Controles internos para la detección de micoplasmas contaminantes por PCR

Las contaminaciones causadas por micoplasmas constituyen uno de los problemas más importantes y frecuentes cuando se trabaja con líneas y cultivos celulares, sueros para la elaboración de medios de cultivo y en la industria de productos biofarmacéuticos. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha sido ampliamente utilizada para la detección de micoplasmas contaminantes.La presencia de sustancias que pueden inhibir la amplificación de los ácidos nucléicos en cultivos celulares, suero y algunos productos de interés biomédico como vacunas, constituye una limitación de la PCR como método diagnóstico ya que puede disminuir su sensibilidad y por tanto su eficiencia. Es por esto que en la actualidad los sistemas de diagnóstico de micoplasmas contaminantes por PCR incluyen entre sus controles de calidad un control interno de amplificación que permita la detección de resultados falsos negativos ocasionados fundamentalmente por la presencia de inhibidores en la reacción. El presente trabajo tuvo como objetivo suministrar una revisión actualizada sobre el uso de controles internos en los ensayos de PCR desarrollados para la detección de micoplasmas contaminantes en cultivos celulares, suero y productos biofarmacéuticos, resaltando los principales tipos de controles internos utilizados en cuanto a estrategias de diseño y amplificación de los mismos.

Palabras clave: micoplasmas, CIA, PCR, inhibidores, diagnóstico

Abstract

Mycoplasmas contamination is one of the most serious and common problems of lines and cell cultures management and in the biopharmaceutical industry .PCR techniques have been widely used for contaminant mycoplasmas detection. The presence of substances that can inhibit nucleic acids amplification in cell cultures, serum and in some products of biomedical interest as vaccines constitutes a limitation of the PCR as a diagnostic method due to it can reduce its sensitivity and therefore its efficiency. That is why, nowadays, mycoplasmas diagnostic systems include in its quality controls, an internal control that allows the identification of amplification inhibitors and false-negatives results within the assay. The aim of this article was to provide an updated review of the use of PCR internal controls for mycoplasmas detection in cell cultures, serum and biopharmaceutical products, the main types of internal controls used regarding of design and amplification strategies.

Key words: mycoplasmas, internal control, PCR, inhibitors,diagnosis

Introducción

Los micoplasmas constituyen un amplio grupo de microorganismos pertenecientes a la clase Mollicutes , (del latín molli: suave y cutes: piel ),que se distinguen del resto de las bacterias por la ausencia de pared celular,(1).

Fueron reportados por primera vez en 1898 por los científicos Nocard y Roux en el Instituto Pasteur, tras el cultivo exitoso del agente de la Pleuroneumonía Contagiosa Bovina,(2) .

Los micoplasmas fueron considerados durante mucho tiempo como virus, debido a su diminuto tamaño y la capacidad de atravesar filtros que bloquean el paso de bacterias ordinarias; hasta 1930 en que se descubrió la verdadera naturaleza de los virus y se hizo evidente que los micoplasmas no podías ser definidos como tales ya que presentan ambos tipos de ácidos nucleicos, crecen en medios artificiales y se dividen por fisión binaria, al igual que las bacterias. Con el descubrimiento en 1935 de las formas L bacterianas, los micoplasmas fueron considerados dentro de este grupo debido a las similitudes en su morfología microscópica y la forma típica de huevo frito de sus colonias.La presición de los criterios morfológicos, a través, del estudio de la ultraestructura de los micoplasmas , sus propiedades bioquímicas y antigénicas, permitió su posterior separación taxonómica de las formas L bacterianas ,(3).

El término "mycoplasma" (del griego: " mykes" que significa hongo y "plasma" que significa algo formado y moldeado ) fue acuñado por los investigadores Edward y Freundt en los años ´50 , siendo usado para describir al único micoplasma conocido hasta ese momento, la especie M. mycoides,la cual tiene la característica distintiva entre las otras especies , de presentar un patrón de crecimiento semejante al micelio fungal ,reemplazando de esta forma al término "organismos semejantes al de la pleuropneumonia" ,(en inglés PPLO: pleuropneumonia like organisms"),(2).

