Escaladura foliar de la caña de azúcar en Cuba: Caracterización, diversidad y diagnóstico molecular de su agente causal (página 2)

Para demostrar esta hipótesis, se trazaron los siguientes objetivos de trabajo:

1. Caracterizar los aislamientos de X. albilineans circulantes en los focos de escaldadura existentes en el país y compararlos desde el punto de vista morfológico, bioquímico, serológico y molecular con los obtenidos previamente a partir de infecciones latentes de la enfermedad. 2. Determinar la diversidad serológica y genómica de las poblaciones cubanas de X. albilineans y las variantes de la bacteria presentes en el país. 3. Desarrollar y validar métodos moleculares para el diagnóstico de la enfermedad. 4. Aplicar los métodos de diagnóstico desarrollados para la detección de la enfermedad en variedades comerciales y clones del Banco de Germoplasma cubano.

II. MATERIALES Y METODOS II.1 Descripción de síntomas y obtención de aislamientos A partir de la aparición de los síntomas de la enfermedad en Febrero de 1998 en el Banco de Germomplasma de la EPICA de Jovellanos ( Matanzas ) se realizaron muestreos, en los cuales se seleccionaron al azar muestras representativas de diferentes variedades, con síntomas típicos o dudosos y asintomáticas. De cada variedad se tomaron muestras de dos plantones. Posteriormente con la colaboración del Departamento Fitosanitario del MINAZ, los fitosanitarios de cada provincia y Cuarentena Vegetal, se recibieron muestras de diferentes EPICAs y CAIs de las provincias de Pinar del Río, La Habana, Camagüey, Ciego de Ávila, Las Tunas y Holguín. Fueron analizadas muestras de 56 variedades procedentes de 16 localidades de estas 7 provincias del país.

Se realizaron aislamientos de macerados en solución salina ésteril de hojas y brotes laterales, así como de jugos de tallos extraídos por centrifugación y maceración, que se sembraron en medio Agar Wilbrink suplementado con ciclohexamida y extracto de levadura (Rott et al., 1988; Davis et al., 1994). Las placas fueron incubadas a 28oC hasta los diez días y las colonias con características típicas de X.albilineas fueron seleccionadas; se les realizó la tinción de Gram y se comprobó su crecimiento negativo en medio Agar Nutriente. Después de dos pases sucesivos de una colonia y comprobada su pureza, los aislamientos fueron conservados de acuerdo a lo descrito por Moore et al, 1988 y Rott et al., 1996.

II.2 Identificación de los aislamientos de X. albilineans mediante PCR anidada (n-PCR)

La identificación de los aislamientos obtenidos de diferentes clones y variedades durante el brote actual de la enfermedad (Tabla 1), se realizó mediante la amplificación específica de fragmentos de ADN del complejo de genes albicidina por PCR anidada (n-PCR) (Davis et al., 1997). Se incluyeron además, aislamientos realizados a partir de vitroplantas asintomáticas obtenidas en las biofábricas del país en el período 1994-1997 (L1-L3) (Martín et al., 2000); 16 cepas de referencias procedentes de diferentes colecciones internacionales (R1-R16) y 7 aislamientos de otras especies bacterianas patógenas a caña de azúcar (S1-S7) (Tabla 2). La extracción de ADN se realizó de acuerdo con el método descrito por Ausubel et al., (1992). Los productos de amplificación fueron separados por electroforesis a 80 V en solución 0.5X TBE (45 mM Tris, 45mM de ácido bórico y 1mM EDTA) en gel de agarosa 1.5% conteniendo bromuro de etidio (0.5 µg/ml de gel). La talla de los fragmentos obtenidos, 440 y 308 pb para ambas amplificaciones, fue comparada con el marcador de 100 pb (Promega).

II.3 Patogenicidad en maíz A partir de estas pruebas iniciales de identidad, se evaluaron 20 aislamientos representativos de diferentes variedades y localidades del país, así como uno de la fase de latencia de la enfermedad (Martín et al., 2000). En las Tablas 1 y 2 aparecen señalados los aislamientos utilizados. Se realizaron inoculaciones en plantas de maíz híbrido T-66 de 10 días de germinadas, utilizando suspensiones bacterianas a una concentración de 105 ufc /ml (Rivera et al., 1985). El control fue inoculado con agua destilada estéril. La constatación de los síntomas fue realizada diariamente hasta los 30 días post- inoculación. Se realizó el reaislamiento del patógeno y se comprobó su identidad mediante n-PCR (Davis et al., 1997). II.4 Caracterización y diversidad de los aislamientos de X.albilineans A partir de las pruebas iniciales de identidad y patogenicidad, se realizó la caracterización morfológica, bioquímica y fisiológica, empleando los mismos aislamientos cubanos descritos en el epígrafe anterior y las cepas de referencia R1, R2, R3, R4, R16. Para la caracterización serológica y molecular, se realizó el análisis y comparación de los aislamientos y cepas de referencias descritos en las Tablas 1y 2. En la caracterización molecular se incluyeron además, ocho aislamientos brasileños (B1- B8), cedidos gentilmente por el Dr. Eder Giglioti de la UFSCar, Brasil.

