Metabolismo Bacteriano

1. Objetivos
2. Esterilización y desinfección
3. Técnicas de esterilización
5. Antibióticos

Las bacterias se encuentran en casi todos los ambientes e intervienen en varios procesos biológicos. Por ejemplo, pueden producir luz, como en la fosforescencia de los peces muertos y pueden producir combustión espontánea en almiares, pajares y graneros de lúpulo. Ciertas formas anaerobias desprenden, por descomposición de la celulosa, gas de los pantanos en charcas estancadas; otras bacterias favorecen la formación de depósitos de hierro ocre y manganeso en los pantanos. Las bacterias también afectan a la naturaleza y composición del suelo.

Como resultado de su actividad, los restos de sustancias orgánicas de las plantas y los animales se descomponen en partículas inorgánicas. Este mecanismo es una fuente importante de alimento para las plantas. El proceso fotosintético en que se basan las plantas fue, casi con certeza, desarrollado en primer lugar en las bacterias; el reciente descubrimiento de una bacteria fotosintetizadora denominada Heliobacterium chlorum puede ayudar a la comprensión de este desarrollo fundamental en la evolución de la vida.

Todos los seres vivos llevan a cabo el procesamiento de los nutrientes que los mantienen vivos. A este conjunto de procesos, se le conoce como metabolismo y consiste de un gran número de reacciones químicas destinadas a transformar las moléculas nutritivas en elementos que posteriormente serán utilizados para la síntesis de los componentes estructurales; como pueden ser las proteínas. Otra parte importante del metabolismo es la de transformar y conservar la energía que está contenida en una reacción química en algún proceso que requiera de energía, como puede ser el trabajo o el movimiento.

Es evidente que los nutrientes son transformados cuando entran en un organismo, ya que en ningún caso el alimento contiene todas las moléculas que una célula requiere. Esto se vio con claridad al observar el crecimiento normal de levaduras en un medio de cultivo que sólo contenía glucosa como única fuente de energía. Así pues, se pensó que la síntesis de todos los componentes celulares se llevaba a cabo en el interior de las levaduras.

Hoy sabemos que las transformaciones que sufre la glucosa no ocurren en un solo paso, sino que, por el contrario, se forman varios productos intermedios que en muchas ocasiones no tienen una función específica a no ser la de formar parte de lo que se conoce como vía metabólica. La transformación de los nutrientes en compuestos útiles para la subsistencia de un organismo se lleva a cabo por medio de las reacciones químicas que realizan unas proteínas conocidas como enzimas.

Objetivos:

• Estudiar el metabolismo de tipos bacterianos representativos que reflejan los cambios producidos en la fermentación de la glucosa, lactosa, manitol, hidrólisis de urea, citrato, producción de sulfuro de hidrógeno, producción de indol, y la hidrólisis de proteínas (gelatina).
• Mostrar las vías metabólicas que varias especies tienen en común y que sirven de base para su diferenciación.

Procedimiento:

• Disponer los tubos en las gradillas y rotularlos con el nombre del microorganismo.
• Inocular cada tubo con uno de los cultivos, procurando hacerlo con el asa indicada y de la forma indicada (punta sin mover, superficial, picadura, etc.)
• Incubar a 37ºC por 18 hrs. y luego leer los resultados.

Resultados:

Conclusiones:

• Como podemos notar en la tabla de resultados todos los microorganismos son tolerantes a la glucosa y son capaces de fermentarla.
• En la reacción con lactosa no todos los microorganismos la fermentan, podemos notar que algunos liberan gas que es el hidrogeno.
• En la prueba del citrato la realizamos también para comprobar si los microorganismos podían utilizar el citrato como única fuente de carbono, provoca alcalinización del medio.
• En la prueba con el agar manitol ya que este presenta rojo fenol que es un indicador de pH solo tendría que reaccionar con Staphylococcus aureus ya que es uno de los microorganismos que fermenta el manitol.
• En la prueba con el agar urea podemos notar que el único microorganismo que reacciona es el Proteus vulgaris ya que este produce ureasa que es la enzima que permite hidrolizar la urea.

Esterilización y desinfección

La esterilización es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas

esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporas, y virus. Se entiende por muerte, la pérdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo. Se trata de un término absoluto, donde un objeto está estéril o no lo está, sin rangos intermedios.

