Diagnóstico de brucelosis bovina en leche por el Ring Test y ELISA en lecherías de la provincia de Ñuble (VIII Región) (página 2)

MATERIAL Y METODOS

El estudio fue realizado con 60 muestras correspondientes a 60 predios lecheros de la provincia de Ñuble (VIII Región de Chile). Las muestras fueron recolectadas durante los meses de noviembre y diciembre de 1995, meses que corresponden a la mayor recepción de leche por parte de las plantas lecheras, representado por el mayor número de animales que se encuentran en producción (ODEPA, 1995). Los predios fueron clasificados, según el número de animales en lactancia al momento de la toma de muestra, en tres grupos: estrato A (menos de 50 vacas) con 17 predios, estrato B (entre 50 y 100 vacas) 27 predios y estrato C (entre 100 y 150 vacas) con 16 predios. Se recolectaron 50 ml de leche en frascos de plástico estériles, previa agitación en el estanque de frío durante 10 minutos, y mantenidos en refrigeración a 4° C por 24 horas.

Para la prueba del Ring Test, el antígeno utilizado se obtuvo desde el Instituto de Microbiología de la Universidad Austral de Chile. Para la realización de la prueba fueron extraídos del frío, tanto las muestras como el antígeno, hasta alcanzar la temperatura ambiental. Se depositó 1 ml de leche en un tubo Khan y se agregaron 33 µl de antígeno mezclado por inversión varias veces e incubado a 37° Celsius durante 1 h. Las muestras fueron leídas, clasificándose como positivas, positivas débiles y negativas como lo descrito en MacMillan (1990). Para la prueba de ELISA se realizó como lo descrito por el fabricante del kit Chekit® Brucellotest de Hoescht que utiliza microplacas previamente sensibilizadas con el antígeno inactivado, monofásico de B. abortus. Se depositaron 200 µl de las muestras de leche en cada uno de los pocillos de la microplaca por duplicado. Como controles positivos y negativos se utilizaron los proporcionados por el kit, 200 µl y diluidos 1:2 y fueron incubados por 90 minutos a temperatura ambiente en cámara húmeda. Luego de la fase de lavado, se depositaron 200 µl de conjugado monoclonal Anti-IgG peroxidasa bovino diluido 1:200 en cada uno de los pocillos e incubado por 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente del segundo lavado, se agregaron 200 µl del cromógeno proporcionado por el kit. Los resultados fueron leídos en un espectrofotómetro a 405 nm (Dynatech®). Las Densidades Opticas (DO) de las muestras problemas en duplicado fueron promediadas y corregidas por sustracción de la DO del control negativo, estas fueron divididas por las DO de los controles positivos por 100. Se consideraron muestras positivas sobre 100%, positivas débiles o dudosas, entre 70% y 100% y negativas, bajo 70%.

RESULTADOS Y DISCUSION

Del total de predios en estudio, 28.33% corresponden al estrato A (menos de 50 vacas en lactancia), 45% al estrato B (entre 50 y 100 vacas) y 26.67% al estrato C (entre 100 y 150 vacas). Existe un número de animales que no fue muestreado en cada predio, ya que no se encontraban en período de lactancia al momento del estudio. Este sería un inconveniente que presentarían estas pruebas diagnósticas de "screening", ya que excluyen animales en estado avanzado de gestación (período seco), vaquillas preñadas, terneras y machos (Nicoletti, 1994). Por ello, se recomienda su uso a intervalos de tiempo permitiendo, por una parte, un diagnóstico seguro, y por otro lado, un mejor control del curso de la infección en el ganado. Los predios en este estudio se encontraban en programas de erradicación de brucelosis bovina, utilizando la vacunación de terneras con Cepa 19 entre los 3 y 8 meses de edad. La vacunación de ganado adulto con Cepa 19 en dosis reducida no fue realizada en ninguno de los rebaños en estudio, descartando así la posibilidad de encontrar anticuerpos de origen vacinal en la leche, los cuales podrían ser los responsables de algunas de las reacciones positivas, ya que estos anticuerpos originados en respuesta a esta modalidad de vacunación permanecen altos al menos durante un año, interfiriendo en el diagnóstico ya sea en suero sanguíneo o leche (Nicoletti, 1990).

