- Resumen
- Justificación y antecedentes
- Metodología
- Determinación de la DL50
- Análisis de resultados
- Conclusiones
- Bibliografía
- Anexos
A continuación se realiza un análisis de los procedimientos empleados para determinar la DL50 en un bioensayo a través del método de Probit, se comparan dichos procedimientos, se dan pautas para la implementación de uno de ellos y se citan los pasos para determinar la DL50 de un extracto vegetal y del ácido piroleñoso utilizando la Artemia salina como sujeto de prueba.
PALABRAS CLAVES
Bioactividad, bioensayo, dosis letal media (DL50), análisis cuantal, estadística cuantal, Probit, Artemia Salina, fitoquímica, ácido piroleñoso, tóxicos.
ABSTRACT
In this work an analysis of the procedures used to determine the DL50 in a bioassay through the method of Probit is carried out, these procedures are compared, rules for the implementation of one of them are given; also, the steps to determine the DL50 of a vegetable extract and the pyroligneous acid using the Artemia salina as subject of test are cited.
KEYWORDS
Bioactivity, bioassay, Median Lethal Dose (LD50), Artemia Salina, analysis quantal, statistical quantal, Probit, phytochemistry, pyroligneous acid, toxics.
En términos generales un bioensayo puede ser definido como cualquier prueba que involucra organismos vivos, a su vez se puede señalar como cualquier método por medio del cual alguna propiedad de una sustancia o material, es medida en términos de la respuesta biológica que produce (1). Los datos obtenidos de un bioensayo no pueden ser analizados con la metodología estadística tradicional que se usa en los ensayos de campo sino que se debe utilizar lo que se llama estadística cuantal, la cual se caracteriza por la respuesta a un estimulo de n unidades experimentales, donde r unidades responden y n – r no lo hacen. El principal objetivo de este tipo de análisis es evaluar el nivel de estimulo que es necesario para obtener una respuesta en un grupo de individuos de la población. El nivel de estimulo que causa una respuesta en el 50% de los individuos de una población bajo estudio es un importante parámetro de caracterización denotado como DL50 por dosis letal media (o DE50 por dosis efectiva media, CL50 por concentración letal media, CE50 por concentración efectiva media y Ltm por límite de tolerancia media). El periodo de tiempo durante el cual se expone el estimulo debe ser especificado, por ejemplo, 24 horas DL50, esto con el fin comparar y estimar la potencia relativa del estimulo (2).
La determinación de la DL50, se utiliza para encontrar umbrales de toxicidad para determinadas sustancias; en el desarrollo de pesticidas se utiliza para determinar los límites de resistencia de insectos, por ejemplo, ante ciertos biocidas (3). En la investigación fitoquímica valiéndose del principio de que farmacología es simplemente toxicología a bajas concentraciones o toxicología es farmacología a concentraciones altas se puede correlacionar la bioactividad con el valor de la DL50 y al mismo tiempo su grado de toxicidad.
La determinación de la DL50 requiere de la estadística cuantal, para lo cual es necesario transformar los valores de respuesta obtenidos en unidades Anglit, Logit o Probit y las dosis suministradas en unidades logarítmicas conocidas como dosis metamétricas. Existen algunos programas especializados que realizan este tipo de cálculos automáticamente, pero su confiabilidad depende de la persona o institución que los haya desarrollado.
Se hace necesaria la comparación de los procedimientos empleados así como desarrollar medios para su simplificación.
El objetivo general de este trabajo es dar las pautas para el desarrollo de un análisis de bioactividad a través del método de Probit.
Como organismo de prueba se puede utilizar Artemia salina, el cual es un pequeño crustáceo de la subclase de los anostráceos y conforma el plancton de las aguas continentales salobres de todo el mundo (4, 5, 6, 7). El procedimiento empleado con este organismo se puede apreciar en el Anexo 1. La determinación de bioactividad se realiza a extractos etanólicos de la planta Cordia spinescens de la familia Boraginaceae, la cual es utilizada como medicinal en la región de Córdoba Quindío (8); al ácido piroleñoso obtenido de guadua y nogal (9, 10), y al cisco de café.
Para la determinación de la DL50 el primer paso es el conteo de las larvas o nauplios muertos en cada extracto y cada blanco, se corrigen las mortalidades mediante la formula de Abbott y paralelamente se utiliza otra corrección que se basa en el porcentaje de supervivencia de los individuos, esta corrección es utilizada en algunos procedimientos encontrados. Las formulas de estas correcciones son las siguientes:
(Formula de Abbott) (Eq. 1)
Donde:
M = Mortalidad.
me = mortalidad en el extracto.
mb = mortalidad en el blanco.
