Contaminación de productos lácteos por Brucella spp y otras bacterias en el municipio Higuera, Nuevo León,. México

Enviado por syanez

Resumen

Brucella es una bacteria que causa fiebre Malta u ondulante, que se transmite de productos lácteos no pasteurizados en humanos. El propósito de este trabajo fue investigar la existencia de Brucella y otras bacterias en leche y sus derivados. Elaborados en el Municipio de Higueras, N. L., México, en la atmósfera y en el suelo de los lugares de confinamiento del ganado de la región.

Así se analizaron 176 muestras: 78 de productos lácteos de diferentes sitios y 38 de leche de vaca, 28 de leche de cabra, 8 de queso de vaca, 4 de de cabra, además 15 muestras del aire. Los resultados indican que solo de una muestra de leche de cabra se aisló Brucella abortus del biotipo 1, pero ninguna de las de leche fue positiva a la prueba del anillo. En bajo porcentaje se aisló: Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis y Staphylococcus aureus; en las 15 del suelo en el 100% se aisló Pseudomonas spp; en la leche, en el queso y en el aire se observó escaso crecimiento de hongo pero abundantes en el suelo. Es probable que las bacterias acompañantes y hongos en los lácteos inhibieron a Brucella y evitaron su detección.

Palabras clave: Fiebre de Malta, aborto, ganado, leche-derivados.

Introducción y Antecedentes

La brucelosis es una zoonosis común en países de América.1, 20 En el hombre la enfermedad causa problemas de salud y socioeconómicos, el riesgo de infección es mayor cuando la población humana,16,17 esta en estrecho contacto con el ganado enfermo, por deficiente pasteurización de productos lácteos, en queso fresco, así como por pobres hábitos sanitarios mataderos, carnicerías, y frigoríficos.3,4 En el hombre la brucelosis es llamada fiebre de Malta u ondulante, en los animales se denomina como enfermedad de Bang, o del aborto contagioso, en las especies de Brucella que infectan ganado bovino, al caprino, al porcino y al ovino, la evidencia más importante es que en animales gestantes les causa placentitis, con la consecuente muerte y la expulsión del feto en el último trimestre de la gestación.2,5

El género Brucella se aisló por David Bruce en 1887 del bazo de soldados británicos que murieron, en la Isla de Malta. La enfermedad la contrajeron al beber leche sin hervir de cabra. En Dinamarca Bang en 1897 aisló una Brucella que actualmente es conocida como B. abortus causante del aborto infeccioso. Traum en 1914 aisló B. suis de un cerdo infectado.6, 7

Carvajal en México en 1906, dio el primer reporte sobre fiebre Malta.8 Los clínicos mexicanos Carmona, Terrés y Valenzuela, creían que enfermos con prueba de widal negativa, con síntomas de fiebres prolongadas en realidad tenían brucelosis.9

En 1910 se importaron al país las primeras cabras "muncianas", fueron por el consumo popular de leche de cabra.3,4 En 1912 una epidemia de una enfermedad con síntomas de fiebre prolongada, interrumpida por períodos apiréticos, sudores profusos, supuso que fue fiebre de Malta, Placeres en 1920 reportó el aislamiento de una bacteria análoga a la de Bruce, pero hasta en 1922 en México, se demostró la existencia de la brucelosis. 1,6

El género Brucella es un cocobacilo o bastoncito mide de 0.5-0.7 micras, por 0.6-1.5 micras de longitud, sin cápsula, inmóvil, sin endospora, Gram Negativo, metabolismo heterotrófico oxidativo14. Crece en medios de cultivo enriquecidos, en 24-48 h forma colonias pequeñas convexas y lisas al principio translucidas, luego pardas.9 Brucella está adaptada a un hábitat intercelular, sus requerimientos nutritivos son complejos, se conocen tres especies patógenas: B. abortus, B. melitensis y B. suis.8

En el hombre la enfermedad no solo se transmite por alimentos, frecuentemente es por beber leche o derivados lácteos de animales infectados. 2 Cada especie de Brucella tiene un huésped de preferencia, pero todas infectan al hombre, las vías comunes de infección son: oral, mucosas y piel 19.

