Metabolómica aplicada al diagnóstico preimplantacional no invasivo (página 2)

Figura 1.- Valoración no invasiva del consumo y utilización de nutrientes por el blastocisto. Los blastocistos fueron incubados individualmente en un volumen conocido de O.5 &µl de medio definido, como el G2. Series de muestras de nanolitros pueden ser tomadas y analizadas para carbohidratos, aminoácidos, amonio, oxígeno y enzimas. La medida simultanea del consumo de glucosa y producción de lactato puede darnos una medida indirecta de la actividad glucolítica. Esta actividad glucolítica ha mostrado ser inversamente proporcional tanto al desarrollo en cultivo como a su posterior viabilidad. La medida simultanea del consumo de aminoácidos y la producción de amonio puede darnos una medida indirecta de la utilización de los aminoácidos. La liberación de enzimas al entorno, como lactato deshidrogenasa, refleja alteración en la integridad de la membrana y puede ser utilizada para valorar daños por la congelación.

(Veeck y Zaninovic, 2003) (16)

Diferentes estudios relacionan los perfiles metabólicos obtenidos, con el potencial reproductivo del embrión, encontrando diferencias de la viabilidad en el metabolismo de la glucosa, piruvato (Gardner et al. 2001) (10) y el turn-over de aminoácidos.

Urbansky et al. (3), exponen un sistema automático de microfluidos, construido con la técnica de litografía blanda en multicapas, que detecta por fluorometría moléculas que actúan como sustratos energéticos (glucosa, piruvato, lactato…), así como otros muchos metabolitos relevantes y numerosos aminoácidos, a través de reacciones con NADH.

El metabolismo energético ha constituido un importante objetivo en los estudios del potencial de desarrollo embrionario sirviendo, asimismo, como biomarcador. Esto se complementa con las medidas de consumo de oxígeno, con el scaning electroquímico microscópico (SECM), Embryoscope®, y con la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) que se ha usado para analizar el turn-over de aminoácidos.

Pero la mayoría de estas técnicas están limitadas para el ejercicio de rutina en las clínicas de reproducción, por requerir tiempo para los análisis, compleja instrumentación y personal especializado. Se necesita, pues, un procedimiento rápido, preciso y no invasivo.

LAS ÓMICAS, nuevas ciencias desarrolladas desde la descodificación del genoma humano, pueden ofrecernos esta posibilidad.

Genómica y proteómica se encargan del análisis, identificación y cuantificación del conjunto de genes y proteínas, respectivamente. La transcriptómica atiende a las moléculas intermedias (ARNm), productos de la transcripción desde los que se traducen las proteínas.

La proteómica tiene como objeto las proteínas codificadas por un organismo (proteoma), así como los efectos de su modificación, interacción y actividad en un sistema biológico. Incluye a la secretómica que se restringe a las proteínas secretadas al entorno celular externo (secretoma).

La obtención de la secuencia del genoma humano no explica en sí la naturaleza de muchas enfermedades, por lo que ha aumentado el interés en conocer su expresión fenotípica (Nicholson et al. 2002) (15).

LA METABOLÓMICA, última ciencia que ha ido emergiendo con fuerza desde los noventa, es el análisis sistemático del metaboloma, sistema dinámico constituido por el conjunto de metabolitos, biomarcadores de pequeño tamaño (<1500 Dalton), presentes en una muestra biológica (Lindon et al. 2007) (2), que son productos finales de los procesos regulatorios de las células y representan el fenotipo funcional a nivel celular (Botros et al. 2008) (5). Por consiguiente, revelan la respuesta de los sistemas biológicos a la influencia genética, nutricional y ambiental (Sing y Sinclair 2007) (12). La metabolómica nos permite investigar la relación entre el genotipo del organismo y el fenotipo resultante, al ser el metaboloma el producto final de su expresión, mostrando la relación entre su fisiología y las condiciones ambientales (Figura 2).

Figura 2. Diagrama esquemático detallando la complejidad de la función celular, incluyendo las tecnologías ómicas asociadas: genómica, transcriptómica, proteómica y metabolómica, que contribuyen al estudio y comprensión de los sistemas biológicos.