(Eq. 2)
(Eq. 3)
r = Nauplios muertos en el extracto.
r' = Nauplios muertos en el blanco.
n = Número de individuos.
Como el número de individuos es constante (10 en este caso):
(Eq. 4)
La otra corrección utilizada es la siguiente:
(Eq. 5)
Donde:
S = supervivencia
s' = Nauplios vivos en el blanco
Mortalidad = 1 – Supervivencia (Eq. 6)
Igualando las dos ecuaciones anteriores:
A continuación se determina la DL50 mediante el método gráfico de Probit, hallando la mejor línea Ldp (Línea dosis-Probit), este método puede presentar variaciones en cuanto a la forma de determinar la ecuación de la línea Ldp, algunos autores (11) encuentran la pendiente de la gráfica (B), obteniendo el inverso de la desviación estándar de las dosis metamétricas (1/q ), con este valor y el LogDL50 hallado en la gráfica para un Probit de 5, encuentran el valor del termino independiente (A). Este método es muy aproximado y parte del precepto de que se puede encontrar la ecuación de la gráfica con la pendiente esperada (con la desviación estándar del termino independiente) y el intercepto hallado en X (Log10DL50) para determinado valor de Y (5 en este caso). Otros autores (2) determinan la ecuación de la gráfica Ldp por el método de los mínimos cuadrados. Para verificar la linealidad se realiza una prueba mediante el estadístico de prueba t de Student bilateral (de dos colas) y n-2 grados de libertad, utilizando el valor del factor de correlación lineal (rc), donde la hipótesis nula es que no existe correlación entre Probit y el Log10 dosis (12). Para ello se utiliza la siguiente ecuación:
(Eq. 8)
t de Student para un nivel de confianza del 95% y n-2 grados de libertad
Para probar la adecuación de la gráfica se realiza el test de bondad de ajuste mediante el estadístico Ji – cuadrado (c 2), en este caso la hipótesis nula es que la línea Ldp es un modelo adecuado de los datos. Para el calculo del c 2 se utiliza la mortalidad esperada de las larvas (P), la cual a su vez se halla con los Probit esperados los cuales se hallan con la ecuación de la gráfica Ldp. La ecuación es la siguiente:
c 2 = S (r – n.P)2 / n.P.(1-P) (Eq. 9)
c 2 para un nivel de confianza del 95% y n-2 grados de libertad
El último paso del método gráfico consiste en establecer los limites de confianza para la DL50, para ello se hace uso de los coeficientes de ponderación (W) para cada Probit, los cuales son hallados en tablas. Las ecuaciones necesarias son las siguientes:
Donde:
(Eq. 11)
(Eq. 12)
El intervalo de confianza es entonces representado como:
LogDL50 ± 1,96. SLogDL50
(Eq. 13)
El valor de 1,96 corresponde a un nivel del 95% de confianza para una distribución normal. Para realizar estos cálculos se elaboraron tablas en ExcelÓ que se pueden apreciar en el anexo 4.
Una vez realizado el método gráfico, se procede a emplear el método de la máxima verosimilitud, el cual consiste en la suposición de normalidad de la población estudiada, con base en esto se pueden plantear una serie de funciones que denominan los valores de P (Probit) y W (coeficiente de ponderación), con los cuales se pueden hallar los estimativos más próximos para a y b (intercepto en las ordenadas y pendiente), denominados A y B respectivamente, en una línea recta. Para ello se sigue el procedimiento dado en el anexo 2.
Es considerable el efecto de corrección de la mortalidad. En las figuras 1, 2 y 3 puede observarse la sensibilidad de la formula de Abbott a los efectos en el blanco, cuando la mortalidad en las dosis es muy pequeña, lo cual causa perdida de la linealidad.
En las anteriores figuras la línea continua corresponde a la gráfica Ldp hallada con la corrección de Abbott. En la número 1 observamos un valor de rc2 (coeficiente de determinación) de 0.677 y para la línea Ldp hallada con la corrección de "supervivencia", tenemos un rc2 de 0.9037; esto quiere decir que para la segunda el 90.37% de los datos se hallan relacionados de forma significativamente lineal, mientras que con la corrección de Abbott solo lo están el 67.7% de los valores. Para la figura 2 observamos que los valores del coeficiente de determinación para la corrección de Abbott y la que utiliza el porcentaje de supervivencia son 0.7230 y 0.9469 respectivamente. Para la gráfica de la figura 3 se observan valores de 0.6319 para la corrección de "supervivencia" y 0.4729 para Abbott. En la figura 4 el valor de rc2 es muy similar y en 5 y 6 se observa el efecto contrario, esto debido a la alta mortalidad de los nauplios con altas dosis de ácido piroleñoso. También se observa en los diagramas anteriores como con la corrección de Abbott se obtienen DL50 mayores, es decir, la otra corrección utilizada "subdimensiona" los valores de la DL50.