Tabla 1. Diagnóstico de brucelosis bovina por Ring Test y ELISA en leche según número de vacas en lactancia. Bovine brucellosis diagnosis in milk by Ring Test and ELISA according to number of milk production cows.

Los resultados obtenidos por el RT y ELISA en los distintos estratos lecheros son presentados en la tabla 1. Se observa que el mayor número de reacciones positivas se encuentra en aquellos predios que poseen entre 50 y 100 vacas en lactancia (estrato B); esto puede ser atribuido al mayor número de muestras que corresponden a este estrato y que fueron utilizadas en el estudio (45%). Se midieron los resultados obtenidos por ambas técnicas de diagnóstico mediante la comparación de proporciones. La concordancia entre las técnicas ELISA y RT, en la detección de la infección por Brucella abortus (tabla 2), se puede apreciar un completo acuerdo en las 60 muestras, correspondiendo a 18 muestras positivas y 42 muestras negativas para ambos métodos. La diferencia entre ambos métodos se estableció en los diagnósticos de muestras positivas débiles por el RT (n=5, 8.3%), siendo confirmadas positivas por el método de ELISA, apareciendo este último como un excelente método para detectar anticuerpos contra Brucella abortus en leche bovina. Boraker y col. (1981) obtuvieron leches negativas al RT y positivas al ELISA (contrastando con los resultados obtenidos en este estudio), atribuyendo una mayor especificidad a este último. Por otro lado, todas las muestras clasificadas como positivas por el RT lo fueron también al ELISA. Kerkhofs y col. (1989, 1990), en un estudio sobre un total de 1.200 predios lecheros en Francia, obtuvieron una sensibilidad de un 22% mayor para el ELISA en relación a los resultados entregados por el RT, atribuyendo una mayor capacidad diagnóstica al primero. Por otro lado, Díaz y Blasco (1994) mencionan como factores determinantes en un Ring Test positivo, al nivel de excreción de anticuerpos en la leche y a la cantidad de grasa de ésta, entre otros factores. El ELISA no depende de factores propios de la leche, sino que directamente con el nivel de anticuerpos que ella presente. Esto le otorga mayor capacidad propia para desarrollar sus diagnósticos. Además la lectura de los resultados no es realizada a simple vista por un operario, sino por un lector automático, lo que podría influir en la interpretación final de la reacción.

Para obtener una visión acerca del nivel de infección por Brucella abortus en los predios lecheros de la provincia de Ñuble que enfrían su leche, es que se determinó la prevalencia predial de la enfermedad usando los resultados de ambas técnicas diagnósticas (tabla 2). El resultado fue de 30% para ambos métodos. Cabe señalar que el resultado obtenido aquí estaría por sobre la realidad regional manejada por el S.A.G. que alcanzaría a un 22% de prevalencia predial (Vera, 1996). Esto indicaría que la enfermedad se encuentra presente aún en muchos rebaños, ocasionando pérdidas a los productores, siendo necesaria la implementación de nuevas medidas destinadas al control de esta importante enfermedad zoonótica. Adicionalmente, las prevalencias para cada estrato lechero usando los resultados del RT y del ELISA (tabla 3) resultaron en un 29.4%, 25.9% y un 37.5% para los estratos A, B y C, respectivamente.

Los porcentajes de positividad por estrato muestran al estrato C (entre 100 y 150 vacas en lactancia) como aquel que alcanza el mayor porcentaje de predios positivos para ambos métodos. En estos predios, el manejo preventivo para el control de la brucelosis bovina se complica, ya que se requiere de infraestructura necesaria como maternidades que permitan el cambio de cama o bien la desinfección del piso, pudiendo eliminar alguna posible contaminación con Brucella abortus luego del parto (Nicoletti, 1994).

Tabla 2. Concordancia entre los métodos ELISA y Ring Test en el diagnóstico de la brucelosis bovina en leche. Concordance between ELISA and Ring Test methods in bovine brucellosis diagnosis in milk.

Tabla 3. Prevalencia de brucelosis bovina según número de vacas en lactancia determinado por Ring Test y ELISA en leche. Prevalence of bovine brucellosis according to number of milk producing cows determined by ELISA and Ring Test in milk.

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