(Katz-Jaffe et al. 2009) (8)

En conjunción con la proteómica, con la metabolómica se cubrirá un espectro más amplio y preciso de la capacidad reproductiva, de manera no invasiva, complementándose para definir funciones y propiedades reproductivas que aún no han podido ser objeto del estudio rutinario. Para ello se necesitará disponer de diversas técnicas que se adecuarán al objetivo buscado y que se puedan aplicar como rutina en las clínicas de reproducción asistida. De entre ellas destacará la más rápida, precisa y con mayor definición de las propiedades de la capacidad reproductiva del embrión que se puedan extraer del análisis de los biomarcadores en el medio de cultivo. Estos biomarcadores no serán considerados individualmente. Con la metabolómica se obtiene un perfil global, considerando el mayor número posible de éstos. Los perfiles obtenidos son los que indican la capacidad de implantación y potencial evolutivo del embarazo, puesto que veremos que son diferentes entre los embriones con alta capacidad reproductiva y los no viables.

Estas ciencias, al ser holísticas, consideran la mayor cantidad de variables posibles para, posteriormente, extraer de ellas la información verdaderamente útil y trabajar en su conjunto, utilizando algoritmos de procesado de señal, propios de la inteligencia artificial.

LAS TÉCNICAS más descritas en la literatura científica para el análisis metabolómico son: Espectroscopía por infrarrojos en el espectro cercano, espectroscopía Raman, que también es vibracional pero con laser en el espectro visible, resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas.

Entre las más precisas para evaluar el perfil metabolómico está la de espectroscopía por infrarrojo cercano (Near Infrared, NIR) (Seli et al. 2007) (1). Basándose en la vibración de los enlaces por estimulación con haz infrarrojo, esta técnica nos proporciona información de los cambios del medio, relacionándolos con las variaciones en las medidas de las concentraciones de grupos funcionales clave, como ROH, -SH, C=C, -OH, y –NH, que son los detectados y que forman parte de moléculas que constituyen el metaboloma (Botros et al. 2008) (5).

La espectroscopía Raman, basada en la estimulación de las moléculas con un haz laser y la detección de la energía emitida al relejarse, combinada con la bioinformática, es también usada para determinar el perfil metabolómico y se relaciona con resultados de embarazo. (Scott et al. 2008) (7).

La RMN se fundamenta en las propiedades cuánticas del núcleo atómico. Los núcleos que poseen un número impar de protones o neutrones tienen un momento magnético y un momento angular intrínseco, es decir, un spin nuclear. Al ponerlos en un campo magnético, este spin se alinea con el campo, emitiendo una señal en la frecuencia de las ondas de radio. Dependiendo del entorno electrónico y molecular en que se encuentre (apantallamiento), esta señal se verá desplazada en el espectro resultante (desplazamiento químico), por lo que podemos reconocer este entorno e identificar la molécula. El espectro se obtiene aplicando la transformada de Fourier (Figura 3). En un estudio retrospectivo, Seli et al. (11) concluyen que el perfil metabolómico del medio de cultivo embrionario, usando RMN, se correlaciona con el potencial reproductivo del embrión.

La espectrometría de masas (MS) es un método analítico de separación y determinación de la masa molecular de los componentes de una muestra. Estos son ionizados y separados en relación a su masa y carga. Esta técnica nos provee de la alternativa analítica más sensible para detectar metabolitos de concentración micromolar, niveles típicos de concentraciones fisiológicas (Botros et al. 2008) (5).

Figura 3.- Ejemplos de análisis metabolómico por espectroscopía RMN de componentes puros y fluidos biológicos. (A) Regiones conocidas de desplazamiento químico para RMN (0–12 ppm). (B) Espectro RMN por transformada de Fourier (0–5 ppm) de ácido láctico 6 mM en agua, obtenido usando un espectrómetro Varian de 500 MHz. (C) Espectro RMN, por transformada de Fourier (0–5 ppm) analizando 18 ml de una muestra de medio de cultivo de FIV, diluida en 600 ml de una solución 10%D2O/90%H2O, obtenido con un espectrómetro Varian de 500 MHz. Ileu, isoleucina; Leu, leucina; Lact, lactato; Ala, alanina; Acet, acetato; Meth, metionina; Glu, glutamato; Pyr, piruvato; Gluc, glucosa.

