Cultivo in vitro de tejidos vegetales en Phaseolus sp (página 2)
Enviado por Jorge Liusvert P�rez P�rez
El Phaseolus acutifolius, tiene dos parientes silvestres que corresponden a P. acutifolius var. acutifolius y P. acutifolius var. tenuifolius. La primera de ellas distribuida en el sur de los Estados Unidos de América y norte de México, y la segunda desde Nuevo México, Estados Unidos de América hasta Chiapas, México (Azurdia et al., 1999).
El frijol tepari (P. acutifolius), ha sido cultivado desde hace mucho tiempo en Mesoamérica, y principalmente como legumbre en las zonas desérticas o con una larga temporada seca. Primero se describió una de sus formas silvestres, y la relación con la forma cultivada fue reconocida más tarde, al contrario de lo que ha ocurrido con las demás especies cultivadas del género Phaseolus (Debouck, 1999).
Los hallazgos arqueológicos han mostrado una gran antigüedad del cultivo de esta especie en el suroeste de Estados Unidos de América (donde habría penetrado a partir de México hace 1 200 años) y en la región mexicana de Puebla, donde existe hace 5 000 años. Su distribución geográfica se extiende desde Arizona y Nuevo México hasta Costa Rica (Debouck, 1999).
El P. acutifolius, es una planta tolerante a la sequía, que se desarrolla en regiones áridas o semiáridas, conocido como frijol del desierto. La planta es anual, trepadora, de tallos delgados y pilosos, con hojas delgadas y lineales. Las variedades trepadoras llegan alcanzar dos a tres metros de altura. Su sistema radicular es muy ligero y poco profundo, constituido por una raíz principal que puede alcanzar una profundidad de uno a dos metros y gran número de raíces secundarias con elevado grado de ramificación. Las semillas son aplanadas o reniformes, casi redondas, de seis a nueve milímetros de largo y tres a seis milímetros de ancho, de testa blanca, castaña o azul oscuro, uniforme o con manchas o puntos. Su inflorescencia es en forma de racimo axilar con dos a cinco flores (FAO, 2005).
El P. acutifolius, se distingue fácilmente por su germinación epigea, hojas primarias sésiles, folíolos romboidales agudos, pseudoracimos con dos a cuatro ramillas fructíferas, flores pequeñas de coloración rosada o blancas, con bractéolas muy pequeñas y triangulares, vainas con suturas marcadas con cinco a diez óvulos. Presenta autogamia dominante. Cultivo de ciclo corto con floración a los 27 – 40 días después de la germinación y maduración a los 60 – 80 días, con un hábito de crecimiento indeterminado (Stephens, 2000).
Los nutricionista caracterizan el frijol, como un alimento casi perfecto debido al alto contenido de proteínas 15 – 27 % (principalmente Phaseolin), fibras, carbohidratos complejos y otros complementos de la dieta como ácido fólico, hierro, zin, magnesio y potasio (Guidolin, 2003).
Las semillas del frijol tepari, son ricas en lectinas que a diferentes concentraciones inhiben el crecimiento de células cancerígenas e inducen apoptosis, el grano seco es rico en hidratos de carbono con un alto contenido de lisina y rico en proteínas entre un 23 – 25 %, sin embargo, como en el caso de otras leguminosas, la proteína es deficiente en metionina. Se ha indicado que tiene potencial como donador de genes para obtener mejores variedades de frijol desde el punto de vista culinario, nutricional y toxicológico (Hernández y León, 1994; FAO, 2005).
Cultivo de tejido y regeneración in vitro
El cultivo de tejidos vegetales, es un conjunto de técnicas que permiten el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos, células y protoplastos empleando medios nutritivos artificiales (Jiménez, 1998).
La habilidad de hacer que células de plantas formen órganos y hasta plantas enteras es una importante herramienta en el mejoramiento de cualquier especie, permitiendo el acceso a técnicas como mutagénesis in vitro, selección in vitro, utilización de variantes somaclonales, rápida micropropagación y en especial la transformación genética (Gamborg y Phillips, 1995).
