verde metálico.

Caldo de urea-Indol. Es un medio muy pobre y bastante tamponado que permite determinar la presencia de la actividad ureasa y la producción de indol a partir de triptófano. En estas prácticas se empleará sólamente para determinar la presencia de actividad ureasa, cuya actividad provoca la degradación de la urea presente en el medio (un 2% p/v) a CO2 y Amonio, con la consiguinte alcalinización. Este cambio de pH es detectado por cambio de color del indicador azul de bromotimol desdee el verde original al azul intenso. Si se quisiera determinar la producción de indol bastaría añadir al medio tras la incubación 0.3 ml el reactivo de Kovacs (reactivo IND del ensayo API), siendo positiva si se produce cambio de color al rojo..

Agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe). Se trata de un medio natural muy rico que contiene polisorbato, acetato, magnesio y manganeso que actúan como factores de crecimiento para muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuará en medios microaerófilos empleando jarras para el cultivo de organismos anaeróbicos y un sistema comercial para la eliminación del oxígeno.

Esterilización

La presencia de microorganismos en todos los medios ambientales hace imprescindible que para estudiar una bacteria determinada sea necesario destruir todas aquellas que pudieran encontrarse contaminando los medios o los instrumentos de trabajo. Esto se consigue mediante la ESTERILIZACION, consistente en la destrucción de todo microorganismo.

En estas prácticas vamos a utilizar especialmente el calor como método de esterilización rutinario, aunque tal y como se ha explicado en clase existen otras posibilidades. Los medios con contenido acuoso han de ser esterilizados en el AUTOCLAVE mediante calor húmedo, obtenido por calentamiento en un depósito hermético que contiene agua y del que previamente ha sido evacuado el aire con el fin de limitar las oxidaciones. En este sistema el vapor de agua sobrecalentado a 121 (2 atm) o 111 ºC (1.5 atm) difunde muy rápidamente, haciendo que los elementos termosensibles de las células se desnaturalicen, especialmente sus enzimas.

Por lo tanto, una vez preparados los medios de cultivo hay que proceder a su esterilización en autoclave, realizada habitualmente a 1 atm de sobrepresión (121ºC) durante 15 ó 20 min., salvo en el caso de medios cuyos componentes sufran alteraciones tales que los hagan inadecuados para el crecimiento. Este es el caso de los azúcares utilizados en los ensayos de fermentación, que se suelen esterilzar a menor presión [0.5 atm. de sobrepresión (111ºC)] para evitar su "caramelización" , una modificación consistente en su oxidación y consecuente conversión en formas tóxicas para el metabolismo de las bacterias, o en el caso de la urea, que conviene esterilizarla independientemente por filtración.

Por otra parte, todo el material de vidrio se esteriliza mediante calor seco en el Horno Pasteur. Una vez limpio, el material se envuelve en aluminio o se introduce en un contenedor (ej: pipetas en pipetero) y se mantiene en el horno durante dos horas a 160ºC. En el caso de los portainóculos que se están utilizando constantemente, se utiliza el calor directo del mechero, que también sirve para flamear los bordes de tubos, matraces, pipetas, etc.

Práctica:

En esta práctica vamos a proceder a la preparación de caldo común, de medios para la     fermentación de azúcares y de placas de agar común siguiendo los protocolos descritos     anteriormente (ver "caldo común", "medio base para la fermentación de azúcares" y "agar nutritivo", respectivamernte) y las instrucciones de los monitores.

Siembra de microorganismos

En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos, denominada entonces inóculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de prácticas. La principal advertencia consiste en trabajar siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de convección verticales que genera, es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.

Como instrumento portainóculos más frecuente se utiliza el asa de siembra, con el que se puede tomar inóculo a partir de colonias o de medio líquido, debido a que mantiene un pequeño volumen de agua por tensión superficial. Para depositar el inóculo en líquido basta con introducir el extremo en el medio y agitar ligeramente. Sobre sólido hay que hacer un recorrido largo sobre la superficie salvo en el caso del medio TSI, en el que también hay que inocular picando en profundidad para observar reacciones metabólicas en anaerobiosis. A veces se utilizan pipetas para transportar volúmenes grandes de inóculos como en la práctica de crecimiento bacteriano.

