Patrón Cry insecticida y patogenicidad de cepas nativas de Bacillus thuringiensis hacia larvas de Heliothis virescens y Drosophila melanogaster (página 2)

Bioensayos.

Se utilizaron 8 cepas de B. thuringiensis: LBT-101, LBT-102, LBT-103, LBT-104, LBT-105, LBT-107, LBT-108, LBT-111.

Las suspensiones de esporas y cristales se obtuvieron a partir del crecimiento obtenido en cuñas de agar nutriente. Para los bioensayos se utilizaron cuatro concentraciones (109, 108, 107, 106 esporas / ml) y larvas de Heliothis virescens del 2do instar.

Se hizo un análisis cualitativo en base al mayor porcentaje de mortalidad en el menor tiempo y a la menor concentración. La cepa seleccionada como promisoria, en base a este criterio, fue sometida a otro bioensayo para determinarle la CL50 mediante metodología Probit. En este caso, se usó además la concentración 105 esporas / ml.

Diez larvas fueron colocadas individualmente en placas de petri de 9 mm de diámetro, con hojas de tabaco asperjadas con cada una de las diferentes concentraciones.

Se utilizó un control negativo donde el alimento fue asperjado con agua destilada estéril. La mortalidad se evaluó cada 24 h durante 5 días consecutivos. Se realizaron tres réplicas.

Los insectos muertos fueron desinfectados con hipoclorito de sodio al 0.05%, macerados y la solución obtenida sembrada en placas con agar nutriente para observar la presencia de colonias con morfología típica de Bacillus thuringiensis.

Las colonias seleccionadas se tiñeron con solución de violeta cristal 0.5% y se observó al microscopio óptico 1000 X la presencia del complejo espora-cristal.

IV. Determinación de la actividad biológica frente a Drosophila melanogaster.

Se utilizaron las cepas LBT-62, LBT-63, LBT-87 y LBT-99.

El primer paso para el ensayo biológico se basó en obtener mosquitas de nuestra propia zona de trabajo, ya que son organismos que se encuentran por doquier, siempre que exista alguna materia azucarada en fermentación con la que alimentarse.

El método más sencillo, descrito por Guerrero, 2003 consistió en ofrecer un medio de puesta de huevos a las moscas salvajes, y con esto se dispuso de individuos adultos listos para elaborar nuestros cultivos caseros.

El medio de puesta más fácil de preparar consistió simplemente en tomar un poco de unos trozos de tomates bien maduros machacados. No fue necesario elaborar mucha cantidad, ya que el olor avinagrado que produjo la fermentación resultó un poderoso atrayente para estos insectos. Se cubrió el fondo de unas tarrinas plásticas con el alimento y se colocaron en un lugar cercano soleado durante 2 ó 3 días, hasta que multitud de estos insectos poblaron los alrededores del recipiente y comenzaron a depositar los huevos sobre la "pasta" de tomates maduros fermentados. Una vez que la "pasta" estaba poblada de larvas las retiramos para establecer la cría.

Los ensayos se realizaron empleando para ello 15-20 larvas por cepa a probar. Se realizaron 3 réplicas:

A una placa de petri con agar nutriente que tenía un cultivo totalmente esporulado y cristalífero se le colocaron 15-20 larvas, se sellaron con parafilm y se pusieron a 25°C.

Se realizó el mismo procedimiento con una placa de petri con agar nutriente sin cultivo, el que fue considerado como control negativo.

Las placas se observaron durante 10 días cada 24 horas para observar mortalidad de las larvas, formación de pupas y emergencia de adultos.

Resultados y Discusión

Determinación del patrón de proteínas Cry por electroforesis en geles de poliacrilamida con duodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE).

En las dieciséis cepas analizadas seis patrones proteicos fueron encontrados (fig. 1):

1) Proteínas de 130-140 kDa y 70 kDa como las referidas en la cepa estándar HD-1.

2) Proteínas de 27, 72, y 135 kDa como las referidas en la cepa estándar de B. thuringiensis var. israelensis (Bti).

3) Proteínas de aproximadamente 27 kDa

4) Proteínas de 130-140 kDa y 72 kDa.

5) Proteínas de 130-140 kDa.

6) Proteínas de 130-140 kDa, 75 kDa y 70

En la mayoría de las cepas se observaron dos bandas bien definidas que migraron a la misma distancia que el estándar Internacional de B. thuringiensis HD-1. Este estándar es un ejemplo de las cepas de B. thuringiensis que producen inclusiones que contienen mezclas de d – endotoxinas: 1 Cry1 (130-140 kDa) y 2 Cry2 (70 kDa) en el mismo cristal.

La toxina Cry1 es la más frecuentemente encontrada en las cepas de B. thuringiensis (Yamamoto y Powell, 1993). La mayor parte de estas proteínas se producen como protoxinas de 130-140 kDa. Aunque puede generalizarse que todas ellas son activas solo contra lepidópteros, existen excepciones, por ejemplo, Cry1Ab y Cry1Ac son tóxicas tanto para lepidópteros como para dípteros (Smith y Ellar, 1994). El caso mas extraño es la toxina Cry1Ba, para la cual se ha reportado actividad contra lepidópteros, coleópteros (Bradley et al., 1995) y áfidos (Aranda, 1996).

Dos de las cepas analizadas presentaron un patrón idéntico al del estándar internacional de B. thuringiensis var. israelensis, (Bti), cuya toxicidad se reporta para dípteros (de Barjac, 1990). El uso de esta bacteria como biolarvicida se considera una alternativa viable en el control del mosquito Aedes spp. y Anopheles spp. (Regis et al., 2000).