En la desinfección se eliminan los agentes patógenos reconocidos, pero no necesariamente todas las formas de vida microbianas. Es un término relativo, donde existen diversos niveles de desinfección, desde una esterilización química, a una mínima reducción del número de microorganismos contaminantes. Estos procedimientos se aplican únicamente a objetos inanimados.

La antisepsia es el proceso que por su baja toxicidad, se utiliza para la destrucción de microorganismos presentes sobre la superficie cutáneo-mucosa. Este término tampoco implica la destrucción de todas las

formas de vida. Existen agentes como los alcoholes que son antisépticos

y desinfectantes a la vez. Dado que el tema que se está abordando es: métodos para controlar o destruir distintas poblaciones bacterianas; es necesario saber previamente la cinética de dicha destrucción, es decir de que modo muere una población, y que parámetros inciden sobre este efecto.

Técnicas de esterilización

1. Destrucción de microorganismos mediante calor:

La energía térmica es la forma más efectiva de esterilización. Esta puede utilizarse como calor húmedo o seco.

1. Mecanismo de Acción: Al igual que los procesos de desinfección, la esterilización térmica destruye a los microorganismos en forma gradual; es por esto que no hay un único mecanismo de acción, sino más bien la suma de distintos eventos complejos que se van sucediendo a medida que aumenta la temperatura. Así, aunque el efecto final de la esterilización por calor húmedo a 121ºC es la desnaturalización y coagulación de las proteínas, son importantes otros mecanismos de destrucción, que justifican la utilización de calor húmedo a temperaturas inferiores, como veremos más adelante. El primer efecto letal sería la producción de rupturas de cadena única en el ADN que provocarían la muerte celular por activación o liberación de enzimas con actividad de endonucleasas.

   El punto crítico aquí, para la supervivencia de la célula sería su capacidad para reparar la lesión, función que depende del estado genético y fisiológico de la bacteria. A medida que aumenta la temperatura se agregaría la pérdida de la integridad funcional de la membrana citoplásmica, lo que produciría interferencias en el intercambio con el medio externo, los procesos respiratorios y la síntesis proteica. Por último, las temperaturas más elevadas activarían ribonucleasas que degradando el ARNr producen la pérdida de viabilidad de las células expuestas. Las temperaturas a la cual puede usarse el calor húmedo son:

   Por debajo de 100ºC→Pasteurización.

   A 100ºC → Ebullición y Tindalización

   Por encima de 100ºC → Autoclavado

   

   Pasteurización: se utiliza para la destrucción de gérmenes patógenos, con resistencia térmica similar o inferior a M. tuberculosis, Brucella y Salmonella. Este no es un método de esterilización sino de desinfección, donde no se destruyen ni esporas ni virus no lipídicos (por Ej.: HAV).

   Existen dos métodos de pasteurización: o se calienta a 65ºC durante 30' o a 72ºC durante 15". Luego ambas se enfrían rápidamente a 10ºC.

   Esta técnica se utiliza fundamentalmente en la descontaminación de la leche.

   

   Ebullición: consiste en mantener un objeto o sustancia en un baño a 100ºC durante 30'. Aplicado así destruye la mayoría de las formas vegetativas bacterianas, hongos y virus lipídicos (por Ej.: Herpesvirus y HIV). En cambio no es efectivo para la destrucción de esporos y virus no envueltos. La repetición de este proceso durante tres días consecutivos, constituye la Tindalización. Su fundamento teórico está dado por la destrucción de las formas vegetetivas durante los períodos de ebullición, permitiendo que las esporas germinen durante el reposo volviéndose susceptibles al próximo calentamiento. Tampoco aquí se esteriliza.