En el método gráfico a pesar de utilizarse dos procedimientos diferentes para hallar la ecuación de la gráfica Ldp el valor del LogDL50 es igual, sin embargo, varían los intervalos de confianza y la prueba de adecuación del modelo (test de bondad de ajuste). Para la DL50 de hojas a las 24 horas se encontró que el modelo resultaba adecuado con un c 2 de 1.3037 para el método que utiliza el procedimiento de los mínimos cuadrados para hallar la ecuación de la gráfica; para la misma determinación el método que utiliza la suposición de que la pendiente es igual al inverso de la desviación estándar de las dosis metamétricas se encontró un c 2 de 23.35, lo cual lo ubica en la región de rechazo de la hipótesis nula, por lo cual, según este resultado, el modelo no es adecuado, ya que las discrepancias entre los Probits esperados y los obtenidos son significativas. Igual situación se presentó en la determinación de la DL50 para hojas y raíz a las 48 horas.
c 2 para un nivel de confianza del 95% y n-2 grados de libertad, donde se observa el valor
que cae en la región de rechazo y el que cae en la región de aceptación
El método de la máxima verosimilitud consiste básicamente en una serie de aproximaciones, utilizando el método de los mínimos cuadrados, para encontrar la mejor línea Ldp; una vez hallada se procede a interpolar el valor de Probit = 5, para hallar el Log10DL50; la adecuación del modelo (c 2) y los intervalos de confianza. Este método mostró consistencia y reproducibilidad en los resultados además de ser relativamente sencillo, ya que una vez construida la tabla de cálculo solo es necesario introducir los datos. El ajuste de la línea Ldp puede observarse en las figuras 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
Figura 7. Gráfica Ldp, para extracto de hojas de Cordia spinescens a las 24 horas, utilizando el método de la máxima verosimilitud
Figura 8.
Gráfica Ldp, para extracto de hojas de Cordia spinescens a las 48 horas, utilizando el método de la máxima verosimilitud.
Figura 9. Gráfica Ldp, para extracto de raíz de Cordia spinescens a las 48 horas, utilizando el método de la máxima verosimilitud
Figura 10. Gráfica Ldp, para dosis de ácido piroleñoso obtenido de cisco de café a las 24 horas, utilizando el método de la máxima verosimilitud
Figura 11. Gráfica Ldp, para dosis de ácido piroleñoso obtenido de nogal a las 24 horas, utilizando el método de la máxima verosimilitud
Figura 12. Gráfica Ldp, para dosis de ácido piroleñoso obtenido de guadua a las 24 horas, utilizando el método de la máxima verosimilitud
Se debe ser cuidadoso en la elección de la corrección de la mortalidad, la más ampliamente utilizada y citada es la formula de Abbott; la corrección basada en la supervivencia (Eq. 7), si bien ofrece mayor linealidad cuando la mortalidad es muy baja, tiende a dar valores más bajos para la DL50.
El método gráfico presenta dos procedimientos para encontrar la ecuación de la gráfica, sin embargo, uno de ellos parte de la suposición, sin tener en cuenta la verdadera relación entre las variables para encontrar la pendiente, por lo cual ésta puede ser sobredimensionada. Por lo tanto es aconsejable utilizar el método de los mínimos cuadrados.
El método de la máxima verosimilitud presenta límites de confianza más amplios, pero una mayor precisión en el valor de la DL50, ya que encuentra la gráfica de Probit más ajustada.
Con la utilización de programas informáticos como OriginÓ de Microcal™, y ExcelÓ de Microsoft™, es posible la simplificación de las operaciones matemáticas y realización de gráficas, mientras se sigue un control preciso del método empleado.
AGRADECIMIENTOS
A la Sra. Nancy Ayala, funcionaria de la Oficina de Planeación y Desarrollo de la Universidad del Quindío, quien logró el contrato CNR-04-99 entre el Centro de Ciencia y Tecnología de Antioquia, Universidad del Quindío, Colciencias y el Laboratorio Colombiano de Diseño (Armenia, Quindío) para el proyecto "Apoyo a la Investigación sobre materias Primas para la Reactivación Productiva del Sector Artesanal en la Zona Cafetera" y del cual el subproyecto "Inmunización Natural para el Bejuco Tripeperro" es el objeto del presente artículo.
También expresamos nuestros agradecimientos al profesor Oscar Otalvaro de la Universidad del Quindío por su orientación en estadística; a Deysi Yined Zuluaga, Anderson Guarnizo Franco y Cesar Augusto Angulo Pachón Químicos de la Universidad del Quindío por su trabajo con la Artemia salina.
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