El cultivo de tejidos y la regeneración in vitro de plantas en Phaseolus spp., a tenido serias dificultades desde los primeros intentos realizados en P. vulgaris por Hildebrandt desde 1963 hasta 1975 y Crocomo en 1976 (Nagl et al., 1997). Desde entonces un protocolo eficiente para la embriogénesis somática y la organogénesis ha estado careciendo. Un poco prometiendo aparecen los resultados para el Phaseolus coccineus y el P. acutifolius (Santangelo, 2000 y Dillen et al., 1997).
Desde entonces, aunque diversas combinaciones de reguladores del crecimiento, explantes y condiciones de cultivo han sido estudiadas, no se ha podido regenerar plantas de Phaseolus eficientemente a partir de embriones somáticos (Zambre et al., 2001).
Dos tipos de tejidos jóvenes mantienen la totipotencia celular: los meristemas apicales o axilares y tejidos inmaduros o tejidos de semillas recién germinadas (Santangelo, 2000).
Existen dos vía fundamentales empleadas en la regeneración in vitro de plantas: organogénesis y embriogénesis somática.
La organogénesis, generalmente ocurre por la optimización de la relación citoquinina – auxina en el medio de cultivo, y ocurre por la diferencia de órganos y brotes directamente del explante o del callo pudiendo organizarse de una única célula o de un conjunto de células, la cual se caracteriza por ser una estructura unipolar con una amplia conexión vascular de los órganos formados con el explante (Thorpe, 1995).
La regeneración in vitro vía organogénesis en el género Phaseolus ha sido intentada a partir de explantes como cotiledones (Hernández et al., 2002), brotes caulinares (Eissa et al., 2002), yemas axilares (Brinks, 2000), segmentos de hojas (Kumar et al., 1988), pecíolos (Radeva y Lilota, 2005) y embriones cigóticos (Popelka et al., 2004).
Algunos investigadores han obtenido organogénesis directa a partir de brotes apicales de los embriones cigóticos en P. vulgaris, P. coccineus y P. acutifolius (Malik y Saxena, 1992 b), así como cultivo de meristemos apicales y axilares con altas concentraciones de citoquininas, en P. vulgaris y P. acutifolius (Mohamed et al., 1992 a; Malik y Saxena, 1992 a).
Sin embargo, los resultados de regeneración vía organogénesis indirecta son limitados en especies Phaseolus. La inducción de callos morfogénicos ha sido descrita en P. acutifolius (Kumar et al., 1988 y Dillen et al., 1997), P. coccineus (Genga y Allavena, 1991), Vigna angulkaris (El-Shemy et al., 2002) y P. polyanthus (Zambre et al., 2001).
De Carvalho et al. (2000) usaron la tecnología de la "capa de célula fina", a partir de brotes apicales de embriones cigóticos germinados in vitro para regenerar brotes de Phaseolus vulgaris vía indirecta donde un tratamiento inicial con 2.75 mg.L-1 TDZ incrementó la frecuencia de regeneración de las yemas.
La primera descripción de embriogénesis somática in vitro fue obtenida de forma independiente por Steward en 1958 y Reinert en 1959, trabajando con zanahoria (Daucus carota L), confirmando la predicción de Haberlandt"s, de que los embriones somáticos pueden formarse de simples células en cultivo in vitro (Jiménez, 2001).
La embriogénesis somática, es en el cultivo de tejidos vegetales el proceso de iniciación de un embrión somático y su desarrollo a partir de células vegetativas o no gaméticas (Bhojwari y Razdan, 1996).
La diferencia principal con la embriogénesis cigótica radica, en que las células que dan origen al embrión somático no son el resultado de la fecundación sexual (Carlota et al., 1997), además de mantener la misma combinación genética que el de la planta fuente del explante (Parrott, 1993).
El uso de la embriogénesis somática para la propagación seguirá aumentando según hayan protocolos más avanzados y refinados capaces de producir embriones somáticos morfológicamente normales, sin variación somaclonal y con capacidad para germinar y convertirse en plantas rápida y eficazmente (Parrott, 2002).