   

   Autoclavado: utiliza vapor de agua a 121ºC durante 15'o 20'. Esta temperatura se logra si se obtiene una presión de una atmósfera relativa (dos atmósferas absolutas), ya que el aumento de la presión provoca aumentos proporcionales en el punto de ebullición del agua. Es el mecanismo de destrucción microbiana más efectivo, y bien utilizado asegura esterilización. El equipo que se utiliza es la autoclave, del cual existen distintos tipos, como ser:

   1. Vertical de manejo manual.

   2. Que opera por gravedad.

   3. De esterilización rápida.

   

2. Calor húmedo:
3. Calor seco:

Mecanismo de acción: Es diferente al del calor húmedo. El calor seco provoca desnaturalización de proteínas, lesiones por oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos. La acción letal es el resultado del calor trasmitido desde el material con el cual los microorganismos están en contacto, y no desde el aire caliente que los rodea. Existen tres formas principales de esterilización por calor seco: flameado, incineración y mediante la utilización del horno Pasteur, para ello se necesita alcanzar mayor tiempo y temperatura que en el autoclave, debiéndose mantener un objeto a 160ºC durante 2hs. El motivo de estos incrementos estarían dados porque la ausencia de agua disminuiría el número de grupos polares de las cadenas peptídicas, lo que daría mayor estabilidad a las moléculas bacterianas, por lo que se requeriría mayor energía para abrirlas.

Horno Pasteur O Poupinell: consiste en un recinto metálico de doble pared con aislante entre ambas (para evitar la pérdida de calor) y una puerta. La fuente de calor suele ser eléctrica y está incorporada. Posee un ventilador que facilita la circulación del aire caliente, para homogeneizar la temperatura. Un termómetro (con alcance mínimo de 200ºC) visible desde afuera, registra la temperatura del interior del recinto. Por calor seco se pueden esterilizar: materiales de inyectables, vidrios, instrumentos quirúrgicos y objetos metálicos, así como aceites, vaselinas y polvos, que como ya se ha dicho son impermeables al vapor.

Controles de esterilización:

Existen tres tipos: físicos, químicos, biológicos

Controles físicos: están relacionados al operario que realiza el procedimiento y la vigilancia de ciertos parámetros como: presión, tiempo, temperatura, etc.

Controles químicos: consiste en tiras de papel con una sustancia que cambia de color al ser expuesto a la temperatura correspondiente. La ventaja de este método, es la rapidez con que se sabe el resultado, ya que es inmediato. La gran desventaja es que dice poco sobre el tiempo de exposición, por lo que no asegura un procedimiento correcto. Estos controles deben utilizarse en todos los ciclos de esterilización.

Controles biológicos: consisten en exponer esporas bacterianos al ciclo de esterilización y luego verificar su viabilidad. Son los más seguros. Dentro de una ampolla se encuentra un medio de cultivo apropiado para el desarrollo de las bacterias en estudio. Por fuera de esta, un tubo plástico, contiene una cinta de papel marcador de pH, impregnado con esporas de bacterias capaces de resistir temperaturas cercanas a los procesos realizados. Se utilizan esporas de Bacillus estearothermophilus en el autoclave y de B. subtilis en la poupinell.

Este sistema se coloca dentro del paquete menos accesible ya sea para el calor o el vapor. Finalizado el ciclo de esterilización, se rompe la ampolla (por presión manual sobre el tubo), esto pone en contacto el medio con los esporos) y se incuba en un baño (a 60ºC para Bacillus

estearothermophilus y a 37ºC para B. subtilis) durante más de 48hs. Si existen microorganismos viables, su metabolismo provocará un cambio de pH que hará virar el color del marcador, revelando el fallo del procedimiento, por lo que deberá volverse a esterilizar todo.

Este tipo de controles debe realizarse periódicamente, o cuando se dude de la efectividad del procedimiento.

1. Con este fin pueden utilizarse tanto las radiaciones ultravioletas (UV) como las ionizantes y rayos infrarrojos. Con respecto a la naturaleza de la luz se acepta una combinación entre la teoría cuántica y la electromagnética. Es decir, que existe una partícula indivisible (denominada cuanto) constituida por un fotón que se desplaza a través del espacio describiendo una trayectoria ondulatoria. La energía de un fotón es inversamente proporcional a la longitud de onda de la radiación, sabiendo que longitud de onda es la distancia que existe entre dos puntos correspondientes de la trayectoria ondulante. Parte de esta energía absorbida por los sistemas biológicos cuando estos son expuestos a las radiaciones. La fracción de energía absorbida directamente proporcional a la intensidad de la radiación, al tiempo de exposición a la misma y a un coeficiente de absorción que es característico de cada material.