Un gran número de especies de micoplasmas han sido descritas como patógenos de humanos, mamíferos, reptiles, peces, artrópodos y plantas y cada vez se descubren nuevos hospederos,(1). Además de su importancia como agentes patógenos, los micoplasmas se consideran como uno de los contaminantes más frecuentes e importantes de sueros,cultivos celulares y en la industria biofarmacéutica desde la etapa de investigación hasta la fase de desarrollo clínico , (4).

Los micoplasmas como contaminantes de cultivos celulares, sueros y productos biofarmacéuticos

En 1956 Robinson y colaboradores reportaron la primera infección por micoplasmas en cultivos celulares, al detectar la presencia de estos microorganismos como contaminantes en controles negativos de cultivos celulares,(2).

Actualmente se reporta que entre el 15 y el 80% de los cultivos celulares testados están infectados con micoplasmas,(5-6).La incidencia de contaminación por una sola especie de micoplasma es de un 15 a un 35% a nivel mundial, pudiendo llegar hasta un 65 a 80%, mientras que la incidencia de contaminación simultánea por 2 o más especies oscila entre un 7 y un 60%,(7-8). Entre las 20 especies de micoplasmas que han sido aisladas de cultivos celulares contaminados (9), M. arginini, M. hyorhinis, M. fermentans, M. orale y Acholeplasma laidlawii se han identificado como causantes del 95 % de las contaminaciones ,(5-6, 10). Se ha reportado M. orale como la especie de contaminante más común con una frecuencia de un 20 a 40%, seguido de M. hyorhinis con una frecuencia de 10 a 40%, la frecuencia de contaminación para el resto de las especies es de un 20 a 30% para M. arginini , de un 10 a un 20% para M. fermentans y M. hominis (9) y de un 5 a un 20% para Acholeplasma laidlawii, según la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ), 2004.Las especies M. orale, M. fermentans, y M. hominis se hallan comúnmente en el tracto orofaríngeo de los humanos , lo cual explica que el personal de laboratorio constituya una de las fuentes de contaminación de los cultivos celulares con micoplasmas. Las especies M. arginini y A. laidlawi han sido identificadas en el suero bovino , por otra parte M. hyorhinis es un patógeno frecuente de cerdos, de ahí que el suero bovino o porcino utilizado para la elaboración de los medios de cultivo pueda ser también una fuente de contaminación, (11).Otras fuentes de contaminación son el equipamiento de laboratorio, los tejidos usados para la elaboración de cultivos primarios y otras líneas celulares ya contaminadas, (8, 11).

Debido a la ausencia de pared celular estos microorganismos no producen turbidez en el medio que contaminan, tampoco cambio de coloración del mismo, provocando que la contaminación no sea muy evidente, sin embargo, los cambios morfológicos, bioquímicos, antigénicos y genéticos que provocan en las células infectadas pueden sugerir su presencia,(8, 12). Estas contaminaciones en la mayoría de las ocasiones pueden provocar severos daños a la célula, como son: alteraciones en el crecimiento (la monocapa tiene microscópicamente una apariencia arrugada y se aglutina durante la suspensión), en patrones de enzima, en la composición de la membrana celular, aparición de aberraciones cromosomales y la inducción de cambios citopatogénicos(3).Sus efectos dependen de la especie de micoplasma contaminante, el tipo de célula infectada, las condiciones de cultivo, y la intensidad y duración de la infección,(8, 13).Estas infecciones pueden alterar los resultados de experimentos biológicos o la calidad de los productos biofarmacéuticos,(13).

Diagnóstico

La detección de contaminaciones biológicas en productos biofarmacéuticos constituye un punto importante dentro de los sistemas de calidad, en este sentido existen normas muy estrictas establecidas por las agencias reguladoras y entre ellas, específicamente, normas que establecen la detección de micoplasmas como prueba determinante para la liberación o no de estos,(3, 14-16).

La implementación en la actualidad de programas de control de calidad más eficientes ha contribuido a la disminución de la frecuencia de contaminación por micoplasmas. La mejor vigilancia y manejo de los sueros, medios y materia prima por parte de los productores en la industria biofarmacéutica ha reducido significativamente la introducción potencial de micoplasmas a partir de estas fuentes, (4).