Reportes en los Estados Unidos de Norteamérica de brucelosis humana es bajo por ingestión de leche cruda, o de productos sin pasteurizar, provenientes de ganado infectado,10,11 o por trabajadores enfermos de rastros ganaderos y así como por veterinarios que al contacto con la carne y las placentas infectadas de vacas, cerdos, cabras y ovejas se contagian.12, 13

La inespecificidad de Brucella ocasiona que cerdos se infecten con B. melitensis, al igual que B. suis4. Vázquez, reportó que vías de infección en el hombre se dan por la ingestión de productos de origen animal como: el queso fresco, la leche cruda, de cabras infectadas con B. melitensis, o de leche de cabra mezclada con la de una vaca enferma por B. abortus ó B. suis. Este trabajo se apoya lo vital del control de la brucelosis en: bovinos, ovinos y caprinos en México.1, 4

Con métodos para detectar la infección por Brucella en animales como la prueba del anillo en leche que es rápida, sencilla, confiable, y de sensibilidad para determinar anticuerpos anti Brucella. 12, 15

Existen en países con elevada crianza de cabras, corderos, de porcinos en los cuales la brucelocis tienen una manifestación ganglionar, en donde el aborto no es tan frecuente como en otras especies animales.13

Otros investigadores3 encontraron un alto porcentaje de porcinos reactivos a los antígenos de brucelosis, pero no aislaron Brucella de las vísceras de esos animales, en parte por que en el caso de B. suis se localize en los ganglios submaxilares, lo que explica su dificultad para su aislamiento y la baja probabilidad de transmisión de la enfermedad al hombre.15,16

En una investigación sobre brucelosis en el Estado de Morelos, México encontró que de 219 animales analizados hubo una incidencia una incidencia de la enfermedad del 95.4%, y lo que indica la importancia de Brucella en la ganadería y su transmisión por vía digestiva, ya que atraviesa la mucosa gastrointestinal, o mediante el contacto directo por heridas por así por la conjuntiva también.3,18

Es probable que también lo haga por una vía nasal por vía respiratoria, existen reportes del aislamiento Brucella de la atmósfera de un rastro en donde sacrificaron animales enfermos.20 Los aerosoles, que contienen la bacteria son otra forma fácil de transmisión en animales de laboratorio.19

Existe información de un elevado número de personas que se contagiaron con el germen en el laboratorio. En una investigación sobre la epidemiología de la brucelosis caprina en el Perú, Zapatel y Málaga,20 señalaron que la enfermedad es un grave problema de salud pública, así recomendaron el empleo de técnicas estandarizadas en la elaboración de queso, así como prohibir la venta de queso fresco de rebaños reactivos a Brucilla. Mientras que Torre y Gojon18,19 analizaron la prevalencia de la brucelosis caprina en Tamaulipas, México reportaron un 39.4% de las hembras negativas, un 30.7% sospechosas y un 29.9% positivas.

Con base en lo anterior los objetivos de este trabajo fueron investigar la existencia de Brucella en leche, sus derivados, al igual que: en el aire, en el suelo de ganado bovino y caprino en confinamiento de de Higuera, N.L. México.

Materiales y Métodos

El municipio de Higuera, N. L. se ubica en el noroeste de la republica mexicana o, México tiene una área de 600 km2, altitud de 212 mnm, con clima extremoso, colinda al norte con los municipios del Estado de Nuevo León de Salinas Hidalgo, al sur con Marín, al este con Cerralvo y al oeste con Salinas Victoria, en el mismo estado. Sus habitantes se dedican a la ganadería, a la avicultura, y en menor escala a la agricultura.

Se realizó una encuesta domiciliaria para localizar los sitios de elaboración de quesos para autoconsumo y venta, de los lugares de consumo o venta de esos tipos de leche. Con esa información se analizaron 76 muestras: 78 de derivados lácteos; de 38 de leche de vaca; 28 de cabra; 8 de queso de vaca; 4 de cabra; además 15 de aire y 15 de suelo.

Las de leche y queso se colectaron en frascos de vidrio estériles de 1 L, se conservaron en hielo para su transporte al laboratorio para detección de Brucilla. Las de leche se dejaron reposar/12h a 6°C de la capa superior de donde se acumuló la grasa de la leche que se sembró en medios de cultivo específicos para Brucilla además se realizó la prueba del anillo. Las muestras de queso se sembraron directamente en los medios de cultivo selectivos para la bacteria.