   Veremos qué sucede a nivel molecular cuando las radiaciones interactúan con la materia. Cuando la radiación incidente tiene energía suficiente puede elevar el nivel energético de los electrones, hasta el punto de arrancarlos de su orbital (produciéndose ionizaciones). Si la energía es menor, los electrones aumentan su nivel de energía pero sólo temporalmente, volviendo a su estado inicial luego de un período de tiempo. Este estado elevado de energía se denomina estado excitado. La molécula excitada podrá transferir ese exceso de energía otras, en forma de energía vibratoria (produciéndose calor); o disiparla en forma de radiación electromagnética. Debido a la relativamente baja cantidad de energía que son capaces de transmitir los rayos UV, sólo afectan a los electrones de los átomos periféricos de las moléculas, produciéndose solo estados de excitación. Las radiaciones ionizantes son las que pueden extraer electrones de sus orbitales. Los rayos infrarrojos sólo pueden provocar energía vibratoria, por lo que sólo generan calor. Hablaremos a continuación solamente de las radiaciones UV ya que son las más utilizadas en nuestros laboratorios. Se sabe que las radiaciones ionizantes son cada vez más utilizadas en los laboratorios como técnicas de esterilización de rutina, ya que los adelantos tecnológicos han simplificado estos equipos y su manipulación. Se utilizan para la esterilización de materiales descartables como jeringas, agujas, materiales para vías, etc.

   

   Radiaciones UV:

   Mecanismo de acción: el principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorción por el ADN y el resultante daño de este. Así provocan la formación de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formación de dímeros de pirimidina de tipo ciclobutano.

   Esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibición de la síntesis de ADN y secundario a esto, inhibición del crecimiento y la respiración.

   Aplicaciones: estas radiaciones pueden producirse artificialmente con lámparas de vapor de mercurio. Son igualmente efectivas para Gram(+) y Gram(-). Su principal uso es para esterilizar el aire y superficies, ya que no penetran en sólidos y lo hacen pobremente en líquidos.

2. Esterilización por radiación
3. Esterilización por medios mecánicos:

Filtración

Es el método usado en el laboratorio para esterilizar líquidos termolábiles.

Existen distintos tipos de filtros: de asbesto-celulosa, de vidrio, de cerámica y de ésteres de celulosa o membranas. Las membranas están compuestas por ésteres de celulosa biológicamente inertes. Los poros varían desde 0.025 µm. a 25 µm. de diámetro, siendo los de 0.22µm. los más utilizados ya que son lo suficientemente pequeños para detener a todas las bacterias. Con este método se esterilizan: azúcares, urea, sueros, antibióticos, etc.

Los filtros de membrana también se utilizan en Microbiología para otros propósitos. Dado que son inertes, proporcionan un buen medio para recoger microorganismos, por ejemplo para cultivar bacterias que se encuentran en bajas concentraciones en un gran volumen de líquido. El mecanismo de acción es bastante simple: detienen todas las partículas que posean un tamaño mayor que los poros. En realidad los "poros" quedan formados por los espacios que resultan de la superposición de las fibras de las distintas capas que forman la membrana. Así, algunas partículas de menor tamaño son retenidas por otros mecanismos como las fuerzas de Van der Waals o por suma de partículas retenidas previamente, etc. por lo cual "el tamaño del poro" es un valor virtual definido por el tamaño de la partícula retenida, más que por un diámetro real medible.

Aplicación de calor húmedo

Objetivo:

• Mostrar la efectividad del calor húmedo en la esterilización de cultivos bacterianos.
• Comprobar el efecto de las diferentes temperaturas en los cultivos bacterianos.

Procedimiento:

• Rotular las placas con agar nutritivo y los tubos de Thioglicolato de acuerdo al diseño gráfico indicando los tiempos y temperaturas a los que serán expuestos.
• Inocular 2 a 3 gotas del cultivo bacteriano escogido en el tubo Thioglicolato Nº 9, a partir del cual inocular el cuadrante 0 de la placa Nº 1 e igualmente los 4 tubos correspondientes para la exposición a 55ºC. Colocar los tubos en el baño María de 55ºC, e iniciar el conteo del tiempo de acción del calor húmedo; inoculando a los 5, 10 y 30 minutos los cuadrantes de la placa correspondiente. De igual manera proceder con la placa Nº 2 y los tubos que serán expuestos a 100ºC.

