Enfermedad perinatal y viabilidad celular renal postmortem in vitro en el Hospital Universitario del Valle, Cali (página 2)

MATERIALES Y METODOS

Datos clínicos. Se recolectaron los datos de antecedentes maternos de enfermedad perinatal de todas las admisiones de neonatos ²3 días de edad referidos por la sala de partos del HUV y otros centros periféricos de atención médica, a la sala de Cuidado Intensivo del Recién Nacido (CIRENA), y de los mortinatos del HUV en Cali, Colombia, por un período de 27 meses, entre octubre 1 de 1992 y diciembre 31 de 1994.

Los estudios postmortem se efectuaron en los neonatos fallecidos dentro del HUV ²3 días de edad y en los mortinatos, previa autorización informada. No se consideraron para necropsia los casos de neonatos fallecidos ³4 días de edad, para evitar un mayor riesgo de infección nosocomial (observaciones personales). Tampoco se examinaron los casos no autorizados, o que pudieran presentar algún deterioro macroscópico o con >3 horas postmortem.

Obtención de tejido renal. El tejido renal se obtuvo del neonato dentro de las primeras 3 horas post-mortem mediante técnica aséptica. En breve, se aplicó con guantes y gasa estéril una solución al 10% de yodo (Wescodyne®) sobre el dorso del cuerpo. Con instrumentos igualmente estériles, se hizo una incisión paralumbar bilateral y se disecó el tejido hasta obtener tejido renal. Este se colocó inmediatamente en un recipiente estéril con medio de transporte (medio mínimo esencial de Eagle en sales de Hank) adicionado de peptona y antibióticos, refrigerado a 4º C y mantenido así hasta su proceso en el laboratorio.

Obtención de células renales. El tejido renal se transportó a 4º C en el medio antes descrito y se procesó en el laboratorio de In Vitro del Departamento de Microbiología de la Universidad del Valle, en Cali, Colombia, dentro de las primeras 24 horas de su recolección. El tejido se cortó en fragmentos pequeños en condiciones de esterilidad, con el empleo de una cabina de flujo laminar de bioseguridad y técnicas asépticas. La extracción de las células se efectuó por digestión enzimática de acuerdo con técnicas convencionales modificadas por Freshney mediante el uso de colagenasa tipo IV. Las células se suspendieron después en medio mínimo esencial de Eagle en sales de Hank. La viabilidad de las células se determinó por el método de exclusión de azul tripán. Este es un colorante vital al que es impermeable la membrana celular de las células vivas, pero no lo es la de las células muertas, que sí se tiñen por el colorante10,25. Para la coloración se mezclaron 0.1 ml de suspensión de células y 0.9 ml de solución de azul tripán al 0.4%.

El recuento de las células viables se hizo al microscopio (10X) en un hemacitómetro (cámara de Neubauer). Se definió "caso con células viables" aquel donde la viabilidad celular o número de células identificadas al microscopio en términos de exclusión de azul tripán fue ³50%.

Estudios microbiológicos. Se realizaron estudios microbiológicos postmortem en los casos recolectados en 1994, con hemocultivo por punción intracardíaca, cultivo de fluido intratisular y cultivo de la suspensión misma de las células renales. En los casos con células no viables se omitió el cultivo de fluido intratisular y las células renales se inocularon en cultivos de fibroblastos de pulmón humano para investigar la presencia de citomegalovirus (CMV).

Cada una de las muestras se inoculó en 3 medios de cultivo diferentes: tioglicolato de sodio, tripticasa soya e infusión cerebro corazón (BHI). Se incubaron por 15 días a 37º C. Luego se hicieron repiques de estos medios en agar sangre de cordero y en agar chocolate con isovitalex. Se consideraron negativas las muestras que a las 48 horas de incubación en recultivo no mostraban crecimiento bacteriano.

Se definió como caso con sepsis aquel con cultivos para ³1 bacteria (s) significativamente patógena (s) en >1 de las muestras.