Investigación de Brucella en leche.

1).- Prueba del anillo.

En este caso la leche formó a las 12 h después del reposo una capa superior, que se transfirió 1 mL en un tubo de ensaye, se adicionó 0.3 mL de antígeno de Brucella abortus cepa 1119-3 de Productora Nacional de Biológicos Veterinarios (Pronabive) y se incubó a 37.5 °C/ 30-60 minutos, la formación de un anillo azul en la parte superior de la leche, fue evidencia positiva.20

2).- Aislamiento de Brucella de los productos lácteos.

A partir de la crema de la leche que se separó durante su sedimentación, se transfirió 1 mL a dos series de frascos de vidrio uno con 50 mL de caldo nutritivo y otro con soya tripticasa (Bioxon) con polimixina B 6000 U.I., y bacitracina 2000 U.I. Además de suero de caballo: medio de cultivo No 1(g/L): extracto de carne 3.0, peptona de carne 5.0, NaCl 5.0, nistatina 10 mL (100,000 U/mL.), cristal violeta 1 mL (sol. 0.1%), suero glucosado * 50 mL, agua destilada 1000 mL, y el medio de cultivo No 2: (g/L) peptona de caseína 17.0, peptona de soya 3.0, NaCl 5.0, fosfato dipotasico 2.5, dextrosa 2.5, polimixina B 6000 U.I., bacitracina 2000 U.I., nistatina 10 mL. 100,000 U/mL, cristal violeta 1 mL. sol. 0.1%, suero inactivado *50 mL., agua destilada 1000 mL. Luego se transfirió 1 mL a frascos con los medios de cultivo 1 y 2; 25 mL del medio No 1 con de 1.5% de agar y 20 mL de medio No 2.

Los medios de cultivo 1 y 2 se prepararon en agua destilada, excepto los antibióticos: la nistatina (Lakside) que se agregó a los medios de cultivo, igual que los antibióticos y el suelo, se adicionaron por separado a temperatura no mayor de 45°C, los frascos de cultivo se incubaron á 35°C /10-15 días, otra serie se incubó en atmósfera de CO2 a temperatura ambiente, después del tiempo de incubación cada frasco se sembró por estría en placas de Petri con agar base,( g/L): infusión de músculo cardíaco 375.0; peptona de carne 10; NaCl 5.0; agar 15.0, agua destilada 1000 mL, se esterilizó a 121oC/15 cuando la temperatura del medio fue de 45-50 °C, por litro se agregó 50 mL de sangre de carnero desfibrinada y el medio No 2 con 1.5% de agar.

Las placas se incubaron á 35°C/48-72 h una serie en atmósfera de CO2 y la otra a temperatura ambiente, de las colonias sospechosas de Brucella, pequeñas, translúcidas y con bordes lisa, se realizó tinción al Gram, su morfología al microscópico, además de las pruebas bioquímicas por siembra en: agar triple azúcar y hierro (TSI), lisina hierro (LIA), SIM y urea.

Para la sensibilidad de los aislados a los colorantes: fucsina y tionina, se sembró una colonia sospechosa de Brucella en agar soya tripticasa, se colocaron sobre la estría los discos impregnados con soluciones de fucsina 1:200 y tionina 1:800. Las colonias diferentes de Brucella, según su morfología, se identificaron por pruebas bioquímicas con carbohidratos del tipo, Voges-Proskawer, la actividad sobre aminoácidos. Para ello colonias al microscopio fueron cocos Gram positivos, agrupados en pares y racimos, se les realizó la prueba coagulasa. Los aislados bioquímicamente similares a Brucella, se enviaron al Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales, Departamento de Brucelosis (ISET), para su confirmación y tipificación.

Investigación de Brucella en queso.