Procedimiento: Cada pareja deberá inocular y mantener durante la mayor parte de las prácticas una serie de bacterias conocidas que denominaremos colección y una bacteria sin nombre que constituirá el problema y que deberá de ser identificado después de realizar toda una serie de ensayos. Las bacterias de la colección y sus temperaturas de crecimiento son:

Escherichia coli 37ºC Gram negativa

Pseudomonas aeruginosa 37ºC Gram negativa

Staphylococcus aureus 37ºC Gram positiva

Micrococcus luteus 30ºC Gram positiva

Nocardia corallina 30ºC Gram positiva

Bacillus cereus 37ºC Gram positiva (¡Cuidado porque forma esporas!)

En esta práctica se inocularán cada una de las bacterias de la colección en un tubo de caldo común y en otro de agar inclinado. La bacteria problema, además de en estos medios, será inoculada en una placa de agar común al objeto de obtener colonias aisladas, bien por agotamiento de la siembra o bien por siembra y esterilización entre recorridos solapantes, según las explicaciones de los monitores. Una vez inoculado, incubar cada bacteria a su temperatura óptima de crecimiento y no olvidarse de marcar el nombre de la bacteria y la clave de pareja de prácticas.

Fermentación de azúcares

Se entiende por fermentación a reacciones de mantenimiento que no requieren la participación de una cadena de transporte de electrones, aunque en ciertos casos éstas pueden jugar papeles auxiliares. En el caso de azúcares se trata de procesos de óxido-reducción capaces de regenerar NAD y que comúnmente tienen como productos finales alcoholes (etanol, isopropanol, n-butanol, etc.), ácidos (acético, fórmico, láctico, etc.) acompañados o no por la formación de gases.

Además de su interés bioquímico, la capacidad para fermentar diferentes azúcares es una propiedad utilizada muy frecuentemente en taxonomía. En nuestro caso utilizaremos un procedimiento clásico para ensayar la capacidad de fermentación de tres azúcares: Glucosa, Sacarosa y Lactosa. La producción de ácidos se observará por el viraje a amarillo del Púrpura de Bromocresol. La producción de gas por su acumulación en las Campanas Durham, de donde habrá desplazado parte del líquido inicialmente incluído. Ambas determinaciones se efectuarán a las 24 y 48 horas de incubación para así tener una idea de la rapidez de su producción. Asímismo, se hará una cuantificación en función de la extensión del viraje del indicador y de la cantidad de gas producida.

Procedimiento:

Inocular con la bacteria problema y con una de la colección (escogidas de forma que no estén repetidas en la mesa) e inocular cada una de ellas en tres tubos que contengan cada uno de los tres azúcares (G,S,L). Incubarlos a las correspondientes temperaturas de crecimiento. Hacer las determinaciones a las 24 y 48 horas y apuntar los datos del problema y de toda la colección en el cuaderno de prácticas.

Observación de las bacterias

a) Observación macroscópica.

El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin embargo, las colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso, rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen pigmentos, etc.

b) Observación microscópica.

Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son incoloras, la única forma de observarlas bien en el microscopio óptico consiste en incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste, generalmente de fases, en el microscopio.

La disponibilidad de sistemas de contraste de fases permite observar a las bacterias vivas y determinar algunas características tales como su movimiento. Para ello, disponer una gota de cultivo líquido, previamente agitado, sobre un portaobjetos y taparlo con un cubre de forma que se establezca una delgada película entre ambos cristales. Posteriormente, se observa con el objetivo de contraste de 40x (ojo!, tiene una banda roja y no todos los microscopios disponen de él) y el condensador anular (se desplaza horizontalmente y con suavidad hasta alcanzar su posición en el camino óptico). Con este sistema se deben de poder distinguir aquellas bacterias con flagelación polar, que se mueven en zig-zags muy rápidos, de la perítricas, de movimientos más suaves y ondulados. En las inmóviles se producen desplazamientos generales por la existencia de corrientes y vibraciones en el medio de observación. Determinar la forma y capacidad de movimiento de la bacteria problema, y observar también alguna preparación de las de la colección: Pseudomonas (polar), E.coli (perítrica), etc.

Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación. Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por calor se procede a la tinción.

Tinción de Gram. Se trata de una tinción diferencial muy utilizada que distingue las bacterias por las características de su pared celular. Con el fin de disponer de controles internos que nos permitan saber si la tinción ha sido correcta se efectúan tres tinciones como mínimo: una con la bacteria problema sóla, y otras dos en las que ésta es mezclada (a nivel del frotis!) con una bacteria G+ o con una G- de morfología distinta a la problema. Así, si todo va como debe la bacteria problema ha de mantener su coloración Gram constante en los tres frotis, apareciendo en una de las mezclas otras bacterias de coloración Gram contraria. El proceso de tinción se efectúa siguiendo el siguiente protocolo:

1) Hacer un frotis y fijar según se indica anteriormente.

