Tinciones en microbiología

• Objetivo General

Realizar diferentes técnicas de tinción para la visualización de estructuras celulares de bacterias.

• Objetivos Específicos

Adquirir destreza en el montaje y observación de preparados microbiológicos empleando técnicas de tinción simple y diferencial.

Comprender los principios teóricos en los cuales se basan las técnicas de tinción en microbiología.

Comprender la importancia De las Buenas Prácticas de Laboratorio y aplicación de normas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología.

Marco teórico

Palabras clave: Tinción, pared celular, Gram, Endosporas.

Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado al diagnóstico de enfermedades infecciosas y en la caracterización de nuevas especies. Existe una gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de muestras para análisis bacteriológico, mientras que la tinción de Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el campo de la parasitología.

Existen técnicas de tinción específicas de gran utilidad, como la tinción de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnóstico de enfermedades crónicas como la tuberculosis o la actinomicosis, o la tinción de azul de lactofenol, que preserva e identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las diferentes tinciones en el laboratorio microbiológico tienen una utilidad fundamental para el diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de etiología infecciosa (1).

La observación microscópica puede efectuarse mediante el examen en fresco de una suspensión microbiana, lo que permite visualizar microorganismos vivos y reconocer sus movimientos, apreciar sus distintas formas, tamaños y agrupaciones, o mediante un extendido o frotis coloreado, lo que posibilita según la técnica utilizada, diferencias microorganismos, observar su morfología, tamaño y agrupación o la observación de ciertos elementos facultativos como flagelos, capsula ó endosporas (2).

Los colorantes utilizados en microbiología son sales, las cuales tienen un ion cargado positivamente y otro negativamente, de los cuales uno está coloreado. Cuando el ion está coloreado es el cargado negativamente, el colorante se clasifica como aniónico o acido, por ejemplo, el eosinato de sodio, el cual se ioniza como sodio+ y eosinato+. Cuando el ión coloreado es el cargado positivamente, el colorante se clasifica como catiónico o básico, por ejemplo el azul de metileno, el cual se ioniza como cloruro- y azul de metileno+ (3).

Al poner en contacto una célula bacteriana con un colorante ocurre un intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de las superficies o el interior de la célula. Los iones teñidos del colorante reemplazan a los iones de los componentes celulares, así, por ejemplo, el catión azul de metileno+ reemplaza al catión Na+ de las células dándoles color (3).

Según la estructura que el colorante tiñe en la bacteria, las coloraciones se han clasificado en : coloraciones simples, en las que sólo se emplea un colorante para el proceso, ejemplo azul de metileno; coloraciones compuestas y diferenciales, en las cuáles se usa más de un colorante y con la misma coloración , las células se tiñen de manera diferente, ejemplo Gram, Ziehl Neelsen, y coloraciones especiales que permiten la observación de estructuras especiales de la bacteria como endosporas, glicocaliz, capsulas, flagelos (3,4).

En la práctica de Tinciones los estudiantes realizarán técnicas simples como la tinción con azul de metileno y Diferenciales como la Tinción de Gram para diferenciar las bacterias en Gram (+) y Gram (-) Teniendo en cuenta la composición química de su pared celular (peptidoglucano). Una coloración negativa para tinción de cápsulas bacterianas, tinción de Ziehl Neelsen para identificación de bacterias acido alcohol resistente y la tinción de Shaeffer Fulton para la tinción de endosporas (4).

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en bacterias Gram positivas y Gram negativas. La reacción de la tinción de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias (Figura 1).

Figura 1. Paredes bacterianas, contenido de peptidoglucano (5)

Metodología

4.1 Procedimiento

Caracterización macroscópica:

A partir de los cultivos de bacterias en medio sólido, describir las características que observa, teniendo en cuenta el color, aspecto y consistencia de las colonias de los microorganismos en el medio de cultivo.

Realización de frotis:

• A partir de medio líquido: Cargue el asa bacteriológica con una gota de cultivo y deposítela en un portaobjetos limpio realizando una extensión en forma circular de la muestra hasta conseguir una capa fina (frotis).

• A partir de un medio sólido: Ponga una gota de solución salina fisiológica (NaCl 0,9%) estéril en el portaobjetos. A continuación cargue el asa con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y re suspéndala en la gota hasta homogeneizar. Hágalo de forma circular.

Fijación al Calor:

• La preparación se deja secar al aire libre, cerca al mechero.

• Una vez seca, se procede a la fijación, haciendo pasar la preparación 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte posterior del portaobjetos).

• A partir de este momento la preparación está lista para teñir y el procedimiento a seguir depende del tipo de tinción

Tinciones a realizar:

Coloración de azul de metileno (Tinción simple)

Permite teñir el interior celular. Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto de la célula.

Procedimiento:

• Tome una muestra de los cultivos de Escherichia coli y Bacillus spp.

• Fije al calor la muestra.

• Cubrir con azul de metileno la preparación y esperar 2 minutos.

• Lavar con agua.

• Secar al aire y pasar por el mechero tres veces.

• Observar al microscopio hasta llegar al objetivo de 100x utilizando aceite de inmersión.

Figura 1. Procedimiento general de fijación al calor y observación.

Coloración de Gram (Tinción Diferencial)

Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram negativas, mientras que en las Gram positivas el colorante queda retenido y las células permanecerán azules-púrpuras. Las células Gram negativas se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse, estas quedan rosadas.

