Aspectos microbiológicos de las producciones cerveceras (página 2)

    Microorganismos: se prefiere los que no sean exigentes en  sus requerimientos nutricionales. Deben poseer una elevada velocidad de crecimiento y estabilidad genética en el medio y condiciones establecidos. Deben biosintetizar (per se, o tras manipulación genética) el producto deseado en concentraciones adecuadas y, preferiblemente, excretarlo al medio. La generalidad de los autores plantean que no deben ser patógenos aunque, dada la naturaleza del producto de elección, no se excluye esta posibilidad.

    Producto: se debe obtener en concentraciones adecuadas y su recuperación, de acuerdo al nivel de pureza requerido, ha de estar económicamente justificado.

2-Elementos imprescindibles (no declarados): todo proceso de fermentación, implica crecimiento microbiano y biosíntesis celular. Para que estos eventos tengan lugar se requiere de energía y de carbono como mínimo. Ambos elementos pueden estar comprendidos en el medio de cultivo que incluya el sustrato a transformar en producto; pero no necesariamente. Para resolver esta situación es necesario retomar algunos aspectos que, por lo general,  se abordan al estudiar lo concerniente a metabolismo y fisiología microbiana.

Como se trata de algo harto conocido, nos limitaremos a recordar que los microorganismos, acorde a la fuente que les aporta energía, pueden ser: fotótrofos o quimiótrofos, según  esa energía provenga de una reacción fotoquímica o de oxidaciones biológicas; mientras que la fuente de carbono necesaria para su supervivencia los  divide en: autótrofos y heterótrofos, según se trate de carbono inorgánico u orgánico, respectivamente. Si se asumen, de conjunto, los elementos fuente de energía y de carbono, obtendremos cuatro posibles categorías de microorganismos: fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos y quimioheterótrofos.

Solo para los comprendidos en el cuarto grupo   la propia fuente carbonada al oxidarse constituye la fuente de energía necesaria para los procesos biosintéticos celulares. En las restantes categorías existe divorcio entre ambas fuentes, aspecto a tener en cuenta al diseñar el sistema pues, si no se garantizan, no habrá fermentación, biotecnológicamente hablando.

Además, tanto para el caso de los que obtienen su energía por reacciones fotoquímicas, como los que lo hacen mediante oxidaciones biológicas, es necesario la existencia de sustancias que intervengan como donadores y aceptores de electrones. Estos elementos hay que incorporarlos al medio de cultivo, o crear las condiciones para que estén presentes en el sistema, como es el caso de la aireación para garantizar la participación del oxígeno como aceptor de electrones en las fermentaciones en que participan microorganismos respiratorios aeróbicos. En las fermentaciones anaeróbicas es preciso incorporar al medio de cultivo (fuente de sustrato) los compuestos oxigenados inorgánicos que actúan como aceptores de electrones (en bacterias anaerobias estrictas o facultativas).

    Clasificación de los microorganismos en relación con sus fuentes de energía y carbono.

Principales donadores y aceptores de electrones asociados a los microorganismos según su fuente de carbono y energía.

    En sentido general, los procesos fermentativos desarrollados a escala industrial utilizan microorganismos quimioheterótrofos, fundamentalmente bacterias y hongos (entiéndase mohos y levaduras). Sin embargo existen ejemplos de verdaderos procesos de fermentación en los que, partiendo de residuos industriales, se utilizan microorganismos fotoautótrofos para su tratamiento y producción de biomasa. Un ejemplo al respecto lo constituye el tratamiento de residuales, ricos en nitratos, con microorganismos fotoheterótrofos (microalgas o bacterias) en estanques acondicionados a tal fin. De esta forma, además de resolverse los problemas que engendrarían el vertimiento de estos residuales al entorno, a la par que se elimina la carga de nitratos,  la  biomasa microbiana producida puede ser utilizada como suplemento nutricional animal.

Este tipo de sistema se caracteriza por lo económico del producto obtenido. La energía la aporta la luz solar, los demás elementos imprescindibles los aporta el residual y/o están presentes en el microorganismo. A pesar de ello, como ya se planteó, lo más común en los sistemas fermentativos actuales es el uso de microorganismos quimioheterótrofos; las producciones cerveceras son un ejemplo típico.

3-Elementos acondicionadores: estos elementos, al igual que los anteriores, no aparecen implícitos en la  definición de fermentación. Una posible diferencia con los mismos es que no se puede plantear que sean imprescindibles. Sin embargo, poseen una influencia indiscutible en el desarrollo de la fermentación. Dentro de esta categoría se incluye un grupo de elementos entre los que destacan: temperatura, pH, viscosidad, presión osmótica, humedad, por sólo enumerar algunos ejemplos.

    El crecimiento microbiano es un componente esencial en todo proceso de fermentación. La influencia particular de estos factores en el crecimiento es más que evidente en  los cultivos no renovados o batch, donde la relativa brevedad de la fase exponencial de crecimiento los tiene entre sus causas. En la medida que nos aproximamos a los valores óptimos para cada elemento, y según el tipo de microorganismo, más rápidamente se alcanzará la fase de crecimiento exponencial y mayor será la biomasa obtenida, cantidad de producto, etc. En tanto que mientras que  nos alejamos de los valores óptimos sucede lo contrario, e incluso puede inhibirse totalmente el crecimiento.