(Botros et al. 2008) (5)

Técnicas espectroscópicas aplicadas al análisis metabolómico

Repasaremos cuatro trabajos sobre análisis metabolómico, realizados con tres técnicas diferentes (NIR, Raman y RMN), con el objetivo de comprobar si, con la aplicación de estas técnicas, se puede establecer la relación entre sus resultados y el potencial reproductivo del embrión.

1.- Espectroscopía vibracional: Raman y NIR. (Seli et al. 2007) (1)

Se realiza un estudio prospectivo para determinar si el perfil metabolómico del medio de cultivo se corresponde con el potencial reproductivo de cada embrión. En ese estudio se plantea la hipótesis de que el embrión que resulta en embarazo puede ser diferente, en su perfil metabolómico, a los embriones que no lo consiguen y que esa diferencia podía ser detectada con una rápida evaluación de su medio de cultivo usando el análisis espectroscópico y la bioinformática.

Participaron pacientes de dos clínicas, una en Yale y otra en New Haven. Todas las pacientes de IVF fueron consideradas para el estudio, excluyendo a las que presentaban un desarrollo endometrial anormal.

Tras los protocolos de estimulación y extracción de los ovocitos, estos fueron inseminados. Al día siguiente (día 1), cada ovocito fue examinado para comprobar su fecundación. Aquellos encontrados con dos pronúcleos fueron colocados en gotas individuales de medio, para su cultivo hasta el estado de división, de 30&µl, días 1 a 3, en Yale y 50&µl para el mismo periodo en New Haven.

Un sistema de valoración del embrión basado en la tasa de división y rasgos morfológicos fue usado en ambos centros para evaluar sus cualidades. Los pacientes que no tuvieron suficiente número de embriones de calidad el día 3 susceptible de prolongar el cultivo, se seleccionaron para transferir sus embriones ese día. De los que tenían suficientes, se prolongaba el cultivo hasta el día 5 y ya se transferían.

Una vez extraídos del medio para transferirlos, se colocaron las muestras del medio en crioviales individuales etiquetados y se congelaron a -80ºC. Una muestra de medio que no tuvo embrión se incubó y se congeló igualmente como control.

Las muestras correspondientes a embriones que no implantaron se etiquetaron como tasa de implantación cero. A las muestras correspondientes a pacientes cuyos embriones transferidos habían implantado todos, se les asignó la tasa 100.

Se seleccionaron las pacientes con tasa 0 ó 100, cuyas muestras se enviaron para su análisis en hielo seco al laboratorio de metabolómica de la Universidad de McGill, Montreal (Canadá). Un total de 69 muestras de medio de 30 pacientes, recogidas después del transfer en el día 3, fueron evaluadas en el estudio.

Realizaron dos análisis de las muestras: uno con espectroscopía Raman y el otro con espectroscopía de infrarrojos NIR.

1.1.- Análisis por espectroscopía Raman

Antes del análisis las muestras se colocaron durante 30 minutos a 25ºC, esto es, la temperatura de la habitación. Se usó un espectrógrafo reflexivo Advantage 200A con un detector CCD. Se llenaron las cubetas de cuarzo, de 1mm de diámetro, compatibles con espectroscopía Raman, con 15 &µl de muestra. Se registró el espectro desde 50 hasta 3450

empleándose 5 minutos por muestra.

1.2.- Análisis por espectroscopía infrarrojos (NIR)

Antes del análisis se pusieron las muestras a temperatura ambiente, de 25ºC, durante 30 minutos. Las muestras se diluyeron 3:1 en Milli-Q water. Se usó un espectrógrafo reflexivo, con un fotodiodo detector de rango dinámico largo. La cubeta de lectura, con una longitud de paso de 10 mm, fue llenada con 15 &µl del preparado de la muestra. El espectro se registró desde 700 nm hasta 1050 nm.

1.3.- Desarrollo del modelo espectral.

La cuantificación de las propiedades de la muestra con el espectro de Raman o NIR consiste en determinar la más restringida combinación de variables, en el rango de longitud de onda seleccionado, optimizando con un programa informático de algoritmo genético consistente en los siguientes pasos:

1 Elegir el número de variables a incluir en el modelo.

2 Generar una población inicial de individuos aleatoria.

3 Evaluar la salud de cada individuo.

4 Obtener la siguiente generación.

5 Repetir los pasos 3 y 4 para un determinado número de generaciones.

6 Repetir los pasos 1 a 5 con un incremento del número de variables incluidas en el modelo.

7 Elegir el número de variables óptimo.

8 Evaluar el modelo usando un conjunto de datos independientes.

1.4.- Resultados para espectroscopía Raman.