Entre las ventajas que ofrece la embriogénesis somática está, la posibilidad de obtener volúmenes de producción superiores en un menor tiempo, lo cual convierte a este sistema en una vía de regeneración potencialmente más eficiente que la regeneración vía organogénesis (Villalobos y Thorpe, 1991). Además, la disponibilidad de protocolos para la obtención de embriones somáticos es clave para la automatización de la micropropagación y la consecuente reducción de costos para su implementación a escala comercial (Olmos et al., 2004).
La característica sobresaliente de los embriones somáticos es que se desarrollan de células somáticas y por lo tanto, presentan la potencialidad de producir duplicados de un genotipo específico; esta característica permite la multiplicación de células somáticas a las cuales se les han introducido genes específicos por ingeniería genética y así, los individuos genéticamente modificados pueden ser multiplicados en forma segura y eficiente, evitando los riesgos de incorporación de genes extraños meióticamente inestables en el resto del germoplasma (Artola, 2004).
Sus desventajas radican en el desconocimiento que existe sobre los parámetros que regulan este proceso y el limitado número de especies en las cuales se describe una embriogénesis somática eficiente que permita la aplicación del método (Jain, 2000).
Existen dos vías para desarrollar el proceso de embriogénesis somática que son:
La vía indirecta, que requiere una fase intermedia de callo formado por un conjunto de diferentes tipos de células no organizadas y que conservan la capacidad de dividirse. Una vez organizado el callo este prolifera, se inicia la formación de pro-embriones, usualmente en este medio de cultivo con altas concentraciones de auxinas y luego se transfieren los callos a un medio de cultivo con menores concentraciones de reguladores del crecimiento para inducir la formación de los embriones somáticos a partir de los pro-embriones iniciales. Este fenómeno se conoce como Células Embriogénicas Determinadas Inducidas (Tisserat, 1991).
La vía directa, involucra la formación de los embriones somáticos en una parte del tejido del explante sin la formación de callos, ya que las células dentro de un embrión cigótico son de por si embriogénicas, es posible inducirlas para que estas se dividan para formar un embrión somático. En este caso, las células pre-existentes se dividen directamente para formar un embrión somático. Éstas se conocen como Células Embriogénicas Pre-Determinadas (Parrott, 2002).
Existen dos tipos de embriogénesis somática indirecta, una conocida como embriogénesis somática de baja frecuencia y otra denominada embriogénesis somática de alta frecuencia. En la primera, el número de callos con embriones somáticos es mayor, aunque se forman pocos embriones somáticos por callo; estos embriones aparecen entre las 12 – 14 semanas de cultivo, aislados o en pequeños grupos y se desarrollan completamente pasando por los diferentes estadios de desarrollo, mientras que en la segunda, aparecen entre las 16 – 20 semanas de cultivo, no se desarrollan completamente y se mantienen en estado globular, agrupados en un número mucho mayor, en un número menor de callos (Gómez, 1998).
La regeneración de plantas vía embriogénesis somática ha sido descrita en otras especies de leguminosas como soya (Glicine Max (L.) Merrill) maní (Arachis hipogea) y chícharo (Pisum sativum) (Droste et al., 2001; Chandra y Pental, 2003).
En soya y maní, han sido establecidos cultivos de callos con estructuras embriogénicas y la embriogénesis somática directa ha sido observada en chícharo, maní y garbanzo (Cicer arietinum). La inducción de embriones somáticos vía suspensiones celulares se ha obtenido en Vigna spp (Chandra y Pental, 2003). Por otra parte, la embriogénesis somática y el subsiguiente desarrollo de plantas ha sido desarrollado en P. coccineus (Genga y Allavena, 1991) y frijol común (Mohamed et al., 1993).
Anand et al. (2000) regeneraron plantas de frijol caupí (Vigna unguiculata (L.) Walp.), vía embriogénesis somática a partir de hojas primarias jóvenes.
Devi et al. (2004) indujeron embriogénesis somática en explantes cotiledones maduros, hipocótilos, segmentos nodales y hojas de dos cultivares de Vigna radiata (L.) Wilczek en sales MS suplementadas con diferentes concentraciones de reguladores del crecimiento.