Para el diagnóstico e identificación de micoplasmas contaminantes se han empleado diversas metodologías que incluyen el cultivo microbiológico , métodos bioquímicos, inmunológicos y moleculares, (17-19). Entre los métodos descritos por la Farmacopea Europea 2007 para el diagnóstico de micoplasmas contaminantes en bancos y líneas celulares, semillas virales y células controles se encuentran el cultivo microbiológico y el método del cultivo celular indicador, este último se puede usar además para el análisis de medios de cultivo, mientras que para el diagnóstico en vacunas, cosechas virales y productos finales de producción el método recomendado es el cultivo microbiológico. Aunque se ha señalado que los procedimientos moleculares no pueden reemplazar totalmente a los métodos convencionales (20), los métodos de amplificación de ácidos nucléicos han sido aceptados por la Farmacopea Europea 2007 como métodos alternativos del cultivo microbiológico y del método del cultivo celular indicador, después de una adecuada validación de los mismos,(21).

En los últimos años las técnicas de hibridación de ácidos nucléicos (HAN) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido ampliamente utilizadas en la identificación de micoplasmas, (22-24) . La PCR actualmente se ha convertido en una herramienta muy útil y eficiente, no solo para la detección de micoplasmas contaminantes en cultivos celulares, suero y productos biofarmacéuticos, sino además para su identificación a nivel de género y especie, (13, 23). Con el objetivo de incrementar la sensibilidad en el diagnóstico se han desarrollado diferentes tipos de PCR tales como PCR anidado,(22) y RT-PCR , este último usa como molécula diana el ARN , la cual se encuentra en un mayor número de copias por célula que su correspondiente ADN,(10).Se han desarrollado otros tipos de PCR como PCR-ELISA,(25), PCR-RFLP ,(26),PCR múltiples, (27) y más recientemente PCR en tiempo real,(27-28) .Los ensayos de PCR para micoplasmas diseñados a partir de la región altamente conservada del ARNr 16S de los Mollicutes permiten diagnosticar un amplio rango de estos microorganismos. En nuestro laboratorio, MYCOLAB, se han empleado para el diagnóstico de micoplasmas en cultivos celulares, sueros y productos biofarmacéuticos, los cebadores diseñados por Van Kuppeveld y cols., 1994 a partir de una región del ARNr 16S de los Mollicutes. El uso de estos cebadores ha permitido la detección de un 15.6% de muestras contaminadas durante los años 2009- 2010, con respecto al cultivo microbiológico que solo permitió la detección de un 2. 4 % en el mismo período. También se han diseñado cebadores especie-específico complementarios a la región intergénica entre el ARNr 16S (29) y el 23S y cebadores complementarios al extremo 5´ del ARNr 23S (30). Los PCR especie-específico permiten tener una información sobre el posible origen de la contaminación identificando la especie de micoplasma contaminante (11), sin embargo, no permiten la detección de otras especies de Mollicutes que pudieran estar presentes (5, 13), en una infección mixta a no ser que se empleen varios cebadores especie-específicos, por ejemplo, en un formato múltiple.

Controles internos de amplificación en los ensayos de PCR para la detección de micoplasmas contaminantes

Inhibidores de la PCR en la detección de micoplasmas contaminantes

A pesar de las ventajas del PCR, en ocasiones su utilidad como método diagnóstico se ha visto afectada por la presencia de sustancias que inhiben la amplificación de los ácidos nucléicos en las muestras que se analizan. Estos inhibidores pueden afectar la sensibilidad de detección del ensayo, incluso cuando están presentes en pequeñas cantidades,(31), conduciendo a la generación de resultados falsos negativos (32) y a la búsqueda de métodos cada vez más eficientes de procesamiento de la muestra previo a la PCR para facilitar la amplificación del ADN diana en presencia de incluso trazas de sustancias inhibitorias de la amplificación,(31).

De manera general se han reportado diversas muestras biológicas como inhibitorias de la amplificación de los ácidos nucléicos. Algunos cultivos de células pueden presentar inhibidores de la PCR , ((13, 33), como por ejemplo la melanina presente en las células de melanoma,(34). La presencia de fenol o formaldehído en algunas vacunas pudiera ser la causa de inhibición de la amplificación del ADN, (35). También muchas drogas para humanos contienen heparina, la cual es un conocido inhibidor que permanece en el ADN extraído, (36-38). En suero ,D.S. Konet y cols, 2000, reportaron la presencia de posibles inhibidores de la RT-PCR , (39).