C

Figura 4. (A) Análisis espectral Raman del medio de cultivo de un total de 36 embriones. Se muestra la dispersión de intensidades a diferentes números de onda. (B) Las señales obtenidas, analizando cada muestra por espectroscopía Raman, son aproximadas por extracción de la media a cada número de onda. Los valores medios son calculados para los medios de cultivo de los embriones que implantaron y llegaron al parto (n ¼ 15, mostrados en rojo), y aquellos que no implantaron (n ¼ 21, mostrados en azul). (C) Índices de viabilidad calculados usando el espectro Raman del medio de cultivo para embriones que implantaron y llegaron al parto (rojo), y aquellos que no implantaron (azul). Los círculos y los cuadrados representan a los pacientes individualmente. En los gráficos en caja con muescas, las líneas verdes corresponden a las medias de los grupos de datos. Los valores de los índices de implantación fueron significativamente diferentes entre los dos grupos (P<0.001). (Seli et al, 2007) (1)

El espectro Raman obtenido fue el mostrado en la figura 4-A.

Usando el algoritmo genético descrito, se identifican tres áreas en el rango espectroscópico analizado, que fueron identificados como los más discriminatorios entre los dos grupos de estudio. Aplicando el modelo matemático se calculó el índice de viabilidad (Figura 4-B).

Con el análisis por espectroscopía Raman quedó comprobado el potencial reproductivo, demostrados los altos índices de viabilidad de los positivos (0.5886 ± 0.2222), respecto a aquellos con fallo de implantación (0.3264 ± 0.2884) (P<0.01). (Figura 4-C). La espectroscopía Raman identificó el potencial de implantación/embarazo con una sensibilidad del 85.7% y una especificidad del 76.5%.

1.5.- Resultados para espectroscopía NIR

El análisis por espectroscopía NIR se completó obteniéndose un espectro similar al obtenido con la espectroscopía Raman, en el que fue observada una amplia variación entre las señales registradas de las diferentes muestras.

Usando un modelo semejante al anterior, las señales fueron aproximadas extrayendo el término medio para cada longitud de onda y calculados los valores promedio por cada grupo de estudio. Con un algoritmo genético se identificaron cuatro áreas en el rango espectroscópico registrado, asignadas como las más discriminatorias entre los dos grupos. Aplicando el modelo matemático a esa región, se calculó el índice de viabilidad. Con el análisis por espectroscopía NIR, en Morristown (New Jersey), se comprobó el potencial reproductivo, observando los altos índices de viabilidad (0.6712 ± 0.27615) comparados con aquellos con fallo de implantación (0.29227 ± 0.22355) (P<0.05). La espectroscopía NIR identificó el potencial de implantación/embarazo con una sensibilidad del 75% y una especificidad del 83.3%.

A pesar de que las muestras fueran recolectadas en diferentes centros de reproducción y usando diferentes medios de cultivo, los índices de viabilidad de los embriones con potencial reproductivo demostrado, fue alto (0.7100 ± 0.1420) en comparación con los embriones con fallo de implantación (0.3540 ± 0.2982) (P<0.05).

Usando una curva con la sensibilidad óptima, fue calculada al 100% con una especificidad asociada del 70%. Resultó un valor predictivo positivo de 1.0 y un valor predictivo negativo de 0.46.

2.- Espectroscopía NIR (Vergouw et al. 2008) (4)

En este estudio investigan si el perfil metabolómico de los biomarcadores del medio de cultivo usado por el embrión, analizado por NIR, tiene correlación con el progreso del embarazo al transferir un solo embrión

2.1.- Procedimientos de laboratorio.

Tras los protocolos de estimulación y extracción de los ovocitos, se procede a inseminar los seleccionados con FIV o ICSI (total de 333 ciclos; 304 de día 3 y 29 de día 2). A las 16-18 horas de la inseminación se valora la fecundación. Los embriones se cultivan individualmente en gotas de 25 &µl de medio de cultivo, con gotas paralelas del mismo medio, sin embrión, como control. A cada embrión se le hace una valoración antes de la transferencia, con la morfología, el número de blastómeras y la tasa de fragmentación. El embrión con el mayor número de blastómeras y menor tasa de fragmentación será el transferido. Si solo hubiera uno disponible sería el transferido a los dos días de la recuperación del ovocito y fecundación, sin tener en cuenta la morfología. Seguidamente, cada gota de medio usado y el control se congelan y son enviados a Molecular Biometrics, Montreal (Canadá), donde se analiza por NIR.