Todas las células somáticas dentro de la planta contienen la información genética necesaria para crear una planta completa y funcional. La expresión temporal y espacial de los genes es fuertemente regulada para permitir la diferenciación de varios sistemas de órganos, así como el desarrollo de una planta (Jiménez, 2001).
Para aprovechar las potencialidades que el embrión somático ofrece, es vital entender los mecanismos involucrados en la transición de una célula somática o del gametofito en una célula embriogénica (Mordhorst et al., 1997).
El tejido embriogénico se caracteriza por células pequeñas, ricas en citoplasma, y asimétricas. Las células dentro de los tejidos embriogénicos pueden dividirse y mantener su estado embriogénico mientras estén expuestas a suficiente auxina. Estos tejidos van creciendo y forman masas conocidas como: masas embriogénicas, centros embriogénicos, complejos proembrionales, o masas pro-embriogénicas (Parrott, 2002).
Aún para aquellas especies en las cuales es posible la embriogénesis somática, los embriones generalmente sólo se pueden obtener de ciertos tejidos en ciertas etapas de desarrollo, o de ciertos genotipos dentro de la especie. La relativa habilidad de un tejido y genotipo dado para formar embriones somáticos se conoce como "competencia embriogénica" (Parrott, 2002).
En el caso de un tejido no embriogénico se puede inducir las células a un estado embriogénico mediante la exposición a reguladores de crecimiento, cambios en el pH, tratamientos con sustancias químicas o calor (Mordhorst et al., 1997).
En el caso de las plantas monocotiledóneas, los embriones somáticos pasan por diferentes etapas de desarrollo embrionario: globular, escutelar y coleoptilar (Noceda, 1999).
En dicotiledóneas, la etapa globular es seguida por la etapa corazón que se corresponde con la adquisición de la simetría bilateral: desarrollo de la epidermis, de los estratos procambiales y, de manera sucesiva, el desarrollo del ápice radical. El ápice de tallo se desarrolla más tarde en la etapa cotiledonal. En los embriones somáticos de algunas especies, existe una etapa intermedia entre globular y corazón llamada oblonga, que corresponde a la individualización del ápice de la raíz y al procambium en respuesta a la elongación axial del embrión somático debido al transporte de auxinas (Radice, 2004).
Otro tipo de desarrollo del embrión tiene lugar en las coníferas que incluye tres fases embrionarias, la cotiledonal y globular tempranos, y los embriones cotiledonales tardío (Dong y Dunstan, 2000).
Cuando el nivel de auxinas en el medio de cultivo baja más de cierto umbral, las células embriogénicas empiezan un proceso de histodiferenciación. Los embriones que se van histodiferenciando crecen debido a la división celular, y pasan por las mismas etapas de desarrollo que los embriones cigóticos (Parrott, 2002).
Aunque la forma corazón y torpedo han definido los embriones tradicionalmente como fases separadas del desarrollo del embrión, la distinción entre ellos está aparentemente basado en la diferencia del tamaño. Estas diferencias tienen su causa de origen en que los embriones de plantas monocotiledóneas comienzan por un solo cotiledón y por consiguiente no proceden a través de una fase de corazón (Kaplan y Cooke, 1997).
Uno de los más poderosos aspectos de la embriogénesis somática que permite su aplicación en la propagación masiva y la transferencia de genes, es la habilidad de los cultivos embriogénicos de muchas especies de plantas a proliferar o multiplicarse indefinidamente (Merkle et al., 1995).
La proliferación de células embriogénicas es aparentemente influenciada por un número de factores, algunos de los cuales pueden ser controlados durante el proceso, y otros que todavía no han sido definidos, siendo muchos de éstos los mismos que afectan el proceso de inducción de la embriogénesis (Barranco, 2001).
Los procesos de multiplicación, han recibido varios términos como embriogénesis secundaria, recurrente, accesoria o repetitiva. La embriogénesis repetitiva ocurre cuando al aumentar el nivel de auxinas exógenas, se llega a un punto en que la histodiferenciación no pasa más allá de la etapa globular. En este caso, los embriones nuevos se forman en el embrión original, y estos a su vez llegan a la etapa globular, donde cesa su desarrollo y forman nuevos embriones. Este proceso se repite indefinidamente mientras el nivel de auxina exógena sea lo suficientemente alto (Parrott, 2002).