Los inhibidores de la PCR no solo pueden encontrarse en las muestras originales, sino que pueden ser añadidos a la mezcla de reacción durante el procesamiento de la muestra previo a la amplificación del ADN, (31, 40-41).Entre estos inhibidores se incluyen los reactivos usados durante el paso de extracción y purificación del ADN, ejemplos conocidos son el etanol, fenol,isopropanol, detergentes iónicos como el desoxicolato de sodio, sarcosil y dodecilsulfato de sodio (SDS), algunas sales cuando se encuentran en exceso en la mezcla de reacción pueden tener acción inhibitoria sobre la amplificación de los ácidos nucléicos , como el KCl, NaCl, entre otras, (40-41). Las sustancias que se liberan del poliestireno después de la exposición de las pipetas a la luz ultravioleta durante su descontaminación también pueden inhibir la amplificación del ADN, (42).

Aunque no se conocen bien los mecanismos específicos de acción de los inhibidores, si se sabe que de manera general estos pueden actuar mediante inactivación de la ADN polimerasa termoestable, degradación o captura de los ácidos nucléicos o interferencia con el paso de lisis celular durante el proceso de extracción del ADN (31).

La unión directa de algunos agentes al ADN de simple y doble cadena permite la purificación simultánea del inhibidor con el ADN interfiriendo con la amplificación posterior del mismo,(41). La ADN polimerasa termoestable es también una de las dianas de acción de los inhibidores, probablemente sea este reactivo de la mezcla de PCR el sitio de acción más importante de las sustancias inhibitorias,(31).

Los inhibidores pueden bloquear la actividad enzimática de las ADN polimerasas afectando la disponibilidad de cofactores requeridos por esta para su actividad. Por ejemplo, cualquier sustancia que reduzca la disponibilidad de Mg 2+ o interfiera con su unión a la ADN polimerasa, puede inhibir el PCR, (41). Las ADN polimerasas presentan diferencias en cuanto al grado de sensibilidad o resistencia que manifiestan frente a la acción de los inhibidores de la PCR. Se ha demostrado que la Taq DNA polymerasa es más sensible a la acción de los inhibidores que otras polimerasas termoestables como la Tth, de Thermus thermophilus y la Tfl de Thermus flavus. Esto corrobora la afirmación de que el grado de inhibición del PCR depende del tipo de polimerasa termoestable usada en la reacción, (43).

Controles internos de amplificación

Una forma de identificar la presencia de inhibidores causantes de resultados falsos negativos en los ensayos de PCR es incorporar en la reacción un control interno de amplificación (CIA), (44). Este no es más que un fragmento de ADN no diana que se amplifica simultáneamente con la diana en el mismo tubo de reacción(32). La señal de amplificación del CI debe ser visible independientemente de la presencia del ADN diana, no obstante, en ocasiones, cuando hay amplificación de la diana, la señal del CI puede estar ausente, esto sucede sobre todo cuando el ADN diana se encuentra en elevada concentración. La ausencia del amplicón del CI y de la diana simultáneamente indica que la muestra contiene inhibidores que impiden la amplificación o fue contaminada con estos durante la extracción del ADN, en este caso, el resultado no es válido y la muestra debe re-analizarse, (33).

Los primeros ensayos de PCR desarrollados para la detección de micoplasmas contaminantes no incluían controles internos de amplificación (18). En un ensayo de PCR sin CIA la ausencia de señal positiva pudiera indicar que no hay ADN diana presente en la muestra. Sin embargo, también pudiera ser indicativo de mal funcionamiento del termociclador, de los reactivos de la mezcla o de la presencia de inhibidores en la muestra que impiden la amplificación de los ácidos nucléicos,(32, 45).

Actualmente los métodos de diagnóstico por PCR desarrollados para la detección de micoplasmas contaminantes cuentan con controles internos de amplificación, (10, 19), aunque se ha planteado que la necesidad o no de incluir estos controles en los ensayos debe ser determinado de manera puntual debido a la dificultad de su implementación y a la posibilidad de que afecte la sensibilidad del ensayo. Se plantea que si el porciento de error durante la evaluación del PCR es menor o igual al 2% no es necesario incorporar de manera rutinaria un CIA en la reacción a menos que las consecuencias médicas de un resultado falso negativo sean severas, (46).