2.2.- Resultados del análisis.

Los grupos espectrales (ROH, -SH, C=C, -CH, -OH y -NH) que discriminan entre resultados positivos y negativos de embarazo, definidos por la actividad cardiaca fetal (FCA) a las 12 semanas, son determinados con métodos de búsqueda por algoritmos genéticos, aplicando el método de regresión de los mínimos cuadrados y leave-one-out cross validation, dando una clasificación relativa de la viabilidad del embrión. La tasa global de embarazos evolutivos en día 2 fue 17.2% (5/29), y 29.3% (89/304) en día 3.

El modelo matemático empleado en la interpretación de los datos de NIR, diferente al usado por Seli et al. (1), produjo una clasificación de la viabilidad del embrión que se correspondía con el potencial reproductivo determinado por los resultados de embarazo.

El resultado promedio de la viabilidad relativa de los grupos con FCA negativa y positiva, con transferencia de un solo embrión (Single Embryo Transfer, SET), después del día 2, fue 0.2295 (±0.0985) negativa y 0.2814 (±0.0224) positiva (P<0.03). Del día 3 fue 0.2767 (±0.1115) y 0.3076 (±0.0974), respectivamente (P<0.02).

Los resultados indican que los embriones que implantan y consiguen llegar a embarazos evolutivos (positivo), influyen en su entorno de diferente manera a los que tienen fallo de implantación (negativo). Esto está de acuerdo con estudios previos en los cuales fueron encontradas diferencias en el metabolismo embrionario de la glucosa, piruvato y turn-over de aminoácidos; la espectroscopía NIR analiza los cambios en varios grupos orgánicos funcionales asociados con estos metabolitos. Hay que considerar los factores que contribuyen a FCA: edad de la madre, fragmentación y viabilidad relativa asociada a embarazo evolutivo.

3.- Espectroscopía Raman (Scott et al. 2008) (7)

El objetivo es determinar si el perfil metabolómico del medio de cultivo del embrión en desarrollo, determinado por Raman, está relacionado con las tasas de implantación en FIV. Posiblemente lo más importante de estos resultados sea determinar si el valor límite puede ser usado para predecir mayores diferencias en el potencial de implantación. El estudio se realiza con un diseño prospectivo ciego.

3.1.- Procedimientos de laboratorio.

Tras los protocolos de estimulación y extracción de los ovocitos, se inseminaron por FIV o ICSI, según fuera lo más indicado, se prepararon en gotas de 50&µl y se incubaron con un 5% de oxígeno.

Al día siguiente, después de comprobar la fecundación por la presencia de dos pronúcleos, se colocaron en gotas individuales de 50&µl de medio para su cultivo hasta el estado de división (días 1 a 3). Los pacientes que no tuvieron suficiente número de embriones de calidad el día 3 como para prolongar el cultivo, se seleccionaron para transferirlos ya. De los que tenían suficientes, se prolongaba el cultivo hasta el día 5, cuando se transferían. Después de extraer los embriones de los cultivos, los medios se depositaron en crioviales individuales y se congelaron a -80ºC.

Los pacientes que alcanzaron el 100% de implantación y progresaron hasta el alumbramiento, tuvieron acreditado su potencial reproductivo y fueron identificados los primeros. En cada caso, el siguiente paciente de la misma edad, con nivel de FSH de 1 UI/L, con tasa de implantación 0, fue seleccionado para representar los embriones con la menor tasa de implantación.

Las muestras se volvieron a identificar con números aleatorios y enviados a la Universidad de McGill para su análisis bioespectroscópico, que se realizó usando un sistema Raman basado en HeNe (DeltaNu Advantage100, Laramie. WY), con un espectrógrafo reflexivo y un detector CCD. Las cubetas de cuarzo, compatible con Raman, de 1 mm de diámetro, fueron llenadas con 15 &µl de muestra. Se registró el espectro desde 50 a 3450 a 25ºC ± 1ºC, empleando 5 minutos por muestra. La interpretación y cuantificación de las propiedades de cada espectro se facilitaron usando un modelo de algoritmo genético.