     Una variante que permite un mayor control de estos elementos, por parte del investigador, es el cultivo continuo, donde el suministro sucesivo de medio fresco, además de garantizar nutrientes a las nuevas generaciones celulares, ejerce efecto dilutivo que reduce la acción adversa de los metabolitos tóxicos y permite que exista una transferencia de calor y de oxígeno más homogénea  en el sistema. Así, al igual que existen diferentes sistemas de cultivo, también en el caso de las fermentaciones pueden dividirse fermentaciones batch o fermentaciones continuas en dependencia de como se utilice el fermentador. La selección de una u otra forma está en dependencia del tipo de producto que se pretende obtener, su cantidad y concentración, su pureza y los recursos con que se cuenta, entre otros.

Tipos de fermentaciones

    Resultan muy diversos los criterios para la categorización o clasificación de las fermentaciones.

    Según el tipo respiratorio del microorganismo(o microorganismos) utilizado se dividen en fermentaciones aeróbicas o anaeróbicas. Estas últimas contemplan microorganismos que en el proceso obtienen su energía por vía fermentativa o por respiración anaerobia.

    Si se tiene en cuenta al sustrato, las fermentaciones se clasifican en:

a)     Sumergidas (o en estado liquido) cuando el sustrato tiene un alto contenido de humedad.

b)    Fermentaciones sólidas: cuando el contenido acuoso del sustrato es eliminado y el proceso se desarrolla con un  contenido de humedad comprendido entre el 30% y el 80%.

      Finalmente atendiendo a la forma en que se utiliza el fermentador o reactor las fermentaciones se clasificaran en:

a)   fermentaciones batch o discontinuas

b)   fermentaciones continuas

c)   fermentaciones semicontinuas

d)   fermentaciones fed-batch

·         Fermentaciones batch

    Los procesos batch se caracterizan por ser sistemas de cultivos cerrados que se realizan en un volumen finito invariable en el cual los sustratos se adicionan al inicio del cultivo y se consumen durante el proceso para favorecer el crecimiento microbiano como población.  El producto deseado se recupera al final de la fermentación: a partir del medio de cultivos, si se trata de un producto excretado, o del citoplasma celular, como compuestos solubles o agregados insolubles, cuando se trata de productos retenidos en el espacio periplásmico como ocurre en las fermentaciones desarrolladas con bacterias gramnegativas.  En este último caso es preciso fraccionar las células microbianas.  Las cervezas corresponden al primer ejemplo, mediante filtración se separa de las células (levaduras) y partes sólidas del medio de cultivo.

Los procesos batch atraviesan por diferentes fases de crecimiento (Fig. 1) en las que las características fisiológicas de los microorganismos involucrados también difieren. Así, al inicio de la fase estacionaria (lag-de lagtency), la población microbiana (inóculo) se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su mquinaria metabólica (metabolismo endógeno) antes de crecer activamente. En esta fase se produce un crecimiento como aumento celular pues, previo a la división, ha de duplicar todos sus componentes celulares. Su duración depende de factores como: edad de los cultivos (mientras más frescos, menor dicha fase); medio de cultivo (si donde se inocula es igual al de donde proviene, se reduce la fase); tamaño del inóculo (se debe guardar la siguiente relación 1:5, como máximo 1:10 al transferir el inóculo al medio de destino; inferiores o mayores provocan un incremento de la fase de latencia). La fase exponencial (también conocida como logarítmica, o simplemente log) es donde la velocidad de crecimiento (µ) es máxima. Como durante el crecimiento se agotan nutrientes, oxígeno (si son microorganismos aeróbicos) y se acumulan en el medio metabolitos tóxicos de desecho y el pH, por lo general baja a cifras que inhiben el crecimiento, todo ello influye en que se transite a una nueva fase. La fase estacionaria se caracteriza por no existir crecimiento como población; más bien hay un equilibrio entre los que se multiplican y los que mueren. Al ser un sistema cerrado, las condiciones empeoran y dan lugar a la fase de declive o mortalidad. Durante la misma, el número de microorganismos vivos decrece de forma exponencial.

Los procesos batch conllevan a la acción no controlada del medio externo, cambiante en cada estadío del proceso. Una vez obtenido el producto deseado, es necesario descargar el reactor o fermentador, lavarlo, esterilizarlo, cargarlo, inocularlo con el cultivo deseado y esperar para una nueva producción.

Todo ello implica un gran gasto de tiempo. No obstante, a pesar de esta limitante,  toda una gama de productos se siguen obteniendo por esta vía, incluso aquellos en los que se utilizan microorganismos recombinantes.  Es la vía más utilizada en la industria farmacéutica, ya que permiten un adecuado control de la esterilidad al ser sistemas cerrados. Esta variante se caracteriza por una baja frecuencia de aparición de mutantes y la simplicidad del proceso.