Tipos de CIA

Un CIA puede ser un fragmento de ADN o ARN foráneo que se adiciona en el tubo de reacción o un ADN endógeno que se encuentra de manera habitual en el material que se analiza y que por tanto siempre debe amplificarse ,(44). El gen de la glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) presente en las células de ovario de hámster ha sido usado como CIA endógeno para la identificación de resultados falsos negativos durante la detección de micoplasmas contaminantes en cultivos celulares de ovario de hámster Chino usados en el desarrollo de proteínas recombinantes terapéuticas, (47).

El uso de secuencias endógenas como IAC, a diferencia de los controles exógenos, permite monitorear todos los pasos del ensayo desde la extracción del ADN hasta la amplificación, puesto que el ADN endógeno usado como IAC se purificará simultáneamente con la diana. Además, permite monitorear la integridad del ácido nucléico diana, pues en materiales colectados, almacenados o procesados incorrectamente tanto el ADN diana como el control pueden estar ausentes o degradados, dando como resultado una señal de amplificación negativa,(48).

Secuencias de ARN han sido utilizadas también como CI, específicamente en los ensayos de RT-PCR empleados para la detección de micoplasmas contaminantes. DB Brown y cols., 2009, emplearon el ARN genómico total de la línea celular humana HEK 293 como CI exógeno para verificar la ausencia de inhibidores de la amplificación y monitorear los pasos de extracción, retrotranscripción y amplificación durante la validación de un ensayo de RT-PCR para la detección de Mollicutes contaminantes incluídos en los géneros Acholeplasma y Mycoplasma, (10).Cuando se usa este tipo de controles es importante tener en cuenta la acción de RNAsas presentes naturalmente en muestras clínicas. Los controles internos de ARN se pueden introducir en fagos, como el MS2, para protegerlos contra la degradación por parte de estas RNAsas, (46).

Sistemas de amplificación de los controles internos

El CI puede ser amplificado con cebadores diferentes o usando los mismos cebadores del ADN diana. En este sentido se definen dos sistemas de amplificación: un sistema no competitivo en el cual se usan cebadores diferentes y un sistema competitivo cuando se usan los mismos cebadores.Esto último supone una competencia entre el CI y la diana por los cebadores, provocando una disminución en el límite de detección del ensayo y por tanto en la eficiencia de amplificación. A pesar de esto, se ha recomendado el desarrollo de sistemas de amplificación competitivos a fin de evitar interacciones indeseables cuando se emplean múltiples cebadores y de esta forma garantizar iguales condiciones de reacción para ambos fragmentos de ADN, (32).

Diseño y construcción de los CIA

Un aspecto importante a tener en cuenta cuando se realiza el diseño de los controles internos es que el producto de su amplificación debe ser fácilmente diferenciable del amplicón del ADN diana, ya sea por la talla en un gel de electroforesis o por diferencias en la secuencia de nucleótidos usando una sonda de hibridación específica,(32) .

El diseño y construcción de CIA para sistemas competitivos se puede llevar a cabo mediante deleción, inserción o modificación de las secuencias entre los sitios de reconocimiento de los cebadores. Para esto se diseñan usualmente estrategias de clonaje que pueden ser largas y laboriosas debido a los sucesivos pasos de digestión, ligazón, clonaje y purificación,(32). El CIA usado por Uphoff y Drexler, 2002 en un análisis comparativo de PCR para la detección de infecciones por micoplasmas en líneas celulares continuas, (Stratagene, Amsterdam, The Netherlands), se obtuvo mediante el clonaje del producto de PCR de Acholeplasma laidlawii en un vector (pGEM-T vector), al cual posteriormente se le insertó un fragmento de 476 pb. Este es un sistema competitivo cuando Acholeplasma laidlawii es el contaminante y no competitivo cuando los contaminantes son otros micoplasmas,(9, 49).