La fase de maduración es un complejo período de desarrollo del embrión somático en el cual ocurre la expansión de la célula y la acumulación de sustancias de reserva y se adquieren tolerancia a la desecación (Parrott, 1993).
En esta etapa juega un papel fundamental la presencia de nitrógeno en el medio de cultivo, siendo necesaria la adición de nitratos, amonios, aminoácidos y caseína hidrolizada. Los carbohidratos entre ellos la sacarosa en concentraciones de tres a seis porciento son esenciales, junto a bajas concentraciones de oxígeno en el medio de cultivo, lo cual permite una total maduración de los embriones somáticos y evita la germinación precoz (Merkle et al., 1995).
Diferentes patrones en la acumulación de sustancias de reserva en el embrión somático pueden dirigir las modificaciones de diferentes protocolos que pudieran elevar el desarrollo y posterior rendimiento de la planta. Varios estudios han usando como marcadores de la calidad del desarrollo del embrión somático, sustancias de reserva como la acumulación de proteínas, lípidos y almidón (Merkle et al., 1995).
McKersie y Bowley (1996) encontraron que la adición de prolina como suplemento del medio de cultivo favorece el número de embriones somáticos en estados avanzados y el tamaño de los embriones de alfalfa (Medicago sativa L).
El término germinación, se refiere al desarrollo de la raíz o el brote, o ambos a partir de embriones somáticos (Merkle et al., 1995), mientras que la conversión, se emplea para indicar la supervivencia y desarrollo de los propágulos obtenidos como resultado de la germinación bajo las condiciones de en un ambiente ex vitro (Noceda, 1999).
Las plantas in vitro se desarrollan en condiciones de alta humedad y baja intensidad luminosa por lo que al pasar a la fase de aclimatización se producen cambios bruscos en los niveles de CO2, iluminación y humedad relativa lo que provoca una excesiva pérdida de agua a través de las hojas (Aguilar et al., 2000).
En muchos casos durante la maduración se induce la dormancia, por lo que son necesarios tratamientos con frío o aplicaciones de AG3 que aceleran la germinación y crecimiento del embrión, también tratamientos con citoquininas contrarrestan el efecto provocado por la auxina durante la inducción y proliferación (Gómez, 1998). Tratamientos de secado parcial del embrión somático aumentan, normalizan y sincronizan la germinación, además aplicaciones de ABA, prolina y tratamientos con calor inducen la tolerancia a la desecación (Merkle et al., 1995).
Generalmente se han empleado las sales MS (Murashige y Skoog, 1962) o alguna otra modificación de esta formulación ya que parece que la alta concentración de sales es beneficiosa para el crecimiento de los embriones somáticos. Se requieren altas concentraciones de potasio, magnesio, fosfato y sulfato para un adecuado crecimiento celular, además de hierro, el cual es imprescindible para que los embriones somáticos alcancen la madurez (Gómez, 1992).
La composición y concentración de los reguladores de crecimiento en el medio de cultivo son factores determinantes para el crecimiento y normal desarrollo de la mayoría de las plantas en los sistemas de cultivo in vitro (Guidolin, 2003).
Se considera que las auxinas juegan un doble rol, donde el nivel endógeno de la auxina provoca la polaridad de las masas embriogénicas indispensable para la inducción de embriogénesis somática, mientras que las auxinas añadidas exógenamente pueden difundirse dentro de las masas embriogénicas y cancelar la polaridad (Nomura y Komamine, 1995).
El 2,4-D auxina muy utilizada en la formación de embriones somáticos puede producir variabilidad genética y aunque los mecanismos de dicha variabilidad no se han determinado aún, parecen estar expresados por un afectación de la división celular que provoca mutaciones cromosomales (Merkle et al., 1995).
En algunas investigaciones donde se han estudiado varias auxinas se ha observado que el AIA y el ANA promueven la formación de estructuras embriogénicas, mientras que el 2,4-D estimula la formación de callos de menor tamaño, poco compactos y con menor capacidad de regeneración (Trejo et al., 2002).