Análisis estadístico. Para realizar el análisis estadístico se definió proporción de viabilidad como el cociente de dividir el número de casos viables entre el total de necropsias realizadas. Como medida de fuerza de asociación se utilizó la razón de proporciones (RP) con intervalos de confianza (IC) de 95%, descrito en el paquete estadístico EPI INFO versión 6.0 (Statcal). Como prueba de significancia estadística se aplicó el Chi2 de Manthel-Haenszel.

RESULTADOS

Entre octubre 1 de 1992 y diciembre 31 de 1994, la sala de CIRENA del HUV, registró 3,628 admisiones de neonatos (²28 días de edad). Esto equivale a un promedio de 134 admisiones por mes o 4.5 por día. De estos, 2,578 (71%) fueron de sala de partos intrahospitalaria y 897 (25%) fueron referidos de otros centros periféricos. No se logró establecer la procedencia de 153 (4%) admisiones. Casi todas las admisiones (68%) fueron de neonatos ²3 días de edad.

En total se registraron 787 muertes neonatales para una tasa de mortalidad hospitalaria de 22%, con un mayor riesgo para el grupo de 0-3 días de edad con 587 (16%) muertes y el menor riesgo para el grupo de 4-7 días de edad con 58 (2%) muertes. Si la edad del neonato era igual o mayor a 8 días, su riesgo de muerte intrahospitalaria era de 4% (Cuadro 1); 73 neonatos de este último grupo murieron el mismo mes de admisión y los 69 restantes murieron el mes calendario siguiente o siguientes, con una estancia promedio de 17 días. Se observó entonces, una tasa total de sobrevivencia del neonato a la hospitalización en CIRENA cercana a 80%.

Se lograron analizar los antecedentes maternos de enfermedad perinatal en 1,214 neonatos (49%) del total de 2,469 registrados con ²3 días de edad. No hubo información sobre los antecedentes maternos en los restantes 1,255 neonatos.

De ellos, 889 (73%) o casi 3 de cada 4 fueron neonatos con ² 2,500 g de peso al nacer o bajo peso al nacer (BPN). El antecedente de enfermedad perinatal más frecuente en ambos grupos fue eclampsia con un total de 407 (33%) casos, seguido por ruptura prematura de membranas con un total de 373 (31%) casos. Estas dos complicaciones comprometen por tanto a casi 2 de cada 3 neonatos ²3 días de edad (Cuadro 2).

De las 587 muertes informadas en el grupo de neonatos ²3 días de edad, se realizaron 357 (61%) necropsias. Hubo un total de 39 necropsias en mortinatos, sumando 396 casos examinados postmortem. De éstos 321 (81%) tenían BPN. Un total de 96 (24%) casos tenían antecedente materno de eclampsia y 55 (14%) de ruptura prematura de membranas. No hubo información sobre antecedentes maternos de enfermedad perinatal en 155 (39%) de los casos examinados postmortem (Cuadro 3).

En general hubo un orden de frecuencia similar en la distribución de los antecedentes de enfermedad perinatal y peso al nacer entre los casos examinados postmortem y el total de los 1,214 neonatos en el Cuadro 2, lo que sugiere una muestra adecuada para los casos en estudio.

En este trabajo, en total se obtuvieron 239 casos con células renales viables postmortem de 396 necropsias realizadas, de donde resulta una viabilidad celular renal postmortem (VCRP) global de 60%. Al analizar los datos de VCRP de acuerdo con peso al nacer, se obtuvieron 59% más de VCRP en los casos con BPN (65%) que en los de mayor peso (41%), es decir, una razón de 1.6 (IC 95% = 1.2-2.08). Esta diferencia fue estadísticamente significante (p = 0.00018).

Cuando se analizaron los datos de VCRP de acuerdo con el peso al nacer y los antecedentes maternos de enfermedad perinatal se obtuvo una VCRP de 64% en los casos de BPN con antecedente perinatal de eclampsia. Este valor fue 2.5 (IC 95% = 1.2-5.9) veces mayor que la VCRP de los casos de mayor peso con igual antecedente (26%). Esta diferencia fue estadísticamente significante (p = 0.0013). Al analizar los datos de VCRP de acuerdo con los distintos antecedentes maternos de enfermedad perinatal, se observó la más alta VCRP en corioamnionitis, (67%); luego infección urinaria, (64%); ruptura prematura de membranas, (62%); eclampsia, (55%); hipertensión arterial, (53%); diabetes, (50%); prolapso de cordón, (44%); abruptio placentae, (35%); y rubéola, (0%). Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significantes (Cuadro 3).

