Patrón Cry insecticida y patogenicidad de cepas nativas de Bacillus thuringiensis hacia larvas de Heliothis virescens y Drosophila melanogaster

1. Resumen
3. Materiales y Métodos
4. Resultados y Discusión
5. Conclusiones
6. Referencias Bibliográficas

Resumen

Bacillus thuringiensis (Bt) es el organismo entomopatógeno más utilizado para el control de insectos plaga. A las proteínas del cristal paraesporal, característica distintiva de esta especie, se les denomina Cry y se encuentran altamente relacionadas entre sí.

En este trabajo 16 cepas de Bt fueron caracterizadas por el patrón Cry insecticida mediante geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE). La mayoría de las cepas analizadas presentaron dos bandas proteicas que migraron a la misma altura que las proteínas Cry1 y Cry2 de la cepa estándar HD-1; dos cepas tuvieron un patrón idéntico al de Bt var. israelensis y dos presentaron una proteína de muy bajo peso molecular.

Los bioensayos contra larvas de Heliothis virescens evidenciaron un control sobre el insecto pero fue solamente la cepa LBT-111 quien logró una mayor mortalidad en el menor tiempo y a la menor concentración. El análisis Probit de esta cepa dió como resultado que la CL50 fue de 2.3 x 107esporas / ml al segundo día de montado el ensayo.

Los resultados obtenidos frente a Drosophila melanogaster mostraron como la cepa LBT-87 provocó no solo una mortalidad de las larvas en más de un 50 %, sino que las que lograron sobrevivir y formar pupas nunca llegaron a la fase de adulto.

Introducción

Bacillus thuringiensis es una bacteria ampliamente conocida por su actividad insecticida hacia diversos grupos de insectos. Simultáneamente a la esporulación, forma un cuerpo paraesporal a partir de proteínas denominadas Cry, las cuales, una vez solubilizadas y activadas proteolíticamente en el insecto, ejercen su efecto insecticida. Los productos bioinsecticidas a base de Bt se formulan para controlar plagas agrícolas del orden Lepidoptera y algunas pocas especies de la familia Chrysomelidae (Coleoptera), además de plagas de importancia médica del orden Diptera (Glare y O’ Callaghan, 2001; Bullé, 2002).

En el país, esta bacteria se ha utilizado en el control de Heliothis virescens (Jiménez, 1995) insecto que causa graves daños en el tabaco, cultivo que constituye un importante rubro económico de reconocido prestigio internacional. Una de las características de esta plaga es que puede crear resistencia hacia los insecticidas de Bacillus thuringiensis (Granero et al, 1996), por lo que es conveniente contar con alternativas de cepas ante problemas de insecto resistencia.

En 1977 fue descubierta una nueva serovariedad de esta bacteria que tenía efecto larvicida sobre especies de mosquitos y moscas negras, a la cual le llamaron subespecie israelensis (Goldber y Margalit., 1977). De acuerdo a numerosos estudios y reportes esta variedad ha resultado muy activa contra larvas de mosquitos (72 especies) y moscas negras (22 especies) (Maldonado-Blanco, 2005) resultando efectiva contra dípteros vectores de enfermedades humanas (malaria, dengue, fiebre amarilla, filariasis) (Nester et al., 2002).

Basados en la posibilidad de encontrar microorganismos mejor adaptados al trópico que los microorganismos foráneos y con un amplio espectro de acción, se planteó como objetivo del presente trabajo, el de evaluar y seleccionar cepas nativas de Bacillus thuringiensis que presenten actividad insecticida contra los insectos Heliothis virescens, que es uno de los más importantes defoliadores del cultivo del tabaco, y la "mosca de la fruta", Drosophila melanogaster, insecto extremadamente prolífero y contaminante.

Materiales y Métodos

I. Material Biológico: 16 cepas de Bacillus thuringiensis pertenecientes a la colección del laboratorio de bacterias entomopatógenas del INISAV.

Cepas estándar de Bacillus thuringiensis: HD-1 y Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti).

Tabla 1. Cepas de Bt pertenecientes a la colección del laboratorio de bacterias entomopatógenas del INISAV.

II. Determinación del patrón de proteínas Cry por electroforesis en geles de poliacrilamida con duodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).

Para la reproducción de las cepas se utilizaron frascos erlenmeyers de 500ml con 50ml de medio LB, (Luria Bertani), a los que se les añadió un disco de papel de filtro impregnado de células de la cepa en estudio. Los cultivos fueron agitados en una zaranda orbital hasta esporulación total. La presencia del cristal (proteína Cry) se determinó cualitativamente por observación al Microscopio Óptico 1000 X con objetivo de inmersión, mediante tinción simple con violeta cristal 0.5 %.

Para la determinación de proteínas Cry se tomó un volumen de 1.5ml de un cultivo completamente cristalífero y se centrifugó a 10 000 r.min-1 durante cinco minutos en centrífuga Eppendorf 5415C, el pellet fue lavado dos veces con 1mL de NaCL 1M y tres veces con 1ml de agua destilada esterilizada (Bravo et al., 1998), y finalmente resuspendido en 100μl de agua destilada y buffer de lisis 2X, la muestra fue calentada durante seis minutos a 100° C, se tomaron 15μl de la muestra para realizar la SDS-PAGE 10%.

La electroforesis analítica de proteínas se realizó en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes, según el procedimiento descrito por Laemmli (1970).

III Determinación de la actividad biológica frente a Heliothis virescens.

Obtención y cría de larvas de Heliothis virescens.

Se partió de colectas de larvas en campos cultivados de tabaco, libres de productos químicos y biológicos y llevadas al laboratorio de Biología del INISAV donde se estableció la cría de los insectos según metodología descrita por Piedra, 1980.