II.4.1 Caracterización y diversidad morfológica Se realizaron preparaciones para microscopía electrónica de trasnmisión por tinción negativa (Sigee, 1990) con el objetivo de detectar el flagelo polar y determinar las dimensiones de las células bacterianas. Se midieron entre 65 y 189 células de los diferentes aislamientos a partir de las microfotografías electrónicas, se realizó un análisis de varianza con los datos obtenidos y se establecieron las diferencias significativas entre los distintos aislamientos (SAS, 1996). La descripción morfológica de las colonias se hizo sobre medio Agar Wilbrink.

II.4.2 Caracterización y diversidad bioquímica y fisiológica Se determinó la presencia del pigmento xanthomonadina de acuerdo a la metodología descrita por Maringoni et al., (1988) y se establecieron las propiedades bioquímicas más importantes para la determinación del género y especie de acuerdo a las metodologías descritas por Király et al., (1974); Romeiro, (1976); Klement et al., (1990) y Stead, (1990) y el Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey (Holt et al., 1994) ). II.4.3 Caracterización y diversidad serológica Para determinar la reacción serológica de los aislamientos, se produjeron anticuerpos frente a las cepas de referencia, R1, R2, R3, R5, R7, R10 y R12, así como para los aislamientos cubanos L2 y C9 (Tablas 1 y 2). El procedimiento para la preparación del inmunógeno y el esquema de inmunización empleado fue el descrito por Calzadilla et al., (1991).

La caracterización serológica se realizó mediante inmunodifusión doble en agar (IDD) según Ball, (1990) y UMELISA Indirecto (Peralta et al., 1997), enfrentando cada aislamiento a los diferentes antisueros producidos. Los ensayos, se realizaron con suspensiones bacterianas ajustadas a 108 ufc/ml en solución fosfato salina (PBS). Para la IDD el antígeno fue tratado a 100 oC durante una hora y se utilizó 1% de agarosa en solución salina. Los resultados obtenidos por UMELISA fueron procesados estadísticamente, estableciéndose las diferencias significativas entre los distintos antígenos y antisueros. Se realizó un análisis jerárquico de conglomerados (clusters). Los dendogramas se construyeron por el método de Ward (Carpeta estadística del CENSA). Se realizó adicionalmente un análisis de componentes principales. II.4.4 Caracterización y diversidad genotípica mediante rep-PCR Se determinaron los patrones de amplificación de las secuencias repetitivas dispersas en el genoma con el iniciador BOXA1R ( 5'- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG- 3') (Martin et al., 1992; Koeuth et al., 1995), y con los iniciadores ERIC1R (5'- ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3') y ERIC2 (5'- AAGTAAGTGACTGGGGTGACGG-3') (Kamoun y Kado, 1990; Hulton et al., 1991) y REP1R-I (5'- IIIICGICGICATCIGGC-3') y REP2-I (5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3') (Higgins et al., 1982; Gilson etal., 1984). Los iniciadores fueron sintetizados por la Operon Technologies Inc, California, E.U.

Las condiciones de amplificación utilizadas fueron establecidas a partir de las descritas por Versalovic et al., (1991 y 1994), de Bruijn, (1992), Louws et al., (1994); Lópes et al., (1998) y Rademaker et al., (1998). Alícuotas de 6 µl de los productos de amplificación fueron separados en gel de agarosa 1.5% en solución 0.5X TBE conteniendo bromuro de etidio (0.5 µg/ml de gel), por 8 a 10 horas a 2.5 V/cm. La talla de los fragmentos obtenidos fue comparado con el marcador de 100 pb (Promega). El gel fue fotografiado en el fotodocumentador Image Master VDS ( Pharmacia- Biotech) sobre luz ultravioleta. Para confirmar la reproducibilidad de los perfiles obtenidos, se realizó la amplificación de cada aislamiento a partir de dos extracciones de ADN diferentes. Los perfiles únicos, considerados como representantes de un haplotipo, fueron analizados conjuntamente a través del análisis visual de las bandas. A partir de la presencia o ausencia de una banda en cada posición se confeccionó la matriz de datos binarios (1 para presencia y 0 para ausencia). La matriz de coeficientes de similitud entre los aislamientos estudiados fue calculada utilizando la métrica de Jaccard's y el dendograma por el método de agrupamiento UPGMA (Paquete estadístico SPSS para Windows, versión 1.3, 1993). Se realizó el análisis de los haplotipos obtenidos con cada iniciador individualmente, así como el análisis combinado de los mismos. II.5 Desarrollo y validación del diagnóstico molecular de X. albilineans mediante PCR anidada (n- PCR) II.5.1 Establecimiento del límite de detección con diferentes tipos de muestras Para el montaje de la n-PCR se seleccionaron los iniciadores descritos por Davis et al., (1997), diseñados a partir de la secuencia de un fragmento de ADN del complejo de genes albicidina (Rott et al., 1996). Se estableció el límite de detección del ensayo a partir de suspensiones de ADN genómico (100 ng-10 fg); suspensiones bacterianas (10-1 a 10-10) en agua estéril y jugo extraído de plantas sanas;