2) Cubrir con cristal violeta durante 1 minuto. En este paso, todas las células quedan teñidas por el colorante.

3) Eliminar el cristal violeta volcando el porta y tratar con lugol durante 1 minuto. De esta forma se refuerza la interacción entre el colorante y la pared celular.

4) Lavar con alcohol por goteo continuado durante 20 segundos. Añadir inmediatamente agua para evitar el arrastre completo de todo el colorante. En esta fase se produce la decoloración diferencial de las Gram negativas.

5) Tratar con safranina durante 1 minuto como colorante de contraste.

6) Lavar con agua abundante, secar al aire y observar en inmersión (100x). En esta fase las Gram negativas adquirirán color rojo de la safranina mientras que las Gram positivas continuarán con el color azul propio del primer colorante.

Tinción de esporas. Se trata de otra tinción diferencial que se efectúa de forma separada con la bacteria problema y con Bacillus subtilis (de la colección) como productor de esporas. El procedimiento a seguir es el siguiente:

1) Hacer dos frotis de cultivos procedente de medio sólido de la bacteria problema y de Bacillus de la colección. Fijarlos por calor de la forma ya descrita.

2) Colocar los portas sobre el trípode y cubrir la preparación con tres papeles de filtro recortados de forma que no sobresalgan.

3) Añadir verde de malaquita hasta que los papeles queden empapados y pegados a los frotis. Coger el mechero por su base y calentar lentamente las preparaciones hasta que estas empiecen a emitir un vapor blanquecino (detectable mejor sobre fondo negro). Mantener esa emisión con el mechero durante 5 a 7 minutos sin dejar que se sequen las muestras (se añade más colorante). En esta fase se tiñen las formas vegetativas y las esporas.

4) Coger las preparaciones con pinzas (¡queman!) y lavarlas intensamente con agua fría hasta que se observe muy poca coloración. Durante este lavado diferencial el agua arrastra el colorante de las formas vegetativas, mientras que el incluido en las esporas se mantiene en el interior debido al enfriamiento de las envolturas, que se vuelven de esta forma mucho menos permeables.

5) Teñir con un colorante de contraste como la safranina, ahora en frío, durante 1 minuto. Este sólo teñirá a las formas vegetativas, mientras que las esporas permanecerán refractarias a su entrada.

6) Desteñir con agua fría. Secar al aire y observar con el objetivo de inmersión.

Si todo va como debe, las esporas aparecerán de color verde y las formas vegetativas en rojo. Determinar si la bacteria problema forma esporas o no.

Ensayos bioquímicos estandarizados (API20E)

Además de las fermentaciones de azúcares, existe una gran diversidad de ensayos bioquímicos que permiten identificar a un determinado organismo. No obstante, el desarrollo individualizado de un conjunto de estos ensayos es muy lento, y requiere la manipulación de gran cantidad de material, lo que a efectos prácticos los hace inviables en laboratorios de análisis rutinarios. Para éstos, se han desarrollado sistemas miniaturizados que permiten el ensayo a gran escala y de forma sencilla de muchos ensayos bioquímicos simultáneos. Uno de estos ensayos es el denominado galería API20E, especialmente diseñados para Enterobacterias, pero que puede ser aplicado a otras bacterias. En nuestro caso, usaremos una galería de ensayo de este tipo para caracterizar algunas reacciones bioquímicas de la bacteria problema.

Actividades a ensayar. La galería API20E consta de 10 reacciones específicas de fermentación para los azúcares y otras 10 reacciones de utilización de sustratos o presencia de determinadas enzimas según se detalla en el siguiente cuadro:

*) Requiere la adición de reactivos

1) Un amarillo muy pálido debe considerarse positivo

2) Un color naranja pálido después de 24 horas de incubación podría considerarse negativo

3) La lectura debe hacerse en la cúpula (aerobiosis)

4) La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, la oxidación en la superior

Materiales y reactivos:

Galería de identificación API20E

P-200 y puntas estériles

Pipetas de 5 ml estériles

Tubo 5 ml estéril

Solución salina estéril (Cloruro sódico 0.9%)

Aceite de parafina estéril

Reactivo TDA Cloruro férrico 3.4 g

Agua 100 ml

Reactivo IND Paradimetil-amino-benzaldehido 5 g

Alcohol isoamílico 75 ml

HCl 37 % 25 ml

Reactivo VP1 KOH 40 g

Agua 100 ml

Reactivo VP2 1 naftol 6 g

Etanol 100 ml

Procedimiento:

1) Preparar una cámara de incubación con su tapa correspondiente y repartir 5 ml de agua en los alveolos para proporcionar un atmósfera húmeda. Anotar el número de pareja en el lateral de la galería.