En las angiospermas, el AIA regula ambas fases de desarrollo embrionario a través de diversos mecanismos tales como vías alternativas para la biosíntesis de auxinas, control de los niveles de auxinas y gradientes de concentración (Ljung et al., 2002). El alto nivel de auxina libre surge para mediar la rápida proliferación de crecimiento celular durante el estado inicial de la embriogénesis cigótica en Daucus carota L (Ribnicky et al., 2002).
Las citoquininas juegan un importante papel en la regulación de la división celular e intervienen como las auxinas en el control de muchos aspectos del crecimiento y del desarrollo de las plantas. La formación de raíces, parte aérea y callo en el cultivo de tejido son reguladas por la disponibilidad e interacción de estas dos clases de reguladores de crecimiento (Frank y Schmülling, 1999).
El papel de las citoquininas es menos claro en el medio de inducción de embriones, aunque normalmente el medio de cultivo incluye una de ellas, mientras que su presencia en el medio de proliferación podría promover la división celular. Su incorporación al medio de cultivo durante la histodiferenciación compensa el efecto negativo inducido por las auxinas sobre el desarrollo del meristemo y suelen ser esenciales para la maduración y germinación de los embriones somáticos (Bhojwari y Razdan, 1996). Además, están envueltas en la diferenciación de cloroplastos, metabolismo de nutrientes, pérdida de dominancia apical y retardo de la senescencia de las hojas (Gonneau et al., 1998).
El thidiazurón, fue desarrollado originalmente para su utilización como defoliante del algodón (Gossypium spp) (Huetteman y Preece, 1993), además ha sido muy empleado en la inducción de procesos morfogénicos (Murthy et al., 1998).
La propiedad biológica del TDZ como regulador del crecimiento en cultivo de tejidos de Phaseolus spp., fue demostrada primeramente en callos de Phaseolus lunatus cv. Kingston. También ha presentado buenos resultados en diferentes protocolos de regeneración en otras especies del género Phaseolus entre las que se encuentra P. acutifolius (Zambre et al., 1998; De Carvalho et al., 2000; Zambre et al., 2001).
A bajas concentraciones, el TDZ induce la formación de brotes en el frijol común, demostrado ser una citoquinina muy activa a bajas concentraciones (Huetteman y Preece, 1993). También se ha utilizado para estimular la embriogénesis somática en varias especies como Arachis hipogea, Pisum sativum y Cicer arietinum, sin embargo, todavía no se ha podido emplear para desarrollar protocolos de transformación reproducibles (Chandra y Pental, 2003).
Mohamed et al. (1993) y Zambre et al. (1998) emplearon combinaciones de TDZ y AIA en la obtención de plantas a partir de callos en P. vulgaris L. cv. Xan 159 y GN Tara, lo cual puede estar influenciado, por un factor genético heredado de P. acutifolius que favorezca la regeneración de plantas a partir de callos, ya que ambos genotipos provienen de cruzamientos interespecíficos con P. acutifolius.
En algunas especies vegetales, han sido relatadas algunas desventajas asociadas con el uso del TDZ como hiperhidricidad, morfología anormal de las hojas, yemas cortas y no elongadas, disminución o eliminación del enraizamiento (De Lima et al., 1998).
El AG3 ayuda a la normal maduración y a la germinación de los embriones somáticos y el ABA, el cual reprime la embriogénesis somática, reduce la formación secundaria de embriones a partir de embriones somáticos y la germinación precoz (Chee, 1996).
Es muy frecuente que una gran cantidad de trabajos de micropropagación están relacionados con la composición de los reguladores del crecimiento del medio de cultivo, como elemento decisivo en la respuesta in vitro del material vegetal, sin embargo, muchos autores han investigado acerca de la influencia del ambiente físico, demostrando su importancia frecuentemente subestimada en las investigaciones (Licea, 2001).
Un aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo que depende, además, de la especie empleada. Las diferentes tipos y calidades de gelificantes existentes en el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento (Radice, 2004).
La atmósfera gaseosa, es un factor determinante en los procesos morfogénicos condicionada por el tipo y tamaño de envase seleccionado así como por el sistema de cobertura del mismo. En cultivos in vitro se han registrado, etileno y otros compuestos hidrocarbonatos (Radice, 2004).