Proteínas de 27 kDa también fueron encontradas en dos cepas. Estas pudieran corresponder a las proteínas Cyt cuya actividad se reporta también hacia dípteros (Delécluse et al., 1996).

En la tabla 2 se resume el patrón Cry característico en cada una de las cepas analizadas.

Tabla 2. Patrón de proteínas Cry de las cepas de B. thuringiensis.

Sobre la base de estos resultados seleccionamos las cepas LBT-101, LBT-102, LBT-103, LBT-104, LBT-105, LBT-107, LBT-108, LBT-111 para ensayarlas contra Heliothis virescens y las cepas LBT-62, LBT-63, LBT-87 y LBT-99 contra Drosophila melanogaster.

Determinación de la actividad biológica frente a Heliothis virescens.

Resultados diferentes en cuanto al control de Heliothis virescens se obtuvieron a pesar de haberse ensayado cepas que coexisten en el mismo hábitat del insecto y que presentaron un patrón Cry típico de lepidóptero (HD-1). Solamente la cepa LBT-111 logró una mayor mortalidad en el menor tiempo y a la menor concentración (Fig 2). El análisis Probit de esta cepa, (figura 3), dio como resultado que la CL50 fue de 2.3 x 107 esporas/ml al segundo día de montado el ensayo.

Aunque, generalmente, los muestreos se realizan sobre los sustratos asociados a una plaga en concreto, algunas veces se encuentran aislados tóxicos frente a ella, pero en otros casos los resultados no son lo esperable (Bel et al., 1997).

Biopreparados nacionales a base de la cepa LBT-21 de Bacillus thuringiensis, obtenidos por fermentación, han brindado un buen control de las larvas de H. viresecens a los tres días de aplicados, lo que ha permitido reducir los gastos en divisas por concepto de importaciones (Jiménez, 1995).

Esta plaga es susceptible a mostrar resistencia a los biopreparados de esta bacteria por lo que la búsqueda de otras alternativas de cepas es muy importante. La cepa LBT-111 puede resultar una buena opción ya que al lograr altos niveles de mortalidad a los dos días de montado el bioensayo, permite que se reduzca el tiempo de alimentación de la larva sobre las hojas de tabaco y por consiguiente los daños a la cosecha.

Determinación de la actividad biológica frente a Drosophila melanogaster.

Los resultados obtenidos muestran como la cepa LBT-87 provocó no solo una mortalidad de las larvas en más de un 50 %, sino que las que lograron sobrevivir y formar pupas nunca llegaron a la fase de adulto, las cepas restantes solamente retrasaron un poco la formación de las pupas pero finalmente se produjo la emergencia de los adultos (tabla 3).

Esta cepa resultó tener un patrón por SDS-PAGE idéntico al de la cepa estándar Bti en la cual atribuyen la actividad mosquitocida al efecto aditivo de cada toxina y a la interacción sinérgica entre ellas (Chang et al., 1993). Sin embargo, la cepa LBT-63 de igual patrón no manifestó el mismo efecto sobre las larvas de la mosca.

En 1997, Bel et al. no encontraron relación alguna entre los patrones electroforéticos y la toxicidad exhibida en la mosca del cultivo del olivo (B. oleae), o sea, no siempre el patrón Cry les indicó la toxicidad de la cepa.

Las cepas LBT-62 y LBT-99 presentaron una proteína de muy bajo peso molecular y en el caso de Bacillus thuringiensis son consideradas las Cyt. Una de las características de las cepas mosquitocidas es la presencia de toxinas Cyt, pero hay reportes que ellas no son muy tóxicas por si solas sino que manifiestan su acción potenciando a las Cry (Ibarra et al., 2003), este hecho puede dar explicación a la carencia de efecto en el bioensayo.

Tabla 3. Actividad las cepas LBT-62, LBT-63, LBT-87 y LBT-99 frente a Drosophila melanogaster.

El hábitat de las cepas analizadas, en este caso, no guarda relación con el insecto, pero como vimos en el epígrafe anterior no siempre existe una estrecha relación entre las poblaciones de insectos que viven en un hábitat y las de B. thuringiensis albergadas en ellos, otro ejemplo que corrobora esto es que Iriarte et al., (2000), aislaron cepas de ambientes acuáticos con el objetivo de obtener aislados con toxicidad hacia dípteros encontrando que esta era 7 veces mas baja que la toxicidad que causaba la cepa estándar Bti.

Los resultados de estos dos últimos epígrafes indican que el patrón Cry insecticida obtenido por SDS-PAGE no es un criterio definitorio hacia la toxicidad de la cepa y que otras pruebas son necesarias como la determinación del gen cry específico (Martínez y Caballero, 2002; Arrieta et al., 2004).

Conclusiones

2. Seis patrones de proteínas del cristal fueron encontrados en las cepas analizadas. El patrón tipo HD-1 fue el más representativo.
3. Las cepas LBT-111 y LBT-87 resultaron las mas efectivas contra larvas de Heliothis virescens y Drosophila melanogaster, respectivamente.

Referencias Bibliográficas

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Bertha Carreras

Carreras, B.1; Rodríguez, D.1; Piedra, F.1

1. Instituto Investigaciones de Sanidad Vegetal, Área. Bioplaguicidas. Calle 110 No 514 entre 5taB y 5taF, Playa, Cuba.

2. Instituto Investigaciones de Sanidad Vegetal, Área. Biología. Calle 110 No 514 entre 5taB y 5taF, Playa, Cuba.

Autor para la correspondencia:

Carreras, Bertha