Procedimiento (Figura 2):

• Realice el montaje de los cultivos de Escherichia coli y Staphylococcus spp.

• Añadir 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparación con agua.

• Agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y dejar actuar 1 minuto.

• Transcurrido el tiempo, lavar con agua.

• Con cuidado, añadir gota a gota el alcohol-acetona dejar actuar 30 segundos, luego lavar con agua

• Añadir el colorante de contraste, safranina-fushina (1 ó 2 gotas) y dejar actuar durante 1 minuto luego lavar con agua

• Escurra y deje secar al aire

• observar al microscopio a 100X con aceite de inmersión.

• Dibuje sus observaciones.

Figura 2. Adición de colorantes de Gram (7)

Figura 3.a) Bacilos Gram negativos b) Cocos Gram positivos (8)

Coloración con tinta china para cápsula

Se suspenden las bacterias en tinta china, fundamentado en que las partículas de carbón no penetran las cápsulas, las mismas aparecen claras sobre un fondo oscuro (Figura 4).

Procedimiento:

• Coloque una gota de tinta china sobre un portaobjetos y mezcle con una asada del cultivo de Klebsiella spp. formando un extendido sobre la lámina.

• Deje secar al aire y fije brevemente con calor.

• Lave, escurra y seque el frotis.

• Observe con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.

Figura 4. Tinción Negativa (capsula) (7)

Coloración de Shaeffer-Fulton para endospora (Tinción diferencial)

Las endosporas (figura 5) son formas de resistencia, altamente deshidratadas con una serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de teñir, excepto si se calienta la preparación para permeabilizarlas; sin embargo, pueden evidenciarse en preparaciones en fresco o con diversas tinciones, pues las esporas aparecen como estructuras refringentes no coloreadas. Las esporas son producidas por Bacillus spp, Clostridium spp, géneros de bacterias Gram Positivas; aunque recientemente han sido descritas en algunas bacterias Gram negativas (4).

Procedimiento:

• Realice el montaje del cultivo Bacillus spp y fijarlas al calor.

• Cubra con verde de malaquita y caliente durante 5 minutos hasta emisión de vapores, sin que la preparación llegue a secarse. Adicionar más colorante cuando se esté secando.

• Deje enfriar la lámina por 1 ó 2 minutos.

• Lave con agua de llave por 30 segundos.

• Cubra la preparación con safranina o fucsina de Gram por 30 segundos.

• Lave, escurra, limpie el reverso de la lámina, deje secar.

• Observe al microscopio con el objetivo de 100X con aceite de inmersión.

Figura 5. Endosporas con tinción Shaeffer Fulton (7)

4.2 Materiales, reactivos y equipos

Tabla 1. Materiales, reactivos y equipos a utilizar

* Deben ser llevados a la práctica por los estudiantes.

NOTA: Los anteriores materiales están calculados para cada grupo de laboratorio, es decir para realizar la solicitud debe calcularse la cantidad total de acuerdo a los grupos de trabajo que se tengan. Tenga en cuenta que los cálculos son para caja grande de agar.

Preguntas de profundización

• ¿Investigar y explicar cuál es la importancia de las tinciones en el estudio de los microorganismos?

• ¿Cuál es la tinción que se utiliza para la tinción de BAAR (Bacterias acido alcohol resistentes)? ¿Cuál es el fundamento de la Tinción?

• ¿Cuál tinción se utiliza para la tinción de flagelos? Explique el fundamento de la Tinción.

• ¿Cuál tinción se utiliza para la tinción gránulos de reserva? Explique el fundamento de la Tinción.

• Investigue ¿Qué es un colorante catiónico? Dé 2 ejemplo

• Investigue ¿Qué es un colorante aniónico? De 2 ejemplos

• ¿Cuál es el decolorante que se emplea en la tinción de Gram?

• Adjunte hoja al Informe de Laboratorio (Anexo 1 y 2), completando durante la ejecución del laboratorio.

Bibliografía

• López L et al. Artículo de revisión: Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología [edición online]. 2014; Vol 3, No. 1 [9 páginas]. Accesible en URL: http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf Consultada el 25 de Enero de 2015.

Negroni M. El diagnóstico en clínica estomatológica. 2ª Edición. Buenos Aires. Editorial Médica Panamericana .2007

Escobar de Rico M. Prácticas de laboratorio: fundamentos de microbiología. Santafé de Bogotá. Centro Editorial Javeriano. CEJA.1998.

Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología médica. 26ª Edición. Editorial Mc Graw Hill. 2014. P 11-13

• Brock et al. Biología de los microorganismos. 12ª Edición. Madrid. Pearson: Adisson Wesley. 2009.

• Fijación al calor. Accesible en URL: https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/observacion-microscopica/fijacion Consultada el 26 de Enero de 2015.

• Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. Microbiology. 10th Edition. Pearson Education. 2010.

• Bacteria under microscope. Accesible en URL: http://www.bacteriainphotos.com/ Consultada el 26 de Enero de 2015.

Anexos

Anexo 1. Planilla de resultados de tinciones ( Imprimir 2 hojas)

TINCIÓN: ________________________________________________________

MICROORGANISMO: _____________________________________________

TINCIÓN: _________________________________________________________________

MICROORGANISMO: _______________________________________________________

Anexo 2. Cuadro complementario

Diga en cada cuadro, que color presentan las células bacterianas en el transcurso de la tinción de Gram.

Autor:

George Acosta