Más de 70% de los casos post-mortem examinados, tenían registro de diagnóstico de muerte "prematurez, enfermedad de membrana hialina (EMH), síndrome de dificultad respiratoria (SDR), anoxia y/o asfixia perinatal" y uno de cada 5 casos tenía registro de "hemorragia cerebral, hemorragia pulmonar, sepsis, y/o broncopneumonía." De cada 10 necropsias realizadas, una fue en mortinatos.

Se obtuvo una VCRP 6.7 (IC 95% = 2.3-19.6) veces mayor en mortinatos ²2,500 g (88%) que en mortinatos de mayor peso (13%). Esta diferencia fue estadísticamente significante (p = 0.0000053). No se encontró diferencia significante entre los otros grupos analizados (Cuadro 4).

En 1994, se recolectaron 145 casos postmortem para estudios microbiológicos de los cuales 79 (54%) tenían células renales viables y 66 (46%) eran no viables (Cuadro 5). De estos, 133 (92%) fueron estériles y en sólo 12 (8%) casos crecieron bacterias patógenas en cultivo, que se clasificaron como sépticos. De los 12 casos sépticos, 10 (83%) fueron casos no viables (p = 0.0062).

En orden de frecuencia, las bacterias aisladas de los casos sépticos no viables fueron Escherichia coli, 3; Pseudomona aeruginosa, 3; Klebsiella pneumoniae, 2; y Staphylococcus aureus, 2. En los dos casos sépticos con células viables, las bacterias aisladas fueron S. aureus y P. aeruginosa. El contaminante superficial más frecuente de los casos "estériles" con células renales viables fue S. epidermidis. En sólo 1 caso (2%) de los 66 no viables se demostró la presencia de CMV.

DISCUSION

El servicio de CIRENA del HUV, es el nivel público más alto (Nivel III) de atención médica neonatal en la zona. Es pues un centro de referencia que cubre los casos críticos de múltiples centros médicos periféricos y de la sala de partos intrahospitalaria, siendo esta última responsable por más de 70% de los ingresos.

Para el período del estudio la tasa de mortalidad hospitalaria en este servicio es de 22% ó 1 de cada 5 admisiones (1:4), con el mayor riesgo de muerte (16%) en los primeros 3 días de edad, cuando ingresa una gran proporción (68%) de neonatos. Son pues, los primeros 3 días de edad del neonato los más críticos en la sala de cuidado intensivo. El período de hospitalización en cuidado intensivo menos crítico para el neonato es el de 4 a 7 días de edad, cuando mueren menos de 2%. Si el neonato tiene 8 ó más días de edad durante la hospitalización en CIRENA, su riesgo de muerte aumenta de nuevo, lo que indica muy probablemente un problema médico más complejo que requiere mayor tiempo de atención y cuidado.

La mayoría (casi 3 de cada 4) de las admisiones a CIRENA, son neonatos de BPN al nacer, y casi 2 de cada 3, tienen antecedente perinatal de eclampsia o ruptura prematura de membranas.

Los casos postmortem examinados tienen una distribución de antecedente materno de enfermedad perinatal similar a la población del total de neonatos admitidos lo que demuestra la gran importancia de tales antecedentes al ingreso. Los diagnósticos de muerte que se informan con más frecuencia (71%) son "prematurez, EMH, SDR y anoxia y/o asfixia perinatal."

Es pues, necesario continuar con las investigaciones médicas multidisciplinarias con el fin de reducir la tasa de mortalidad hospitalaria y mejorar la salud del recién nacido y su madre. El examen postmortem es una herramienta invaluable que intenta descubrir la causa de muerte, entender la historia natural de la enfermedad y elucidar mecanismos de función a nivel celular que permitan comprender mejor al hombre y su entorno.