En un sistema de amplificación competitivo uno de los parámetros críticos a considerar es la concentración del CI autilizar. El cálculo del número correcto de copias de CI usado en el PCR es muy importante pues demasiada cantidad de CI puede competir con el ADN diana e interferir con su amplificación ocasionando por tanto, un resultado falso negativo, sobre todo si el ADN diana está presente en baja concentración. Es por esto que los CI se usan en concentraciones muy cercanas al límite de detección del ensayo,(32). Rosenstraus y cols., 1998, desarrollaron un método para calcular el número de moléculas en un stock de CI basado en que a una concentración de 20 a 40 copias del mismo por reacción, las moléculas se distribuyen según la ley de Poisson. La concentración del stock de CIA se calcula realizando diluciones seriadas del CIA y llevando a cabo múltiples amplificaciones. Mediante la fórmula C=-ln(Pn) , donde P es el número de réplicas de amplificación negativas obtenidas a una dilución particular del stock, se obtiene el número de unidades generadoras de señal, C, la cual se define como la menor unidad en un volumen de solución dado que generará una señal positiva de PCR, (48) . Este método puede resultar largo y laborioso, (32), sin embargo, tiene la ventaja de ser independiente de cualquier medida espectrofotométrica o fluorométrica, las cuales se ven afectadas por la interferencia de los reactivos residuales de la purificación de los plásmidos de CI o productos de PCR del mismo.

Otro parámetro crítico a tener en cuenta en este sistema es la talla del CI, ya que fragmentos de ADN con menor talla se amplifican de manera preferencial con respecto a fragmentos de mayor talla. Por esto,es preferible la utilización de CI de mayor talla que el ADN diana a fin de garantizar que la competencia no limite la amplificación de la diana, (32). El sistema de PCR MycoSensor utilizado para la detección rápida de micoplasmas contaminantes incluye un CI de 500-bp fácilmente diferenciable del amplicón de 315 pb del ADN diana. Otro ejemplo es el CI de 502 pb del ensayo MycoScanTM, donde los cebadores de la diana amplifican un fragmento de 154-237 bp según la especie de micoplasma contaminante presente en la muestra. También se han desarrollado CI de tallas menores que la de la diana, a pesar de las desventajas que estos presenteas. El sistema de PCR VenorGeM® excluye la posibilidad de resultados falsos negativos empleando como CIA un fragmento de ADN de 191 pb insertado en un plásmido de E.coli , mientras que los cebadores de la diana amplifican un fragmento de 270 pb del ARNr 16S del genoma de los micoplasmas. El CI usado en el ensayo de SouthernBiotech para la detección de micoplasmas tiene una talla de 270 pb y se diferencia fácilmente en un gel de electroforesis del amplicón de 448-611 pb que se obtiene con los cebadores específicos de la diana en dependencia de la especie de micoplasma presente.

Conservación de los CIA

Los IAC se conservan muy bien insertados en un plásmido, en una célula transformada, mantenida en glicerina, liofilizada o congelada.También es posible conservarlos como ADN libre en un buffer alcalino (TE 0.1 M, PH 8), el cual lo estabiliza, o liofilizados, donde la degradación o pérdida del material genético es mínima.Es importante tener en cuenta que el ADN puede unirse a la supeficie de los tubos de polipropileno, lo cual induce cambios conformacionales en el mismo, influyendo en su eficiencia de amplificación.Se ha planteado que los tubos de polialómero son más adecuados para la conservación ya que no muestran adsorción o degradación del ADN, (32).

Conclusiones

La presencia de inhibidores de la amplificación del ADN en el suero empleado para el cultivo de células y en algunos productos biofarmacéuticos como vacunas o la introducción de estos durante el manejo de la muestra, pudiera ser la causa de resultados falsos negativos durante el diagnóstico por PCR de micoplasmas contaminantes.

El uso de CIA basado en estrategias de amplificación competitivas constituye una alternativa recomendable para la detección de muestras inhibitorias y la disminución por tanto, de los resultados falsos negativos.

La talla y la concentración de los controles internos usados en el PCR son parámetros críticos a tener en cuenta y es necesario llevar a cabo una adecuada evaluación y optimización del sistema a fin de garantizar que la inclusión de los mismos no compita con el ADN diana en la reacción y que por tanto no disminuya la sensibilidad analítica del ensayo.

La utilización de controles internos de PCR aumenta la confiabilidad de los resultados y la calidad de los servicios prestados por los laboratorios que realizan el diagnóstico de micoplasmas contaminantes en líneas celulares y productos biofarmacéuticos.

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Autor:

Yaima Burgher P

Evelyn Lobo R., Belkis Corona

Laboratorio para el diagnóstico de micoplasmas, MYCOLAB. Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, CENSA.