Los índices de viabilidad de los embriones que implantaron se compararon con los que no lo consiguieron usando el test de la t de Student. El proceso fue el mismo para los transferidos en día 3 y 5.

Para finalizar se realizaron curvas ROC (Receiver Operator Characteristic) para identificar el valor límite con mejor sensibilidad y especificidad en conjunto. Este valor límite fue aplicado a los datos para calcular con precisión los valores predictivos de positivos y negativos.

3.2.- Resultados

Un total de 44 muestras ciegas, obtenidas de 19 pacientes, fueron analizadas, de las cuales 35 muestras eran de 14 pacientes (74%) en día 3, y 9 muestras de 5 pacientes (26%) en día 5. Se obtuvo el espectro de cada una de ellas. La alta variación observada en las señales de cada muestra era consecuente con la variación esperada por el metabolismo de los embriones.

Los resultados fueron cegados y las muestras de los días 3 y 5 se compararon. Los índices de viabilidad del día 3 (0.71 ± 0.07) fueron significativamente más altos que los del día 5 (-0.51 ± 0.13) (P<0.001). Esto probablemente refleje las diferencias del metabolismo en las diferentes etapas de desarrollo.

Posteriormente los datos se separaron según los días del transfer. En el día 3, la evaluación de las muestras demostró los altos índices de viabilidad de los embriones con acreditado potencial reproductivo (0.875 ± 0.12) frente a los que tuvieron fallo de implantación (0.56 ± 0.09) (P< 0.03). Específicamente, los índices de viabilidad de las muestras asociadas con implantación (N=16) fueron significativamente más altas (0.94 ± 0.1) que las que no implantaron (N=17) (0.51 ± 0.07) (P<0.002). En el día 5 fueron evaluadas de forma similar, pero una muestra se salía del rango, y fue eliminada, tal vez por contaminación del aceite de la placa de cultivo.

Reevaluando los datos se demostró significativamente el alto índice de viabilidad asociado con implantación (-0.81 ± -0.08) frente a los que no implantaron (-0.21 ± -0.14) (P<0.009).

La curva ROC se realizó para ayudar a seleccionar el valor límite, que puede ser usado cuando se calculen los valores predictivos de sensibilidad y especificidad, y la precisión en su conjunto (Figura 5).

Figura 5.- Curvas ROC (Receiver Operator Characteristic) de índices de viabilidad y resultados clínicos. La precisión global para predecir resultados usando los límites derivados del análisis con la curva ROC fue 80.4%. (A). Curva ROC generada por 33 muestras de cultivo usado de día 3. La precisión diagnóstica global para predecir la implantación y parto fue 76%. (B). Curva ROC generada por 8 muestras de cultivo de día 5. La precisión global del diagnóstico fue del 100%.

(Scott et al. 2007) (7)

4.- Espectroscopía por RMN (Seli et al. 2008) (11)

El objetivo es identificar los biomarcadores asociados a resultados reproductivos a través del perfil metabolómico, obtenido por RMN, del medio de cultivo del embrión.

Igualmente, tras los protocolos de estimulación, extracción, fecundación y evaluación, se procedió a las transferencias en días 3 y 5, de acuerdo con el número de embriones de calidad disponibles. Después se congelaron las muestras de medio. Tras completar los ciclos, se identificó a las pacientes con el 100% y el 0%, según se implantaran o no, y se procedió al análisis de las muestras en la Universidad de McGill.

4.1.- Adquisición del espectro

Las muestras se pusieron a temperatura ambiente 30 minutos. Se diluyeron 18&µl de medio en 600&µl del disolvente preparado por dilución de TSP [sodio 3-(trimetil-2,2,3,3)-1-ácido propiónico-, en 250 ml de O/O al 10%. El TSP también actúa como referencia para RMN. Se adquirió el espectro en un espectrómetro Varian INOVA NMR a 500-MHz.

4.2– Resultados

Se evaluaron un total de 34 muestras de 18 pacientes, de las cuales 17 embriones de 10 pacientes implantaron (se les asignó 100%) y 17 embriones de 8 pacientes no implantaron (se les asignó 0%).