2) Colocar la galería en la cámara de incubación.

3) Disponer 5 ml de solución salina estéril en el tubo. Tomar mediante el asa de siembra una colonia aislada y homogeneizar la suspensión con el agitador.

4) Inoculación de la galería (ver el esquema)

– Llenar los tubos pero no las cúpulas ( A) de los tests salvo los indicados abajo.

– Llenar el tubo y la cúpula (B) de los test (CIT), (VP) y (GEL) con la suspensión anterior.

– Llenar la cúpula de los test ADH, LDC, ODC, URE, H2S con aceite de parafina (C) para obtener atmósfera anaerobia.

5) Cerrar la cámara de incubación e incubar a 35-37ºC durante 24 horas.

Lectura de la galería (Anotad todos los datos obtenidos en el cuaderno!):

1) Leer los resultados de las reacciones espontáneas de acuerdo con la tabla de positivos y negativos. Anotadlo en el cuaderno.

2) Revelado de (VP): Añadir 1 gota de reactivo VP1 y otra de VP2. Esperar 10 min. Si sale rojo o rosa es positivo.

3) Revelado TDA: Añadir una gota de reactivo TDA. La aparición inmediata de un color marrón oscuro es resultado positivo.

4) Revelado IND: Añadir una gota de reactivo IND y esperar dos minutos. Un anillo rojo indica reacción positiva.

Antibiosis

Existen diferentes técnicas para estudiar la actividad de los antibióticos frente a distintos microorganismos, utilizándose en clínica pruebas esencialmente cualitativas, aunque en muchos casos se requieren determinaciones cuantitativas. En estas prácticas vamos a efectuar ensayos de ambos tipos. Las pruebas cualitativas o antibiograma se van a efectuar con la bacteria problema mientras que las cuantitativas las haremos con una bacteria conocida (E.coli ). Cada pareja deberá pues inocular el día anterior al del ensayo su bacteria problema E. coli en sendos tubos de caldo común, procurando evitar contaminaciones.

Las pruebas que vamos a realizar se basan en la difusión del antibiótico sobre una placa de medio a partir de un punto central. En este caso, una cantidad concreta del antibiótico se encuentra incluido en un disco de papel que se deposita sobre una placa de agar común, que ha sido previamente inoculada con una fuerte dosis de la bacteria a ensayar. Así, el disco de papel absorbe agua de la placa, se disuelve el antibiótico y se inicia el proceso de difusión de éste hacia las zonas que lo rodean, generándose un gradiente de concentración cuyo nivel máximo se encuentra bajo el disco. Las bacterias que se inocularon crecerán durante su incubación allí donde la concentración del antibiótico sea lo suficientemente baja como para no impedírselo (normalmente alejado del disco), mientras que no podrán hacerlo en las proximidades del disco donde las concentraciones del antibiótico son elevadas. Puesto que los límites de concentración de antibiótico que afectan al cultivo son por regla general muy estrechos, se suelen formar halos de inhibición, esto es, zonas sin bacterias alrededor de los discos, de bordes bastantes definidos y cuyo diámetro tiene que ver con la concentración de antibiótico que había en el disco y con la sensibilidad a éste de las bacterias ensayadas.

Procedimiento:

Antibiograma: El objetivo es determinar a qué antibióticos es sensible la bacteria problema. Se utilizarán discos comerciales con los antibióticos y dosis que se especifican en la tabla.

Inicialmente se extiende con la bolitas de vidrio un inóculo de 0,2 ml de la bacteria problema a partir de un cultivo denso en medio líquido (Utilizando las pipetas automáticas como potainóculos: ¡No se os ocurra flamearlas, que son de plástico!). Después se van disponiendo los discos de cada antibiótico sobre la placa (hay que presionar ligeramente) y a distancias equivalentes, empleando unas pinzas esterilizadas por calentamiento y enfriadas al aire. Para extraer los discos de sus contenedores hay que seguir las instrucciones de los monitores.