• Colocar las placas Nº 1 y Nº 2 y los tubos inoculados en la incubadora a 37ºC entre 18 – 24 horas. Después de este período realizar la lectura del desarrollo microbiano en los cuadrantes de las placas y los tubos.

Resultados:

• El signo positivo (+) indica que si hubo crecimiento, por el contrario el signo negativo (-) significa que no hubo crecimiento.

Placa Nº 1 expuesta a 55ºC

Placa Nº 2 expuesta a 100ªC

Conclusiones:

• El hecho de que haya crecimiento se debe a la tolerancia de cada microorganismo al calor.
• El crecimiento en la placa no es igual al crecimiento que se da en el tubo.
• El primer efecto letal a la exposición al calor húmedo es la producción de rupturas de cadena única en el ADN que provocan la muerte celular por activación o liberación de enzimas con actividad de endonucleasas.
• Las bacterias podrian sobrevivir dependiendo de su capacidad para reparar la lesión, esta función depende del estado genético y fisiológico de la bacteria. A medida que aumenta la temperatura se agrega la pérdida de la integridad funcional de la membrana citoplásmica, lo que produciría interferencias en el intercambio con el medio externo, los procesos respiratorios y la síntesis proteica.

Aplicación del calor seco

Objetivo:

• Mostrar la efectividad del calor seco como método de esterilización de material contaminado.

Procedimiento:

• Rotular cada tubo estéril, con la temperatura y el tiempo de exposición correspondiente.
• En cada uno de los 8 tubos colocar papel filtro impregnado.
• El 9º disco de papel filtro impregnado colocarlo en el 9º tubo de Thioglicolato y en el 10ª tubo, coloque un disco de papel filtro sin impregnar.
• Una vez identificados los discos y en posición correlativa se les expone al calor seco a 150ºC y 175ºC respectivamente a diferentes períodos de tiempo.
• Terminada la exposición a las temperaturas y tiempos indicados se extraen los tubos del horno esterilizador y se vierte en ellos el caldo Thioglicolato correspondiente.
• Incubar a 37ºC por 18 – 24 horas y anotar los resultados obtenidos al día siguiente en la tabla de resultados.

Resultados:

Conclusiones:

• El calor seco provoca desnaturalización de proteínas, lesiones por oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos.
• Es un error ver crecimiento de E. Coli ya que este microorganismo no soporta temperaturas elevadas.
• B. subtilis es más resistente que el resto de microorganismos debido a que es esporulado y la espora es termorresistente.

Aplicación de la Luz UV

Objetivos:

• Demostrar la efectividad y limitaciones de la luz ultravioleta.

Procedimiento:

• Sembrar en la superficie de las placas petri con agar Tripticase, los microorganismos indicados, empleando para ello el hisopo estéril, dejar secar.
• Para la siembra en Pour Plate utilizar los tubos con agar licuado e inocular en cada uno 100 μL del cultivo seleccionado, mezclar por rotaciσn y verter el contenido en cada una de las placas petri rotuladas con el nombre del cultivo utilizado y dejar solidificar.
• Dividir las placas de siembra en superficie y las de Pour Plate en cuatro cuadrantes y rotular cada cuadrante con los tiempos de exposición siguiendo el sentido de las agujas del reloj: 30 seg. , 2 y 5 minutos.
• Exponer las placas a la luz UV de acuerdo al tiempo rotulado en cada placa cubriendo las partes de la placa que no deben de ser expuestas.
• Incubar 18 – 24 horas a 37ºC y luego anotar los resultados.

Resultados:

• El número de signos indica el volumen de crecimiento del microorganismo.

Conclusiones:

• En el caso de la placa en donde solo se sembro en la superficie la luz UV mató a los microorganismos.
• En la placa vertida o Pour Plate debido a que la luz UV no atraviesa superficies no pudo matar a aquellos microorganismos que se encontraban más profundos.
• El principal mecanismo del efecto letal de la luz UV sobre las bacterias, se atribuye a su absorción por el ADN y el resultante daño de este. Así provocan la formación de uniones covalentes entre los residuos de pirimidina (timina) adyacentes pertenecientes a la misma cadena, lo que provoca la formación de dímeros de pirimidina de tipo ciclobutano, esto produce distorsiones en la forma del DNA e interfiere en el apareamiento normal de las bases. El resultado final es la inhibición de la síntesis de ADN y secundario a esto, inhibición del crecimiento y la respiración.