·         Fermentación continua

    En los procesos continuos se realizan con el objetivo de mantener una concentración de sustrato constante y, por consiguiente, mantener la población microbiana en fase de crecimiento exponencial. Se utiliza en fermentaciones industriales que requieren actividad metabólica máxima. Se trabajan a volumen constante ya que hay un equilibrio entre el volumen del medio añadido y el que fluye transformado por la acción microbiana. Esta peculiaridad constituye una ventaja con respecto a los procesos batch, pues a diferencia de estos, el crecimiento no va a estar limitado por factores adversos como agotamiento de nutrientes, acumulación de metabolitos tóxicos, etc., simplemente el crecimiento está en función de la concentración de sustratos limitantes (factores auxéticos), los cuales se suministran de forma continua al reactor (Fig. 2). Regulando estos, se regula el crecimiento microbiano (biomasa) y la síntesis del producto deseado, sin que el medio ambiente ejerza un efecto negativo.

Debe aclararse que, inicialmente, el reactor se carga y se inocula con el cultivo, igual que un sistema discontinuo. Mediante la medición de la densidad óptica se controla el momento en que la población pasa a fase exponencial, y es a partir de ese instante que se inicia la adición de medio fresco acorde a la  velocidad específica de crecimiento del microorganismo utilizado.

Estos procesos pueden desarrollarse como quimiostatos o como turbidostatos. En un quimiostato la velocidad de flujo de medio fresco (D) se mantiene a un valor determinado de manera que la velocidad de crecimiento se ajuste a ella (µ=D; en estos casos los microorganismos no se multiplican a su velocidad máxima). En un turbidostato, el sistema incluye un dispositivo óptico que regula la turbidez y obliga a la población a multiplicarse a su velocidad máxima (D= µ máxima).

Algunas de las ventajas de esta modalidad, con respecto a los procesos batch son: 1) operan por períodos largos (tiempos muertos bajos); 2) poseen costos de operación bajos; 3) el cultivo se mantiene con coeficiente de crecimiento constante; 4) la generación de biomasa es constante y 5) el volumen del reactor resulta reducido, en comparación a los utilizados para alcanzar una productividad similar en procesos batch.

A pesar de la productividad de estos sistemas su uso, como método de producción, ha chocado con varios obstáculos:       1) alto costo de los equipos y accesorios (biosensores y   automatización computarizada); 2) requieren de grandes reservorios para garantizar el suministro continuado de medio de cultivo; 3)  en muchos casos implica esterilización continuada, separación sucesiva del producto para alcanzar los niveles de purificación deseados; 4) se incrementa el riesgo de contaminación; 5) otro tanto sucede con la aparición de mutantes y 6) la conversión total de sustrato exige sistema multiniveles, inmovilización celular o recirculación celular, todo lo cual encarece el costo de operación.

A lo antes expuestos se puede añadir que los rangos de velocidades adecuadas para la síntesis de proteínas heterólogas (m < 0,15 h-1) obtenidas a partir de dichas cepas,  constituyen otra limitante para su aplicación. El no constituir sistemas cerrados dificulta el garantizar las condiciones óptimas de esterilidad para el producto terminado. 

En la actualidad se han planteado modificaciones para estos sistemas que contemplan la "fijación" o "retención celular"  (cultivos con células inmovilizadas) y la remoción del medio de cultivo que contenga productos inhibitorios y tóxicos. Estas  variantes, a pesar de su éxito a escala de laboratorio, ofrecen mayores dificultades para la aplicación a escala industrial.

·         Fermentaciones semicontinuas

     Constituyen variantes intermedias entre las fermentaciones anteriormente analizadas. En un primer momento el fermentador se trabaja como un proceso batch, hasta que la población microbiana cae en una fase de crecimiento retardado (final de la fase exponencial e inicio de la estacionaria). Cuando esto ocurre se extrae un volumen dado del medio transformado y se sustituye por uno equivalente de medio fresco estérill (Fig. 3). Esto último, a la par que sustituye los nutrientes ya agotados (fundamentalmente los limitantes del crecimiento, o auxéticos) ejerce un efecto dilutivo de los factores adversos presentes en la fase de crecimiento retardado como son: metabolitos tóxicos, condiciones de pH no idóneos, etc. Tras un corto lapso de tiempo la población microbiana vuelve a transitar por la fase de crecimiento exponencial.

Las operaciones de extracción de medio agotado, y adición de volúmenes  equivalentes de medio fresco, se pueden repetir tantas veces como se precise. Esta variante, más simple desde el punto de vista del equipamiento que los procesos continuos, aunque también menos productivo, resulta en cierta forma más ventajosa que los sistemas batch en cuanto al ahorro de tiempo (tiempo muerto) que permite al no ser necesarias etapas como las de descarga, lavado, esterilizado, carga e inoculación. Pese a lo antes expuesto, la información sobre su utilización industrial es muy pobre.