El tejido renal postmortem de neonatos es un excelente ejemplo de un recurso adecuado para la obtención de cultivos celulares primarios en la investigación biomédica. En los laboratorios del Programa In Vitro del Departamento de Microbiología de la Universidad del Valle, se demuestra que a partir de casos de neonatos postmortem y mortinatos en el HUV se puede lograr una VCRP de 60%. La viabilidad más baja en humanos se debe quizá al antecedente de enfermedad que produjo la muerte, en combinación con mayor tiempo entre muerte y obtención del tejido.

Las observaciones en esta experiencia sugieren que la VCRP disminuye 10% por hora postmortem hasta el momento de conseguir el tejido. Una vez que se obtiene el tejido en condiciones adecuadas de medio y transporte, la VCRP se estabiliza hasta por 24 horas. La viabilidad celular aumenta significativamente en mortinatos ²2,500 g de peso (88%) y neonatos fallecidos con ²3 días de edad y BPN (65%). Esta mayor viabilidad en el tejido renal se puede relacionar con el grado de prematurez en muchos casos y por ello con el grado de indiferenciación celular del tejido embrionario que se refleja en mayor actividad de la multiplicación celular. Como este estudio no determinó la edad gestacional con respecto a peso al nacer, no es posible confirmar esta presunción.

La VCRP disminuye de modo significativo en neonatos fallecidos ²3 días de edad y de >2,500 g de peso con antecedente materno de eclampsia (26%). Este hallazgo y las posibles implicaciones en la función renal del neonato ameritan estudios más amplios. Por ahora, este dato apoya aún más la conducta establecida de adelantar el parto en la eclampsia para controlar este estado en la madre, pues también podría favorecer al neonato y prevenir un posible deterioro de su función renal, si la disminución de tal viabilidad in vitro es un reflejo del daño celular in vivo.

Se observa también una disminución en la viabilidad celular en casos sépticos (p = 0.0062). Sin embargo, las células renales viables sépticas se pueden tratar in vitro con antibióticos de amplio espectro (penicilina, gentamicina, estreptomicina, anfotericina) de donde resultan cultivos celulares de la misma calidad y esterilidad que los no sépticos. Esto establece que la infección celular puede ser erradicable con el tratamiento in vitro apropiado. Ahí se ofrece una situación práctica favorable en la tecnología de cultivos celulares primarios de origen humano. Los estudios en este campo deben continuar para buscar mecanismos que mejoren la eficiencia de los cultivos de células renales in vitro.

AGRADECIMIENTOS

Por su interés y decisiva colaboración a los doctores Carlos Starck y Héctor Fabio Montes, jefes de la sala de recién nacidos; al Departamento de Ginecología y Obstetricia, Hospital Universitario del Valle; a la Fundación CIRENA y a todo el personal médico, de enfermería, trabajo social y administrativo de la sala por su valiosa ayuda en el desarrollo del estudio.