Desinfección química

Objetivos:

• Comparar la efectividad de varios compuestos químicos in vitro sobre diferentes tipos de bacterias y diferentes diluciones.

Procedimiento:

• Colocar el desinfectante y los tres tubos con agua, rotularlos como Nº1, Nº2 y Nº3, colocarlos en una gradilla. Preparar diluciones de 1:5, 1:25 y 1:125 del desinfectante transfiriendo 1 ml. del desinfectante al tubo de agua Nº1, luego de mezclar transferir de este tubo 1 ml. al tubo de agua Nº2, luego de mezclar transferir 1 ml. de este tubo al tubo de agua estéril Nº3 descartando 1 ml. del último tubo.
• Pipetear 0.5 ml. del cultivo a cada uno de los tubos anteriores.
• Después de 5 y 15 minutos de exposición, extraer 300 μl. de cada uno de los tubos preparados en el paso anterior y colocar en tubos de caldo Thioglicolato; rotular cada tubo de acuerdo a la dilución y el tiempo al que corresponden.
• Luego incubar a 37ºC por 24 horas y luego anotar los resultados en las tablas de anotación.

Resultados:

Diluciones

Escherichia Coli

Conclusiones:

• Puede concluir que en diluciones más altas hay mayor crecimiento bacteriano, debido a que el desinfectante a mayor dilución pierde su eficacia.

Cuestionario

1. Comparar la eficacia del calor seco y del calor húmedo como medios de esterilización.

En ambos casos la utilización del calor y su eficacia dependen de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

Calor Húmedo: Produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se debe principalmente a dos razones: – El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua – El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

Ventajas:

• Rápido y sencillo ya que el vapor penetra rápidamente en los materiales porosos.
• Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo.
• No es tóxico ni deja residuos.
• Hay un bajo deterioro del material expuesto.
• Precios bajos del producto final.
• Desinfección, la esterilización térmica destruye a los microorganismos en forma gradual; es por esto que no hay un único mecanismo de acción, sino más bien la suma de distintos eventos complejos que se van sucediendo a medida que aumenta la temperatura.
• Mayor gama de productos a esterilizar que con calor seco material textil, materiales duros, jeringas y agujas, vidrios, líquidos hidrosolubles.

Desventajas:

• No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua.
• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.
• Temperaturas elevadas.
• Altera ciertos materiales como plásticos y caucho.
• Corrosión de objetos metálicos con deterioro de filos.
• Imposibilidad de esterilizar polvos, aceites y grasas.

Calor seco: El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxicos por niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.

Ventajas del calor seco:

• No es corrosivo para metales e instrumentos.
• Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.
• El calor seco (o desecación en general) provoca desnaturalización de proteínas, lesiones por oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos.
• La acción letal es el resultado del calor trasmitido desde el material con el cual los microorganismos están en contacto, y no desde el aire caliente que los rodea.
• Se aplica a líquidos y sustancias liposolubles e hidrófugas (aceites, parafinas, vaselinas, cremas etc.)
• Se aplica a instrumentos cortantes (bisturís, tijeras, etc.)

Desventajas:

• Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

1. El DNA de una célula procariote sufre lesiones espontáneas debido a la depurinización, desaminación, alquilación y oxidación de los nucleótidos o al efecto de la radiación UV. Sin embargo, en las células vegetativas estos daños son rápidamente reparados por efectivos sistemas enzimáticos. En cambio, las esporas bacterianas no presentan actividad enzimática pero son resistentes gracias al bajo contenido de agua que retarda o altera las reacciones químicas que afectan al DNA. Este menor contenido de agua disminuye la tasa de depurinización y ka fotoquímica del DNA frente al UV respecto a las de una célula vegetativa. El DNA de la espora se encuentra unido a unas proteínas denominadas alfa/beta-SASP que disminuyen el daño térmico del DNA. La termorresistencia de las endósporas es una de sus principales características. Mientras que las bacterias o las formas vegetativas de las bacterias esporuladas sometidas a 80 ºC durante diez minutos (pasteurización) mueren, las endósporas sobreviven e incluso soportan un calentamiento superior. Para eliminarlas son necesarias técnicas de esterilización.