·         Fermentaciones fed-batch

    Constituyen otra variante entre los sistemas batch y los continuos. Sus raíces se remontan a principios del pasado siglo. Los productores de levadura en Alemania, para incrementar la producción de biomasa, incorporaban lentamente el medio utilizado a los cultivos. Esta adición en ocasiones tomaba horas y se efectuaba en condiciones de aerobiosis, se le conoce como "procesos Zulauf" y contó con una gran aceptación en la industria de la levadura cervecera por propiciar un sensible incremento de la biomasa sin acumulación de cantidades significativas de etanol. Recientemente, estos principios han sido retomados para dar lugar a lo que se conoce como "batch extendido", "batch incrementado", o procesos fed-batch. Como en los casos anteriores se parte de una variante  batch, hasta que la población microbiana entra en crecimiento exponencial. A partir de ese momento  la fermentación se prolonga mediante la adición constante, lineal o exponencial del medio fresco.

Se diferencia de los procesos continuos y semicontinuos por el hecho de que el fermentador no se carga con el volumen final de trabajo. Se parte de un volumen inicial de medio de cultivo al que se incorpora el inóculo seleccionado. En estas condiciones tiene lugar la fase de latencia y de crecimiento acelerado (fase previa a la exponencial). Al culminar esta última y pasar la población a fase exponencial, se inicia la adición de medio fresco (Fig. 4). Los sustratos en el medio de cultivo (fundamentalmente los factores de crecimiento) están en exceso (teniendo en cuenta que sus concentraciones no sean tóxicas) para garantizar: 1) la concentración del sustrato limitante; 2) la velocidad específica de crecimiento; la concentración de catabilitos. Otro tanto sucede con el oxígeno. En esta variante no se extrae ningún componente del fermentador. En estas condiciones se logra alargar la fase exponencial de crecimiento, y cultivos de alta densidad a través de tres estrategias en la adición del medio de cultivo: 1) flujo constante; 2) flujo lineal y 3) flujo exponencial. En todos los casos, si existe una buena agitación, se asume que la velocidad específica de crecimiento solo estará limitada por la concentración del sustrato limitante del crecimiento. Los resultados óptimos se obtienen cuando la velocidad de adición del sustrato limitante resulta exponencial (opción 3).  

Las técnicas fed-batch en fermentación se han utilizado para la producción de penicilina, vitaminas, aminoácidos y enzimas. Para ello, los cultivos a escala industrial han sido realizados en sistemas fed-batch en los que la adición de sustrato ha estado computarizada. La biomasa obtenida en estos procesos es superior a la obtenida por fermentaciones batch, continuas o semicontínuas. Sin embargo, entre las desventajas para la utilización de esta variante a escala industrial se encuentran el elevado costo del instrumental requerido para el control del suministro adecuado de nutrientes y la preparación del personal en general para llevarlos a feliz término a ese nivel. Por ello, pese a  los excelentes logros obtenidos con su aplicación en S. cerevisiae, su generalización industrial constituye un sueño no realizado.

Microorganismos que afectan las producciones cerveceras

    Entre los microorganismos presentes en el aire, agua y materias primas, algunos se adaptan perfectamente a las condiciones existentes en las cervecerías. Su crecimiento en la cebada y la malta, antes y durante la fermentación, libera metabolitos que afectan la estabilidad y cualidades organolépticas del producto final, algunos incluso, se desarrollan en éste.  No todos los microorganismos pueden establecerse y convertirse en contaminantes, para ello es preciso vencer toda una serie de obstáculos como:

1)     El mosto se hierve aproximadamente 2,5 horas

2)     El proceso de fermentación se realiza a baja temperatura

3)     Los valores de pH en el mosto y la cerveza son bajos

4)     El lúpulo posee componentes con acción antiséptica, fundamentalmente sobre grampositivos

5)     Durante la fermentación prevalecen condiciones de anaerobiosis

6)     Hay presencia de etanol tanto en la masa en fermentación como en la cerveza

7)     La cerveza por lo general se pasteuriza

    Diversas especies de los géneros Bacillus y Clostridium, por ser endosporógenos, soportan tiempos de ebullición entre 2-2,5 horas, sin embargo, como en su mayoría son grampositivos, resultan sensibles a los antisépticos del lúpulo. Pese a las barreras que impone el proceso de producción cervecero, diversos géneros bacterianos, algunos mohos y levaduras salvajes, son capaces de vencerlas y establecerse como contaminantes, afectando la calidad del producto final y/o constituyendo un riesgo a la salud del consumidor. A continuación se expondrán algunos géneros y especies bacterianos, frecuentes contaminantes en estos procesos, y se detallarán sus principales cualidades morfológicas, tintoriales y fisiológicas.

       Género Lactobacillus: Bastones largos grampositivos, microaerófilos, asporógenos, catalasa negativa. Crecen entre 11 y 45 oC. Son tolerantes a los antisépticos del  lúpulo. Por oxidación del etanol producen ácido láctico y ácido fórmico. Provocan agriado y turbidez sedosa de la cerveza.

    Género Achromobacter: Bastones grampositivos, anaerobios facultativos, asporógenos, catalasa positivos. Toleran los pH ácidos y los antisépticos del lúpulo. Se destruyen a temperaturas de 60 0C en 5 minutos. Además de turbidez provocan olor y sabor repugnantes.

    Género Pediococcus: Cocos grampositivos, anaerobios, asporógenos, catalasa negativos. Son tolerantes a los ácidos pero su pH óptimo oscila entre 5 y 6. Producen ácido láctico y diacetilo. Ocasionan agriado, turbidez  y viscosidad.  A las contaminaciones por este género se les denomina "mal de la sarcina".