REFERENCIAS

2. Harrison RG. Observations on the living developing nerve fiber. Proc Soc Exp Biol Med 1907; 4: 140-43.
3. Carrel A. On The permanent life of tissue outside the organism. J Exp Med 1912; 15: 516-28.
4. Enders JF, Weller TH, Robbins FC. Cultivation of the Lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science 1949; 109: 85-7.
5. Sabin AB. Present position of immunization against poliomyelitis with live virus vaccines. Br Med J 1959; 1: 663-80.
6. Enders JF. Peebles TC. Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles. Proc Soc Exp Biol Med 1954; 86: 277-86.
7. Hsu TC. Cells in culture in biology, medicine and public health. In the future of animals, cells, models, and systems in research, development, education, and testing. Proceedings of a Symposium Institute of Laboratory Animal Resources Division of Biological Sciences Assembly of Life Sciences. Washington; National Academy of Sciences, 1977, pp. 180-84.
8. Freshney RI. In Culture of animal cells. New York; Alan R. Liss, 1987, pp. 1-6.
9. Harris H, Watkins JF. Hybrid cells from mouse and man: Artificial heterokaryons of mammalian cells from different species. Nature 1965; 205: 640-46.
10. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495-97.
11. Schmidt NJ. Cell culture techniques for diagnostic virology. In Lennette EH, Schmidt NJ (ed.) Diagnostic procedures for viral, rickettsial and chlamydial infections. Washington; American Public Health Association, 1979, pp. 65-139.
12. Horstmann DM. The Picornavirus group. In Viral and rickettsial infections of man. Horsfall FL, Tamm I. 4th. ed. Philadelphia; JB Lippincott Co., 1965, pp. 425-29.
13. Melnick JL. Echovirus. In Horsfall FL, Tamm I. Viral and rickettsial infections of man. 4th. ed. Philadelphia; JB Lippincott Co., 1965, pp. 513-45.
14. Stulberg CS, Page RH, Berman L. Comparative behavior of 16 Echovirus types in fibroblast-like and ephitelial-like human cell strains. Proc Soc Exp Biol Med 1958; 97: 355-59.
15. Chang C, Lepine P, Lelong M, et al. Severe and fatal pneumonia in infants and young children associated with adenovirus infections. Am J Hyg 1958; 67: 367-78.
16. Ginsberg HS, Dingle JH. The Adenovirus group. In Horsfall FL, Tamm I. Viral and rickettsial infections of man. 4th. ed. Philadelphia; JB Lippincott Co., 1965, pp. 860-91.
17. Ramos-Alvarez M, Mayes O, Bustamante L, Martin S. Cultivation of post mortem human kidney tissue and its suceptibility to enteroviruses. Bol Med Hosp Infant Mex (Engl ed.) 1960; 1: 165-69.
18. Kasel JA. Adenovirus. In Lennette EH, Scmidt NJ. Diagnostic procedures for viral rickettsial and chlamydial infections. 5th. ed. Washington, American Public Health Association, 1979, pp. 229-55.
19. Newell K, Dover AS, Clemmer D, et al. Las enfermedades diarreicas de la infancia en Cali, Colombia. Diseño e informe resumido de un estudio sobre los agentes patógenos aislados. Bol Ofic Sanit Pan 1976; 81: 28-43.
20. Berman S, Dueñas A, Bedoya A, et al. Acute lower respiratory tract illnesses in Cali, Colombia: a two year ambulatory study. Pediatric 1983; 71: 210-18.
21. Dueñas A. Opportunities for studies on acute respiratory infections in children of Colombia. Workshop on Acute Respiratory Infections among Children of the World. Proceeding of a Conference. May 18-19, 1983 at the University of North Carolina, School of Medicine, Chapel Hill, North Carolina, Wallace A, Clyde Jr. Etc. Floyd W Dennt, Guest editors.
22. Dueñas A, Escobar JA, Medina P, Belsey MA. Estudios de virus en síndromes infecciosos agudos del sistema nervioso. Acta Med Valle 1976; 7: 7-12.
23. Dueñas A, Adams E, Melnick JL, Rawls E. Herpesvirus Type 2 in a prostitute population. Am J Epidemiol 1972; 95: 483-89.
24. Trentin JJ, Yabe Y, Taylor G. The quest for human cancer viruses. Science 1962; 137: 835-41.
25. Viability of monkey kidney cells. BioWhittaker, Maryland; Inc. Walkersville, 1997.
26. Freshney RI. Tumor cells disaggregated in collagenase. Lancet 1972; 2: 488-89.

Alvaro Dueñas L., M.D.1, William David Criollo, Bact.2, Ana Julia Miranda de Bernal, Trab. Soc.3, José Ever Piamba, Tec. Lab.41. Profesor Titular (R), Departamento de Microbiología, Escuela de Ciencias Básicas Médicas, Facultad de Salud, Universidad del Valle. Director Programa IN VITRO, Cali, Colombia. 2. Bacteriólogo, Programa IN VITRO, Departamento de Microbiología, Escuela de Ciencias Básicas Médicas, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. 3. Trabajadora Social, Coordinadora Programa IN VITRO, Departamento de Microbiología, Escuela de Ciencias Básicas Médicas, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia. 4. Técnico de Laboratorio, Programa IN VITRO, Departamento de Microbiología, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali, Colombia.