2. Comparar la resistencia al calor de las células vegetativas con las esporas bacterianas.

   El punto térmico mortal o letal: es la temperatura mínima que mata a todas las bacterias en un tiempo determinado, el tiempo de referencia empleado es de 10 min.

   El tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una determinada temperatura.

3. Establecer la diferencia entre los términos: punto térmico letal y tiempo térmico letal.
4. Enumerar las principales condiciones que influyen en la actividad antimicrobiana de los agentes químicos.

• Actúan sobre microorganismos en cualquier estadío metabólico (en multiplicación o no).
• Se caracterizan por actuar inclusive sobre los esporos bacterianos (forma más resistentes dentro de los microorganismos), produciendo una esterilización química si el tiempo de acción es el adecuado.
• Los desinfectantes de alto nivel actúan modificando en forma irreversible grupos funcionales de proteínas y/o ácidos nucleicos. Entre otros efectos, esto provoca inhibición enzimática, lo que lleva a la muerte celular. Los agentes que predominan en este grupo son los Alquilantes (Oxido de etileno, formaldehído, glutaraldehído).
• Buena tolerancia local para la piel humana, las mucosas y la superficie de heridas.
• Acción rápida.
• Lesionan la membrana celular.
• Inactivan irreversiblemente la proteína.
• Lesionan ácidos nucleicos.
• Eficaz en materia orgánica.
• Poder de penetración conveniente en las grietas de los tejidos.
• Solubilidad y estabilidad.

1. COMPUESTOS FENOLICOS:

   Actúan rápidamente, se combinan con las proteínas, coagulándolas a altas concentraciones (acción germicida), actuando en forma inespecífica como un veneno protoplasmático, producen un desordenamiento estructural de la membrana citoplásmica, que interfiere con su funcionamiento normal. Esto provoca la pérdida de pequeños metabolitos del medio intracelular y dificulta tanto el transporte activo como el metabolismo energético, la activación en forma irreversible de las oxidasas y deshidrogenasas que se encuentran unidas a la membrana. El fenol (ácido carbólico) como tal, ya no es utilizado más que como patrón para comparar otros desinfectantes. Esto es debido a su alta toxicidad, carcinogenicidad y su poder corrosivo. La sustitución de uno de los hidrógenos del núcleo fenólico por grupos funcionales tales como alquilo, difenilo, fenil y cloro, disminuye notablemente los efectos adversos y aumenta la actividad antibacteriana de estos compuestos. La unión de estos fenoles modificados a jabones aumentan aún más su acción, a la vez que los hidrosolubilizan. Dentro de las sustituciones más utilizadas se encuentran los alquilo fenoles (cresoles) y los compuestos difenílicos (hexaclorofenol). Los compuestos fenólicos utilizados en las concentraciones adecua-das y con el tiempo suficiente son: bactericidas, virucidas y fungicidas; por Ej: el HIV es inactivado por una solución fenólica al 0.5%, mientras que se necesita una solución al 2% para inactivar hongos. Por lo general la concentración utilizada oscila entre 2 y 5%.

   CRESOLES:

   Se los divide en tres grupos: orto meta y paracresol, aunque suele utilizarse una mezcla de los tres denominada tricresol. Derivados de la destilación del alquitrán de hulla son mezclados con jabón y se comercializan por Ej.: como Creolina. Esta se utiliza para desinfección ambiental por Ej.: paredes, pisos, etc.

   HEXACLOROFENOL:

   Es un derivado halogenado con gran acción bactericida, fundamentalmente sobre bacterias Gram (+), sobre todo estrepto y estafilococos.

   Posee acción persistente, hasta el punto que su máxima acción bactericida se manifiesta luego de varios días de uso consecutivo.

2. Comparar la capacidad germicida del fenol con la de otros desinfectantes de tipo fenólico.
3. ¿Cómo podría demostrar la actividad antimicrobiana de una pomada antiséptica?