    Género Acetobacter: Bastones gramnegativos, aerobios, asporógenos, catalasa positivos (excepto A. peroxidans). Crecen entre 5-40 oC. Son tolerantes a los antisépticos del  lúpulo. La mayoría de las especies provocan el agriado de la cerveza excepto A. capsulatum y A. viscosum que ocasionan viscosidad y A. turbidans, responsable de agriado y turbidez. Las especies responsables del agriado oxidan el etanol a ácido acético y finalmente a  dióxido de carbono y agua.

    Género Gluconobacter: Bastones gramnegativos, aerobios, asporógenos, catalasa positivos. La especie G. oxidans produce ácido acético a partir de etanol. Algunas cepas son capaces de crecer en la cerveza embotellada gracias al escaso contenido de aire del cuello de las mismas y su crecimiento da la apariencia de sogas o cuerdas.

     Género Zimomonas: Bastones gramnegativos, anaerobios, asporógenos, catalasa negativos. Tolerantes al alcohol (lo producen). Provocan turbidez y sabores de fondo.

    Familia Enterobacteriaceae: Todos sus géneros y especies se presentan como bastones cortos gramnegativos, anaerobios facultativos, asporógenos, catalasa positivos. Son sensibles a pH iguales o menores a 4,2 y al etanol. Por lo general se presentan como contaminantes del mosto y en las primeras etapas de la fermentación. Las especies más reportadas son: Hafnia alvei, Citrobacter freundii, Klebsiella sp., Enterobacter  sp. y Obsobacterium proteus. Este último es el más reportado.  Provocan infección de la levadura y desarrollan olores y sabores desagradables.

Levaduras salvajes

    Según Rainbow, se considera levaduras salvajes "aquellas que no son deliberadamente utilizadas ó no están bajo control" De esta forma se incluyen tanto las perjudiciales como las inocuas sin efectos detectables. Constituyen la parte más complicada del control microbiológico, ya que se dificulta su diferenciación de las  levaduras seleccionadas para el proceso como son: Saccharomyces cerevisiae y S. carlsbergensis. Para la diferenciación se han sugerido numerosas formulaciones de medio de cultivo. Dentro del género de Saccharomyces, la diferenciación de estirpes es prácticamente imposible mediante técnicas de cultivo y solo los métodos inmunológicos resultan precisos. En ocasiones el test de esporulación resulta muy útil ya que las estirpes cerveceras no son capaces de esporular a diferencia del resto de  Saccharomyces.

      Algunas levaduras que han sido identificadas como contaminantes cerveceros en diferentes publicaciones incluyen los géneros: Brettanomyces, Hnasenula, Candida, Kloeckera, Pichia y Saccharomyces. De ellos Pichia, Hansenula y la mayoría de las cepas de Candida son aeróbicas lo que limita su capacidad contaminante a cervezas almacenadas en presencia de aire. En estas condiciones crecen rápido, formando películas superficiales y originando sabores de fondo. Las especies de Brettanomyces, aunque aeróbicas, producen grandes cantidades de ácido que afectan el sabor de las cervezas. Dentro de las levaduras salvajes,  las más importantes son algunas especies de Saccharomyces como S. uvarum  (también conocida como S. carlsbergensis; por supuesto, en fábricas que utilicen S. cerevisiae), S. diastaticus y S. pastorianus.  Las mismas son responsables de exceso de gas y turbidez; S. diastaticustambién provoca atenuación. Las levaduras salvajes son capaces de crecer durante la fermentación y en la cerveza acabada, representando un problema especial en la alteración de la cerveza acondicionada para barril.

Mohos

    Los mohos no constituyen contaminantes directos de la cerveza, sí de la cebada, cereales aditivos y la malta. Los metabolitos que se producen durante su crecimiento, más adelante pueden ser fuentes de sabores desagradables de fondo  y provocar la rápida evolución de dióxido de carbono al disminuir la presión (gushing).  La flora normal de la cebada incluye géneros como Fusarium, Helminthosporium y Alternaria. Durante el almacenaje, cuando la humedad es superior a 13,2%, germinan las esporas y  se desarrollan Aspergillus y Penicillium; todos, por lo ya explicado, constituyen hongos imperfectos fáciles de identificar.

Principales puntos de contaminación

1)     Materias primas

    Agua

    El agua utilizada en las cervecerías debe ser microbiológicamente pura. Este criterio se sustenta en dos resultados: determinación de coliformes; conteo total de microorganismos. El primero acredita que el agua está exenta de contaminación fecal; el segundo que la carga microbiana está dentro de los parámetros (inferior a 105 u.f.c/mL). Es común la presencia de Pseudomonas sp., Acinetobacter sp. y Alcaligenes  sp. y coliformes de vida libre (saprófitos) como Klebsiella, Enterobacter y Hafnia. Estos saprófitos se diferencias de los procedentes de la flora intestinal mediante siembra en caldo MacConkey e incubación a 440 C; solo los entéricos crecen y  producen gas. Estas bacterias constituyen una fuente de contaminación en las cervecerías y pueden desarrollarse rápidamente en el mosto (muy raras veces en la cerveza ya que el pH es muy bajo y el contenido de etanol atentan contra su multiplicación) y producir derivados fenólicos y sulfurados que afectan el sabor final de la cerveza.