Villalobos y Thorpe (1991), señalan que la luz y la temperatura han sido los factores físicos considerados más importante en la micropropagación.
La luz es uno de los factores que determina el desarrollo de los organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar la luz en los cultivos in vitro (Pelacho et al., 2002).
El fotoperíodo, puede afectar los niveles internos de los reguladores del crecimiento, donde cambios en la intensidad luminosa pueden causar organogénesis y cambios morfológicos específicos debido a la longitud de onda de la iluminación (Lizt y Jarret, 1993).
Determinadas longitudes de onda son las que mejor aprovechan las plantas para realizar sus funciones vitales de fotosíntesis fototropismo o fotomorfogénesis y son concretamente las del azul y rojo (Escobar, 2000).
La selección del explante podría ser el factor clave que determina el éxito o no de un protocolo de embriogénesis (Brown et al., 1995).
Es muy importante para lograr el éxito de la embriogénesis somática que el explante sea obtenido de plantas altamente vigorosas, en especial de los órganos y tejidos inmaduros que son los que generalmente permiten obtener mejores resultados (Bidot, 2001).
Comúnmente se han utilizado como explantes, cotiledones, hipocótilo, embriones cigóticos, ápices caulinares, segmentos de tallos, hojas, raíces e inflorescencias inmaduras (Lizt y Jarret, 1993).
Eissa et al. (2002), obtuvieron en P. vulgaris que células jóvenes procedentes de yemas axilares tuvieron una mejor respuesta que los cotiledones a las aplicaciones exógenas de los reguladores del crecimiento 6-BAP y ANA. Dillen et al. (1996) y Zambre et al. (1998), observaron que solamente los explantes que contenían meristemos (yemas axilares y apicales de plantas que crecieron en casas de cultivo y los segmentos nodales de las plantas germinadas in vitro) indujeron la formación de callos morfológicos.
Las dificultades en la regeneración de P. vulgaris probablemente es producto de variaciones fisiológicas adquiridas por los explantes obtenidos de plantas que crecen bajo condiciones de casa de cultivo. Además, los explantes derivados de semillas, habitualmente forman una mayor cantidad de callos que los explantes tomados de yemas de las plantas en P. polyanthus así como P. vulgaris y P. acutifolius (Zambre et al., 2001).
Se plantea, que la morfología de los explantes utilizados durante el proceso de transformación mediante biobalística puede influenciar grandemente en la recuperación de las plantas transgénicas de frijol (Aragão y Rech 1997).
El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfogénicos desde la capacidad del explante para su establecimiento en condiciones in vitro así como para la proliferación de callo, o la diferenciación y crecimiento de nuevos órganos (Radice, 2004).
La capacidad embriogénica de un explante depende en gran medida del genotipo, incluso dentro de la misma especie lo que refleja diferencias en el poder de activación de las rutas embriogénicas (Parrott, 1993).
Según Yamada et al. (2001) la eficiencia en la regeneración in vitro de plantas de frijol depende de las concentraciones óptimas de los reguladores del crecimiento y el genotipo.
Recientes avances en el cultivo de tejidos de especies ha ofrecido la oportunidad de producir cultivares que no pueden ser obtenidos por métodos de mejoramiento convencional, pero los protocolos de regeneración han estado influenciados por el genotipo, por ello, no es posible generalizar metodologías de trabajo (Santalla et al., 1998).
Un procedimiento de regeneración aplicado en plantas élites de P. vulgaris y P. coccineus empleando como explantes brotes apicales de los embriones cigóticos germinados, se obtuvo que la respuesta al cultivo in vitro y su capacidad de regeneración varió significativamente entre las especies y genotipos, produciendo P. coccineus más brotes por explantes con una mayor eficiencia de enraizamiento que P. vulgaris. Este efecto significativo del genotipo, sugiere que los factores genéticos son importantes en la respuesta en el cultivo de tejido in vitro (Santalla et al., 1998).
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Autor:
Jorge Liusvert P?rez P?rez
Centro de Estudios de Biotecnolog?a Vegetal, Universidad de Granma, Cuba.
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