Existen tres métodos para demostrar la actividad antimicrobiana de una pomada antiséptica. La primera es usando la técnica de diluciones del agente químico. También se puede usar la técnica del coeficiente fenólico que es una técnica estandarizada que se utiliza para comparar el poder antiséptico de un agente químico frente al del fenol. Es una modificación de la técnica de dilución en tubo. Finalmente se puede hacer uso de la técnica de la placa de agar en donde se inocula una placa que contenga medio de cultivo sólido con el microorganismo utilizado como prueba. El agente químico se coloca en el centro de la placa, bien dentro de un cilindro o impregnado en un disco de papel. Al cabo de 24 a 48 horas se observan zonas de inhibición (crecimiento) alrededor del agente químico. Una modificación de esta técnica es la incorporación del agente químico en el medio de cultivo antes de verterlo sobre la placa. Una vez solidificado se inocula con el microorganismo utilizado como prueba, se incuba y se examina el crecimiento microbiano llevando a lo que se realizo en el laboratorio, se utilizó como método de demostración la introducción de un hisopo en el caldo tripticase con una de las bacterias que contenía una concentración bacteriana equivalente al tubo, luego ésta fue diseminada uniformemente sobre la superficie de la placa con agar. Con pinzas se colocó los discos con pomada antiséptica en la placa, se incubó a 37ºC de 18 a 24 horas. Finalmente se observaría si hubo o no crecimiento bacteriano lo que indicaría el poder del agente antiséptico sobre la bacteria.

Antibióticos

Los antibióticos, o agentes antimicrobianos, son sustancias (obtenidas de bacterias u hongos, o bien obtenidas de síntesis química) que se emplean en el tratamiento de infecciones.

La elección de uno u otro antibiótico en el tratamiento de una infección depende del microorganismo (obtenido por cultivo o supuesto por la experiencia), de la sensibilidad del microorganismo (obtenida por un antibiograma o supuesta por la experiencia), la gravedad de la enfermedad, la toxicidad, los antecedentes de alergia del paciente y el costo. En infecciones graves puede ser necesario combinar varios antibióticos.

La vía de administración puede ser oral (cápsulas, sobres), tópica (colirios, gotas, etc.) o inyectable (intramuscular o intravenosa). Las infecciones graves suelen requerir la vía intravenosa.

Los antibióticos actúan a través de 2 mecanismos principales: Matando los microorganismos existentes (acción bactericida), e impidiendo su reproducción (acción bacteriostática). Su mecanismo de acción predominante los divide en 2 grandes grupos:

Bactericidas

• Beta-lactámicos (Penicilinas y cefalosporinas)
• Glicopéptidos (Vancomicina, teicoplanina)
• Aminoglucósidos (Grupo estreptomicina)
• Quinolonas (Grupo norfloxacino)
• Polimixinas

Bacteriostáticos

• Macrólidos (Grupo eritromicina)
• Tetraciclinas
• Cloramfenicol
• Clindamicina, Lincomicina
• Sulfamidas

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones terapéuticas individuales.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en los hospitales.

Hay pues un doble interés: Terapéutico y epidemiológico.

Susceptibilidad antibiótica

Objetivo:

• Mostrar in vitro la susceptibilidad de diferentes bacterias a ciertos antibióticos.

Procedimiento:

• Introducir el hisopo estéril en el tubo que contiene la bacteria en este caso Pseudomonas, diseminar uniformemente sobre la superficie del agar Mueller Hinton. Proceder igual para los otros cultivos bacterianos.
• Rotular las placas trabajadas con el nombre de la cepa de la bacteria usada.
• Con la ayuda de una pinza colocar los discos de antibióticos en forma adecuada y similar para cada cepa. La distancia de separación entre cada disco no debe ser menor a 2 cm.
• Incubar a 37ºC durante 18 – 24 horas.
• Luego realizar la lectura con ayuda de una regla milimetrada, midiendo el diámetro del halo de inhibición presente alrededor del disco de cada antibiótico.

Resultados:

Conclusiones:

• Podemos notar que la Pseudomona es resistente al cloranfenicol.
• Se puede comprobar que la resistencia y la susceptibilidad del microorganismo al antibiótico esta relacionado al halo que se forma.

Autor:

Chriss Malca Bautista

Email:

Estudios Pregrado en Estomatología – Microbiología oral