    Cebada y malta

    Como ya se ha expresado, los mohos constituyen flora normal de los cereales. Tras el almacenaje, si no hay el debido control de la humedad (inferior al 13%) van a ser contaminados por diversas especies de Aspergillus y Penicillium.  Los granos pierden su color característico. Estos mohos producen diversas toxinas (micotoxinas) que, en otras condiciones constituyen un riesgo a la salud sin embargo, los estudios realizados demuestran que las mismas, al parecer, son degradadas durante el proceso de producción y no constituyen un riesgo a la salud aunque si pueden afectar la calidad del producto final.

    Lúpulo

    El lúpulo posee componentes que ejercen acción bacteriostática sobre bacterias grampositivas. Sin embargo, cuando se almacena en lugares húmedos se promueve el crecimiento de hongos y estos afectan su acción antibacteriana ulterior.

    2) Mosto

    El mosto constituye un medio ideal para la mayoría de las bacterias gramnegativas y algunas grampositivas tolerantes a los antisépticos del lúpulo por ello, nunca debe almacenarse a temperaturas por debajo de 55 0C por breve que sea el tiempo antes de añadirle el inóculo de cultivo. Bacterias como Lactobacillus delbrueckii, y otras formadoras de endosporas, como son termófilas, pueden contaminar el mosto, multiplicarse rápidamente a temperaturas entre 50-650C y provocar acidez. Otras bacterias, como las mencionadas dentro de la familia Enterobacteriaceae, al desarrollarse en el mosto producen derivados sulfurados  y  fenólicos que afectan el sabor final de la cerveza.

    3) Fermentación

Con la inoculación, si  no se utiliza un cultivo puro, se incorporan al mosto toda una gama de levaduras salvajes y bacterias. Entre estas últimas merece especial atención Obesumbacterium proteus. Se introduce al ámbito cervecero a través del agua y, con gran rapidez se adapta a las condiciones de la fábrica aspecto que le permite presentarse junto a las levaduras que se utilizan por segunda o tercera vez. Crece en los primeros estadíos de la fermentación hasta que los descensos de pH y la elevación en la concentración de etanol le resultan adversos ya a las 24-36 horas de realizado el inóculo. Al incrementarse su concentración retarda el proceso de fermentación al elevar el pH de la cerveza. Afecta además su sabor al producir compuestos sulfurados. Otra especie, Enterococcus agglomerans, tiene un comportamiento similar. Las enterobacterias y otras gramnegativas, se inhiben rápidamente durante la fermentación. A no ser que ya existiera un crecimiento abundante antes de la inoculación, su efecto es pequeño en la cerveza. En los procesos en los que se recupera  la levadura de la superficie O. proteus constituye un problema al unirse a éstas, no sucede igual con las otras gramnegativas.

    Acetobacter  y Gluconobacter, aunque pueden aislarse en esta etapa, su crecimiento se ve afectado por las condiciones de anaerobiosis. Lactobacillus y Pediococcus, también asiladas durante esta etapa, han de competir con la levadura, ésta, en mayor concentración. El diacetilo que producen (0,1 g/L)  es reducido por las levaduras a butano-2-3-diol que, para que afecte el sabor debe aparecer en concentraciones de 500 mg/L.

    La levadura cervecera, para que cumpla su rol, ha de estar pura. Este estado ideal no siempre se pierde por contaminación con levaduras salvajes, la propia levadura cervecera puede perder sus cualidades debido a la aparición de mutantes. Esto constituye un problema pues las mismas pueden estar mejor  adaptadas (crecer mejor) pero perder sus cualidades fermentativas. Estas mutaciones pueden aparecer de forma espontanea o ser inducidas.  La parición de cepas salvajes pueden tener su origen en ls materias primas, el aire, la propia planta cervecera. Como el sustrato es el mismo, compiten con la levadura cervecera y superarla. Algunas son muy pequeñas y dificultan la filtración, otras pueden secretar exoenzimas que afectan la atenuación, o producen ésteres y compuestos fenólicos que alteran el sabor.

    4) Almacenaje

    Previo al embotellamiento, o cuando ya éste se ha efectuado pero existieron errores de filtración o pasteurización, puede producirse contaminación. El número de bacterias que pueden constituir problema a este nivel es reducido debido a: el bajo pH; la presencia de etanol; la ausencia de carbohidratos fermentables y las condiciones de anaerobiosis. Sin embargo, las bacterias ácidolácticas como L. Brevis y P. damnosus pueden lograrlo. Su mayor afectación es al sabor ya que la producción de diacetilo, al no haber levaduras en suspensión, no puede ser reducida y confiere un sabor a mantequilla. Las bacterias acéticas, debido a la anaerobiosis, no causan por lo general problemas en esta etapa, sin embargo, G. oxidans, con el escaso aire presente en el cuello de las botellas, crece, produce ácido acético y altera el aspecto del producto  (crecimiento con apariencia de cuerdas).