Un incremento significativo (P=0.002) de las concentraciones de glutamato se detectó en los medios de embriones que resultaron en embarazo positivo, respecto a los no viables. El glutamato puede ser generado con a-cetoglutarato y amonio por una reacción de transaminación catalizada por la glutamato deshidrogenasa en presencia de NADH. Por tanto, los niveles elevados de glutamato en los medios de cultivo de embriones con un mayor potencial de reproducción, pueden ser un reflejo de la mayor capacidad para reducir los niveles de amonio, potencialmente perjudiciales, de estos embriones que la de los embriones no viables. Además la señal para alanina, piruvato y glucosa disminuyó en los positivos.

El índice de viabilidad media de los embriones del grupo con demostrado potencial reproductivo, fue significantemente más alto (0.6201 ± 0.1619) comparado con los del grupo que fallaron en la implantación (0.3799 ± 0.2660) (P<0.002). La espectroscopía RMN identificó el potencial de implantación/embarazo con una sensibilidad del 88.2% y especificidad del 88.2%. Los dos grupos no se diferenciaron significativamente en la clasificación embrionaria previa.

Discusión sobre las técnicas

Lo que se pretende conseguir con estas técnicas es determinar las propiedades reproductivas del embrión, índice de viabilidad, potencial de implantación, capacidad de desarrollo evolutivo del embarazo y posibilidad de consecución del parto al término con bebé sano, a través del análisis metabolómico del medio de cultivo del embrión, de manera rápida y precisa.

En la tabla 1 vemos resumidos los resultados obtenidos para los índices de viabilidad, por las técnicas espectroscópicas descritas, en diferentes centros y en días distintos, donde podemos observar que todos coinciden en que estos índices son significativamente (P<0.05) más altos para los positivos, con resultado de embarazo, que para los negativos, que no lo consiguieron.

En otro trabajo, Seli et al. (14) concluyen que el perfil metabolómico del medio de cultivo embrionario humano, obtenido usando NIR, es independiente de la morfología y se corresponde con el potencial reproductivo del embrión.

La espectroscopía NIR demuestra que el perfil metabolómico del medio de cultivo usado, es capaz de valorar con precisión este potencial en estado de división, correlacionando la valoración relativa de la viabilidad con el progreso del embarazo (Vergouw et al. 2008) (4). Además, sugiere que la modificación del medio por oxidación puede ser un indicador de estos parámetros, porque los grupos funcionales detectados por NIR son sensibles a las especies reactivas del oxígeno y es independiente de los criterios de selección morfológica.

Entre las ventajas de NIR en el análisis del perfil metabolómico, cabe destacar que sólo se requiere una muestra de pequeño volumen (7-10 &µl) y, además, no resulta invasivo ni tóxico para el embrión. Asimismo puede ser fácilmente incorporado y colocado en las clínicas como un aparato compacto; es rápido (menos de 1 minuto por muestra) y relativamente fácil de usar, aunque necesita, al igual que Raman, calibración externa.

El estudio realizado con espectroscopía Raman tiene como objetivo determinar si el perfil metabolómico del embrión en desarrollo está relacionado con las tasas de implantación en FIV. Posiblemente lo más importante de estos resultados sea determinar si el valor límite puede ser usado para predecir mayores diferencias en el potencial de implantación (Scott et al. 2008) (7)

Recientemente, con la disponibilidad de sistemas laser y detectores de alta sensibilidad de bajo costo, se ha incrementado el interés por la espectroscopía Raman, tanto cualitativa como cuantitativamente, para la valoración de muestras diversas (alimentos, fármacos, explosivos…). Igualmente muestra gran capacidad para establecerse como herramienta que permita una rápida evaluación no invasiva del potencial reproductivo del embrión antes de la transferencia. Tiene la ventaja de ser compatible con muestras húmedas y a temperatura ambiente.

El análisis del perfil metabolómico con espectroscopía RMN se llevó a cabo para identificar los componentes del medio que se corresponden con el potencial reproductivo (Seli et al. 2008) (11).

La técnica de RMN, sólo está limitada a la fuerza del campo magnético aplicado. Es una técnica muy robusta y versátil, que posibilita la medida de un elevado número de metabolitos de forma fiable y repetitiva, partiendo de un proceso de acondicionamiento de muestra muy sencillo, porque no hay que separarla. Tiene además, un nivel de automatización muy alto, si bien necesita personal cualificado.

