Análisis del procedimiento para la determinación de la dl50 (página 2)

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12. MILLER, J.C. y J.N. Miller, Estadística Para Química Analítica, 2° edición, Addison-Wesley Iberoamericana, Wilmington, Delaware, USA. 1993.

ANEXO 1.

1. Incubación de huevos para la obtención de larvas. Se adecua un recipiente plástico, de tal forma que quede dividido en dos secciones por un tabique del mismo material al cual se le acondicionan pequeños agujeros, la mitad del recipiente se oscurece con papel carbón en su exterior. Se agregan, en la parte oscura del recipiente, aproximadamente 0.1 gramos de huevos de Artemia salina por cada litro de solución salina, la cual se prepara disolviendo 38 gramos de sal marina en un litro de agua potable comercial (manantial®, Brisa®, caribe®, etc.); la utilización de agua comercial en lugar de agua destilada se debe al bajo nivel de DO (Oxigeno Disuelto) en el agua destilada, la cual para su obtención es sometida a un fuerte proceso de destilación que elimina la mayor parte del oxigeno disuelto en ella; este cambio permite eliminar del procedimiento el suministro de aire a través de bombas. A las 48 horas a temperatura ambiente e iluminación constante las larvas de Artemia salina Leach son tomadas de a diez para someterlas a las diferentes concentraciones de los extractos.

2. Preparación de extractos y adición de larvas. A partir del residuo seco del extracto etanólico obtenido por lixiviación de la especie vegetal, se prepara con agua destilada un patrón de 1000 mg de extracto por litro de solución, del cual se preparan ocho diluciones de 6, 10, 24, 50, 100, 240, 500 y 1000 PPM de concentración; con el ácido piroleñoso se realiza el mismo procedimiento a partir del reactivo analítico. Se adiciona un mililitro de cada dilución de extracto en un vial, se transfirieren diez larvas de Artemia salina, tomadas con una jeringa, en aproximadamente un mililitro de solución salina y se completa hasta cinco mililitros con la misma solución salina en la que estaban las larvas, paralelamente se prepararan cinco blancos por dilución de extracto de la siguiente forma: se toman 10 larvas en un vial y se completa el volumen de cada uno a 5 mililitros con solución salina en la cual estaban las larvas. Se incuban los tubos a la luz de una bombilla durante 24 horas, al cabo de los cuales se cuenta el número de larvas muertas en cada tubo, después de este primer conteo se dejan los viales en las mismas condiciones y se cuentan las larvas muertas al cabo de 48 horas de sembradas.

3. Análisis estadístico, obtención de la DL50. Con los datos obtenidos se determina la DL50 con el 95% de confianza utilizando el método Probit.

ANEXO 2

1. Con el efecto obtenido, mortalidad en este caso, se encuentra el respectivo valor de Probit (denominado Probit observado o empírico).

2. Se realiza la gráfica de los Probits observados y las dosis metamétricas (X), es decir el Log10 de las dosis; se traza una línea recta que tome la mayoría de los puntos. El programa OriginÓ , de Microcal™, simplifica enormemente este paso.

3. Usando esta línea recta o su ecuación se encuentran los Probits esperados para cada valor de X. El programa OriginÓ o ExcelÓ , da la ecuación de la gráfica.

4. Se obtienen los Probits de "trabajo", utilizando para ello las tablas de Probit de trabajo para cada valor de Probit esperado y porcentaje de efecto (% mortalidad).

5. Para cada valor de Probit de trabajo se encuentra el correspondiente valor del coeficiente de ponderación (W).

6. Con estos valores es posible encontrar los estimativos de a y b , es decir, A y B, con el método de los mínimos cuadrados:

(Eq. 14)

A = Ymedia – B.Xmedia (Eq. 15)

Donde:

(Eq.16)

(Eq. 17)

(Eq. 18)

(Eq. 19)

(Eq. 20)

7. Con estos valores para cada X se puede encontrar una segunda aproximación a la línea de regresión.

8. Utilizando esta línea se puede encontrar un segundo grupo de Probits esperados para cada X y se repite el ciclo desde el paso 3, este procedimiento se repite hasta que no ocurra cambio significativo en la línea. Se puede comprobar la adecuación de la línea mediante el estadístico de prueba c 2.

(Eq. 21)

9. Para la línea final se obtiene el estimativo de la DL50, resolviendo para Y = 5, Log10DL50 = (5 – A)/B, o simplemente interpolando en la gráfica lineal final para Y = 5. Para hallar la SLogDL50, utilizada para expresar el intervalo de confianza, se utiliza la ecuación:

(Eq. 22)

El intervalo de confianza se expresa igual que en el método gráfico (Eq. 13).

Para la realización de estos cálculos se elaboró una tabla de calculo en el programa Excel®, la cual puede observarse en el anexo 3. Se muestran la primera y segunda Tabla de una serie de cuatro aproximaciones realizadas.

ANEXO 3

ANEXO 3 (CONTINUACIÓN)

ANEXO 4

ANEXO 4 (CONTINUACIÓN)

Pedro Nel Martínez Yepes

Jaiver Osorio

Químico de la Universidad del Quindío, Armenia, Colombia.

Este articulo salió publicado en la revista de investigaciones de la Universidad del Quindío Vol 4, N° 12, Septiembre.

ISSN 0121-795.