Las muestras de este producto lácteo, se desmenuzaron con una espátula metálica de acero inoxidable estéril, se transfirió 1 g a dos series de frascos de vidrio con 50 mL de medio de cultivo No 1 y 2, se transfirió 1 g a un frasco con 0.5 ml de medio y de 25 mL del medio No 2 y 1.5% de agar como fase sólida y 20 mL de medio No 2 como líquida, los frascos se incubaron a 35°C/10-15 días; igual para la leche, una serie se incubó en una atmósfera de CO2 y otra a temperatura ambiente, después de la incubación de cada frasco, se sembró por estría en placas Petri con sangre base al 5% con sangre de cordero desfibrinada y medio No 2 con 1.5% de agar, las placas se incubaron 35°C/48-72 h con y sin atmósfera de CO2., para la identificación de las colonias sospechosas de Brucella se procedió como en las muestras de leche.20

Investigación de Brucella en aire o atmósfera del rastro.

Para colectar las muestras de aire o atmósfera, se seleccionaron 5 sitios de confinación del ganado, estas se tomaron por burbujeo de 30 L/min de aire, directamente en un matraz con100 mL de medio No 2 con una bomba de aire con manómetro.

Los matraces se incubaron a 35°C/10-15 días; una serie se incubó en una atmósfera de CO2, la otra a temperatura ambiente, de cada matraz se sembró por estría en placas Petri con agar base sangre al 5% de sangre de cordero desfibrinada y con el medio No 2 y 1.5% de agar. Las placas se incubaron a 35° C /48-72 h en y sin atmósfera de CO2, para la identificación y tipificación de las colonias sospechosas de Brucella se procedió como para muestras de leche y queso.

Resultados

El cuadro 1 muestra los géneros de las bacterias aisladas de las 38 muestras de leche de vaca. En el 100% de la leche se aisló Pseudomonas ssp y en un menor porcentaje Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis y Staphylococcus aureus.

En el cuadro 2 se presenta en el caso de la leche de cabra se aislaron: Pseudomonas ssp, P.mirabilis y S. aureus, de una muestra de leche se recuperó Brucella, tipificada en el Laboratorio de Brucelosis del Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales. La cepa se clasificó como Brucella abortus biotipos 1.20

Ninguna de las muestras de leche fue positiva a la prueba del anillo.

A partir de los 8 quesos de vaca se aislaron: Pseudomonas ssp. y E. aerogenes, así como en el caso de las 4 de cabra como se indica en los cuadros 3 y 4. En la leche y queso se observó escaso crecimiento de hongos mientras del suelo, se aisló Pseudomonas ssp y Escherichia coli, y P. mirabilis, etc, como lo muestra el cuadro 5. Mientras en el aire el género bacteriano más abundante fue Pseudomonas ssp, según indica el cuadro 6, ésta bacteria se aisló en el 100% de la leche y sus productos.

El mínimo de aislamiento de Brucella, se supone que fue por causa de Pseudomonas spp que tiene un efecto antagónico sobre este género, por ello se realizó una prueba para demostrarlo. Se sembró con asa bacteriológica el aislado de B. Abortus en la superficie de una placa de Petri con agar soya tripticasa con algunos de los aislados de Pseudomonas de diversas fuentes de esta investigación, las placas se incubaron a 35° C durante 24 -48 horas con y sin atmósfera de CO2.

En los resultados se observó que todos los aislados de Pseudomonas inhibieron el crecimiento de Brucella.

Cuadro 1. Bacterias aisladas de 38 muestras de leche de vaca procedentes del municipio de Higueras, N.L. México.

Género bacteriano	Muestras con bacterias*	Porcentaje
Brucella spp.	0	0
Pseudomonas spp.	38	100
Proteus mirabilis	6	15.79
Enterobacter aerogenes	10	26.3
E. hafniae	3	7.89
E. agglomerans	2	5.26
Escherichia coli	3	7.89
Klebsiella spp.	2	5.26
Staphylococcus aureus	6	15.79

* promedio de cuatro repeticiones.

Cuadro 2. Bacterias aisladas a partir de las 28 muestras de leche de cabra procedentes del municipio de Higueras, N.L. México.

Género bacteriano	Muestras con bacterias*	Porcentaje
Brucella spp.	1	3.57
Pseudomonas spp.	28	100
Proteus mirabilis	7	25
Enterobacter aerogenes	4	14.28
E. hafniae	1	3.57
E. agglomerans	1	3.57
Escherichia coli	4	14.28
Klebsiella spp.	4	14.28
Staphylococcus aureus	5	17.58