Otros contaminantes a este nivel pueden ser las levaduras salvajes que forman películas superficiales, provocan turbidez y producen ésteres que afectan el sabor.

5) Otras

Aunque lo referido abarca los principales puntos de contaminación, el producto terminado está expuesto a otros agentes ya fuera de la fábrica. Por supuesto, no pretendemos analizar el caso de los populares "termos" ya que cada  uno sería fuente suficiente para un extenso cepario, sin embargo, en los países donde se expende la cerveza en barriles o en toneles, se ha podido constatar la presencia de levaduras salvajes, no coincidentes con las detectadas en la fábrica de origen, bacterias acéticas y otras. Aunque su nivel, por lo general, no es lo suficientemente alto para afectar el producto, este daño tampoco tiene lugar debido al rápido consumo que se hace de estas cervezas, cualquier retardo conllevaría a las afectaciones ya descritas. Esta contaminaciones hablan en detrimento de la limpieza de los contenedores utilizados, en los que, poco a poco, se van estableciendo estos contaminantes.

Aislamiento e identificación

El secreto de cualquier aislamiento radica en: 1) una adecuada toma de muestra y 2) saber qué se desea aislar. Sin estos precedentes la cosa se convierte en la famosa aguja del pajar. Los procedimientos generales de aislamiento se realizan a partir de: a) muestras líquidas, b) muestras sólidas.  A partir de ellas se buscan, por lo general, dos cosas: microorganismos totales; microorganismos muy particulares, en este caso los que afectan al producto o al consumidor. Tanto una elevada carga microbiana como los segundos constituyen razones de decomiso del producto, aspectos que están debidamente normados[2],[3],[4],[5],[6].

Para el aislamiento a partir de muestras líquidas se toman asépticamente volúmenes de estos (generalmente 1 mL) y se le hacen diluciones decimales en solución salina estéril a partir de las que se hacen las siembras (0.1 mL) en placas Petri con medio para conteo de microorganismos totales y en particular (posteriormente se sugerirán algunos de los más utilizados). Si las muestras involucran productos ya pasteurizados, se deben filtrar por membranas que retienen células y estas membranas se presionan sobre la placa para depositar las posibles células microbianas.

Si se trata de muestras sólidas (cebada, por ejemplo) se toman 10 g y se agitan en 90 mL de solución salina, luego ésta se trata igual que las muestras líquidas. En el caso de las superficies (paredes de tanques, locales, etc.) se utilizan hisopos de algodón que se frotan sobre una superficie de 0,5 m2. Estos hisopos se pueden descargar en solución salina estéril para procesar como se ha mencionado, o simplemente hacer siembras directas con ellos sobre placas con medios selectivos.

En todos los casos, las incubaciones de los medios se hacen entre 25-300C, la segunda para bacterias y la primera para levaduras y mohos. Aunque en el resto de los laboratorios que donde se trabajan alimentos, los aislamientos de bacterias se incuban a 350C, en el caso particular de las cervezas, dadas las características de su producción, se aplican temperaturas más bajas con la finalidad de garantizar la temperatura óptima a los posible contaminantes.

Con respecto a los medios de cultivo utilizados es necesario, como ya se aclaró, tener en cuenta cual es el objetivo perseguido. Para bacterias, si lo que se desea es conteo total, el Agar Nutriente suplementado con actidione (20-100 µg/mL) para inhibir el crecimiento de levaduras y mohos, resulta adecuado. Las determinaciones de enterobacterias, incluyendo O. proteus, se realizan mediante Agar MacConkey; las bacterias acéticas se aíslan bien en Agar Extracto de Malta suplementado con Extracto de Levadura y con el pH ajustado a 4. Como la acidez inhibe la solidificación del agar, es preciso incrementar el porciento de éste en dichos medios (2% o más, según el tipo de agar). Para Z. movilis es preciso incubar en anaerobiosis. Para las bacterias ácido lácticas los medios más efectivos son el Agar M.R.S. (Man, Rogosa y Sharpe) y el Agar WLN (Wallenstein Laboratories Nutrient) que contemplan dos fuentes carbonadas (glucosa y maltosa) para esta bacterias tan exigentes, cuando de aislamiento se trata. Las placas se deben de incubar entre 25-300C. Para la precisión de algunos géneros de interés, a partir de los aislamientos se efectúan tinciones de Gram, de endosporas y algunas pruebas bioquímicas como las sugeridas en el cuadro (Contaminantes bacterianos frecuentes en las producciones cerveceras).

Para levaduras se utiliza el Agar Extracto de Malta suplementado con actidione (20 µg/mL) que inhibe el crecimiento de la levadura cervecera y posibilita el de las levaduras salvajes. Otra variante más exacta consiste en utilizar dos medios en paralelo: uno con L-lisina como única fuente de nitrógeno y otro con cristal violeta. En el primero crecen todas las levaduras salvajes excepto las del género Saccharomyces, que si son aisladas en el segundo. Todas las placas se incuban a 250C. Por lo general, la presencia de levaduras salvajes, su número, resulta suficiente. Si se desea precisar géneros o especies es necesario realizar estudios más complejos sobre su morfología y fisiología; en algunos casos, solo el empleo de inmunosueros para determinados antígenos superficiales posibilitan tal clasificación.