La espectroscopia RMN ha demostrado ser una de las tecnologías más efectivas para el análisis metabolómico de fluidos biológicos. Es capaz de estudiar tejidos intactos y líquidos, dando como resultado un amplio perfil de los metabolitos.

Los pioneros en la aplicación de esta técnica al diagnóstico de enfermedades, analizando fluidos biológicos, fueron Nicholson, Lindon y Holmes en 1999 (13).

Un aspecto importante de la espectroscopia RMN es que los mecanismos físico-químicos fundamentales son completamente diferentes a otras técnicas y ofrece una perspectiva científica distinta (Pauli et al. 2005) (19). En particular, la espectroscopia de RMN es muy diferente a los procedimientos de cromatografía (tales como HPLC) que, en combinación con la espectrometría de masas, han sido hasta ahora los métodos comúnmente utilizados para la identificación y cuantificación de especies moleculares en una muestra biológica.

Las técnicas no espectroscópicas, de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y cromatografía de gases, que se han usado acopladas a espectrometría de masas (MS), permiten analizar una gran cantidad de metabolitos a sensibilidades muy superiores a las de RMN. Sin embargo requieren conocer las propiedades químicas de la muestra y tienen limitada la sensibilidad al método de separación. El tratamiento de las muestras es tedioso, haciéndose más lentas, por lo que, aunque son útiles en el estudio, no lo son en el diagnóstico preimplantacional a nivel clínico, que exige rapidez en el procesado de las muestras y la obtención de resultados.

Conclusiones

Con métodos de selección rápidos y no invasivos, como la metabolómica, se consigue dar un paso más en la búsqueda de la excelencia en las clínicas de reproducción asistida. Las técnicas espectroscópicas nos brindan un buen método para conocer el perfil metabolómico del embrión analizando el medio de cultivo donde evolucionó en los primeros días. Al poder detectar y seleccionar un embrión con alto potencial reproductivo, las tasas de implantación serán mayores, pudiendo reducir el número de ciclos de FIV por paciente necesarios para conseguir un embarazo. A su vez, sin tener que transferir más de un embrión, disminuirán las consecuencias derivadas de los partos múltiples. El número de embriones fecundados necesarios para estos ciclos también se verá reducido. No siendo manipulados, los embriones no serán dañados y los que tengan ese gran potencial reproductivo podrán desarrollarlo sin alteraciones a la hora de evolucionar tras implantarse. Diagnosticándose con mayor aproximación como sanos, se conseguirán en más ocasiones embarazos evolutivos hasta el parto de un bebé sano, disminuyendo las tasas de malformaciones, abortos y riesgos perinatales y neonatales.

Queda mucho por conocer sobre la relación entre la metabolómica y el diagnóstico de las alteraciones más importantes aparecidas en el fenotipo embrionario. La metabolómica, usando diversas formas de enfoques analíticos, estudia ese conjunto dinámico de metabolitos como pequeños biomarcadores moleculares a fin de determinar y cuantificar cuáles están asociados a estados fisiológicos y patológicos, reconociendo las disfunciones en la respuesta a la influencia genética, nutricional y ambiental.

Está por investigar si controlando los factores externos, nutricionales y ambientales, se podría establecer la relación entre el metaboloma y alteraciones cromosómicas, causa de deficiencias fisiológicas que padecerá el hijo. También queda por determinar si el análisis metabolómico podría indicar defectos epigenéticos que, aunque no afectarán al desarrollo embrionario y al establecimiento del embarazo, sí que podría influir en el desarrollo fetal y la salud de los hijos.

Será necesario trabajar desde la perspectiva de la biología de sistemas, considerando de forma holística no solamente datos metabolómicos, sino también genómicos, transcriptómicos y proteómicos. El descubrimiento de esos biomarcadores nos permitiría reconocer de forma prematura ciertas enfermedades cuyo diagnóstico preimplantacional y no invasivo sería altamente relevante.

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Trabajo final del máster on line sobre la base teórica y procedimientos de laboratorio de reproducción asistida II. ADEIT-UV-IVI

Autor:

Antonio Cruz Pinzón

Ldo. en Farmacia

Sevilla, 2009