Prueba cuantitativa. Se trata de determinar el grado de sensibilidad o concentración mínima inhibitoria (CMI) de un antibiótico frente a la bacteria ensayada. Cada pareja sembrará de la forma descrita un césped de E. coli, y colocará cinco discos con cantidades crecientes de Estreptomicina. Para preparar los discos, cada pareja preparará 5 diluciones seriadas (1:4 en agua estéril) a partir de una disolución valorada que le darán los monitores, y añadirán 10 ?l de cada una de éstas diluciones a sendos discos de papel estériles. Puesto que los discos no están marcados, es imprescindible indicar su concentración debajo de la placa. Siempre resulta conveniente mantener un orden creciente en la disposición de los discos.

Una vez colocados los discos de ambos experimentos, las placas se incuban en posición invertida durante toda la noche a la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria que se esté utilizando. A la mañana siguiente hay que medir el diámetro de los halos de inhibición y anotarlos en el cuaderno.

Resultados:

En el caso del antibiograma, se hará un cuadro de sensibilidad (S) o resistencia (R) para cada uno de los antibióticos frente a esta estirpe, y posteriormente serán utilizados como criterio para la determinación de la bacteria problema. El criterio a seguir, internacionalmente reconocido, será:

Sensible (S) si el diámetro del halo es mayor de 15 mm

Resistente (R) si el diámetro del halo es menor de 13 mm

Intermedio (R/S) si el diámetro del halo está comprendido entre 13 y 15 mm

En el caso del ensayo cuantitativo se representará el diámetro del halo frente al logaritmo de la concentración correspondiente. Los puntos obtenidos entonces se ajustarán a una recta, de la que se extrapolará la concentración necesaria para generar un halo de 15 mm, que será considerada como la concentración mínima inhibitoria (CMI) de este antibiótico frente a la bacteria ensayada.

Actividad catalasa

Se trata de un ensayo muy simple que intenta determinar si la bacteria problema tiene capacidad para degradar el peróxido de hidrógeno, uno de los agentes oxidantes producidos como consecuencia de determinadas reacciones metabólicas oxidativas propias del metabolismo aerobio. La enzima encargada de degradar este producto es denominada catalasa y aparece en casi todos los microorganismos aerobios obligados o facultativos. Existen sin embargo organismos anaerobios o microaerófilos que carecen de dicha actividad, constituyendo esta prueba un importante elemento taxonómico.

El ensayo es muy sencillo, pues basta con añadir una gota de agua oxigenada sobre una colonia del cultivo y observar si de ésta se empiezan a desprender burbujas de oxígeno como consecuencia de la actividad enzimática de la catalasa:

Análisis microbiológico de aguas contaminadas

La detección de microorganismos contaminantes en alimentos y bebidas constituye una práctica habitual en cualquier laboratorio de Bromatología. Para ello se utilizan medios selectivos, indicadores y generales que nos permiten identificar desde el total de bacterias contaminantes (realmente sólo se detecta una cierta parte de la población total) hasta grupos de bacterias concretas, de especial interés como agentes contaminantes por su posible peligrosidad, o por tratarse de indicadores de procesos sufridos por el producto durante su manufacturado o almacenamiento.

Por razones prácticas, en este experimento sólo vamos a tratar de distinguir la presencia y cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:

Escherichia coli

Samonella typhimurium

Morganella morganii

Enterobacter aerogenes.

El método a seguir consistirá en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada en solución fisiológica, siguiendo el esquema que se representa a continuación:

A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:

Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 10-5, 10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar común, e incubarlas a 37ºC durante la noche en posición invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el número de colonias y se multiplica por los factores de dilución correspondientes.

Determinación de bacterias fermentadoras de lactosa. Se extiende 0.1 ml de las diluciones 10-4 y 10-3 sobre dos placas de agar MacConkey, incubándolas de la forma descrita. Una vez crecidas, se cuentan las colonias rojas y las rosáceas y se multiplican ambos números por los factores de dilución. Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y se extiende un inóculo denso sobre la superficie de una placa de agar EMB, incubando a continuación a 37ºC durante toda la noche. En este medio, confirmativo para E. coli, esta especie debe dar lugar a colonias negras con reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da colonias más rosáceas y nunca reflejos. Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli, sobre el total de coliformes.

Determinación de Salmonella y Morganella. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 10-5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37ºC durante 24-48 horas. Sobre este medio Salmonella y Morganella generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las colonias se vuelvan rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el amarillo (una buena forma de detectar coliformes).