Los mohos se aíslan Agar Sabouraud Dextrosa o Agar Extracto de Malta suplementados con penicilina o estreptomicina para inhibir el crecimiento bacteriano. Los cultivos se incuban a 250C.

Contaminantes bacterianos frecuentes en las producciones cerveceras

Leyenda: += > 90% de las cepas son positivas al ensayo; -= < del 10% de las cepas son positivas

               +/-= 11-89% de las cepas son positivas          

Bibliografía.

1. Atlas, R.: Microbiology: fundamental and applications. Macmillan Publishing Company.879. New York, 1984.
2. Barreto, G. et al: Microbiología Farmacéutica. Universidad de Camagüey. 2000.
3. Ben. N.: Extracelular bacterial mineralization within the context of geomicrobiology. Microbiología SEM. Editorial GARSI.13(2):161-172, 1997.
4. Boonmee, M., Leksawasdi, N., Bridge, W: Batch and contnuous culture of Lactobacillus lactis NZ133: experimental data and model development. Biochemical Engeering Journal. 14: 127-135, 2002.
5. Burgos-Rubio, CN., Okos, MR., Wankat, PC: Kinetic study of conversion of different substrates to lactic acid using Lactobacillus bulgaricus. Biotechnol. Prog. 16 (3): 305-314, 2000.
6. Cinética del crecimiento. http://www.monografia.com
7. Crecimiento microbiano. http://ww.microbiologia.com
8. Haw Kworth, D. L.Ñ  Hongos y biodiversidad. Iniciativas internacionales. Microbiología. GGM. 13(2): 221-226, 1997.
9. Harrigan, W. F; Mc Cance, M.: Métodos de laboratorio en Microbiología. Editorial Academia León. 250 pp. España, 1968.
10. Jawetz, E; Melnic, J; Adelberg, E.: Manual de Microbiología Médica. 9NA Edición. Editorial Pueblo y Educación.531pp. La Habana, 1985.
11. Kauffman, C.A.: Role of azoles in antifungal therapy. Clinical Infections Diseases. 22(2): 148-153, 1996.
12. -López, R.: Exoenzimas de dermatofitos aislados de tiñas agudas y cr;onicas. Revista Latinoamericana de Microbiología. 36(1):17-20, 1994.
13. Martínez, J. et al: Microbiología General. Editorial Pueblo y  Educación. Ciudad de La Habana, 1989.
14. Nieto,A; Castillo, L.Del.:Aplicatción de la geética molecular al estudio de C. albicans. An. Real Acad. Farm. 57(1): 65-80, 1991.
15. Oxoid, R.: The oxoid manual. Third Edition. Oxoid Limited. 160 pp. London, 1972.
16. Perfect, J.R.: Minireview. Fungal virulence genes as targets for antifungal Chemio therapy. Antimicrobial Agents and chemiotherapy. 40(7): 1577- 1583, 1996.
17. Rin, H.; Roig, G. Sancho, J.:  Production of carpliones of Lentinus edodes and Ganoderma lucidum grown on cook residues. Microbiologic Sem. 13 (2): 185-192, 1997.
18. Tiballi, RN.: Saccharomyces cerevisiae infections and antifungals susceptibility studies by colorimetric and broth macrolution methods. Diagn. Microbiol. Infect. Diseases. 23: 135-140,1995.
19. Torrescano, A.: Intoxicación alimentaria causada por hongos silvestres. Enfermedades Infecciosasa y Microbiología. 16(6): 275-277, 1996..
20. Trüper, H.: Help! Latin! How to avoid the most common mistakes while giving Latin names to newly discovered prokaryotes. Microbiología SEM. 2(3): 161-172, 1996
21. Wingard, J.R.: Importance of Candida species other than C.albicans as pathogens in oncology patients. Clinical Infections Disease. 20: 115-125, 1995.

Autor:

Dr.Sc. Guillermo Barreto Argilagos

Centro de Estudio para el Desarrollo de la Producción Animal (CEDEPA)

Universidad de Camagüey

[1] Este problema, que afectaba la calidad de los prestigiosos vinos franceses,  fue lo que dio pie a las investigaciones realizadas por Pasteur.

[2]  Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis (INPPAZ).  Contaminación microbiana de los alimentos vendidos en la vía publica en ciudades de América Latina y las características socioeconómicas de sus vendedores y consumidores. ISBN  3220. 92 75. 1996 15-19.

[3] NC ISO 9000:2000

[4] Harding Albert, Xiomara M: Seminario sobre normalización y calidad a la dirección de la Unión Agropecuaria Militar. DNMCC. Modulo de Calidad. Diplomado de Gerencia Empresarial.  2003-04.

[5] Normas cubanas aprobadas en las Resolución 30-2000, dada en Ciudad de La Habana a los 19 días del mes de abril del 2000.

[6] NC 38-02-08:87 Sistema de Normas sanitarias de Alimentos. Contaminantes microbiológicos