difusato foliar y jugo extraído por centrifugación (10-1 a 10-5) de plantas con síntomas de la enfermedad (Pan et al., 1997; Davis, et al., 1994). En todos los casos se trabajó con los aislamientos C9 y B8 obtenidos de las variedades C120-78 y RB 955357. Se utilizó 1 µl de cada una de las diluciones para la reacción de n-PCR . Se determinaron las unidades formadoras de colonias (ufc) detectadas en la reacción de amplificación (Wang et al., 1999). Como controles negativos en cada ensayo fueron utilizados agua estéril, difusato foliar y jugo filtrado de las plantas sanas, así como suspensiones bacterianas y de ADN de X.axonopodis pv. vasculorum (S3). Adicionalmente, alícuotas de 100 µl de cada dilución preparada del jugo y el difusato foliar fueron tratadas por calor a 100oC durante 10 minutos en un baño de agua y mantenida a -20oC hasta su utilización (Wang et al., 1999). Las condiciones de amplificación y de análisis de los productos del n-PCR fueron las descritas en el epígrafe II.2. II.5.2. Evaluación de la utilización de aplicadores de algodón Teniendo en cuenta que uno de los mayores problemas para la utilización de técnicas avanzadas de diagnóstico es la toma y conservación de las muestras, se evaluó la factibilidad de utilizar aplicadores de algodón con este objetivo. II.5.2.1 Establecimiento de las condiciones óptimas de conservación y el límite de detección de la n-PCR utilizando los aplicadores de algodón Se utilizaron aplicadores de algodón comerciales que fueron embebidos en 50 µl de las diferentes muestras y diluciones anteriores, dejándolos secar durante una hora y conservándolos con posterioridad a temperatura ambiente, 4, 28 y -20oC. Se prepararon tres réplicas de cada muestra a las diferentes temperaturas y tiempos de conservación, evaluándose a los 15, 30 y 60 días de conservados. En todos los casos se utilizaron como controles muestras frescas de la suspensión bacteriana y jugos de plantas sanas y enfermas. Se determinó el porcentaje de eficacia de la detección a los diferentes temperaturas y tiempos de conservación, de acuerdo a lo establecido por Peralta y Villoch (1999).

II.5.2.2 Evaluación de diferentes variantes para la toma de la muestra Fueron colectadas plantas infectadas y sanas de diferentes variedades, cuyos tallos fueron lavados y separados los entrenudos. A partir de estos se obtuvieron 60 secciones internas del tallo, que fueron divididas en dos partes, una de las cuales fue utilizada para extraer el jugo con auxilio de un alicate y la otra para obtener el jugo por centrifugación. De cada una de las muestras fueron plaqueados 100 µl en Agar Wilbrink para el aislamiento de la bacteria y alícuotas de 50 µl se embebieron en los aplicadores de algodón, que fueron conservados a temperatura ambiente y evaluados a los 30 y 60 días. Se utilizaron como controles positivos ADN y muestras frescas de la suspensión bacteriana del aislamiento C9, así como jugo de tallo infectado extraído con alicate y por centrifugación. Como control negativo se utilizó el jugo de tallo de las planta sanas, así como ADN y/o suspensión bacteriana de X. axonopodis pv. vasculorum. En todos los casos las muestras fueron preparadas de acuerdo a los procedimientos descritos anteriormente (epígrafe II.5.1).

La comparación de las dos variantes de obtención de muestras se realizó sobre la base de los parámetros de desempeño del ensayo en cada caso. Los indicadores de validación estimados fueron los siguientes (Peralta y Villoch, 1999). II.5.2.3 Evaluación de los aplicadores de algodón para el diagnóstico múltiple de escaldadura foliar y el raquitismo de los retoños Teniendo en cuenta que la escaldadura foliar y el raquitismo de los retoños constituyen las dos enfermedades bacterianas más importantes de la caña de azúcar y la utilidad de abaratar los costos del diagnóstico mediante un ensayo capaz de detectarlas simultáneamente, se evaluó la efectividad de la detección de la n-PCR múltiple, utilizando los aplicadores de algodón para la toma y conservación de las muestras. A partir de variedades con síntomas de ambas variedades, se prepararon diluciones seriadas ( 10-1 a 10-4 ) en agua y por la mezcla en distintas proporciones de ambos jugos. Alícuotas de 50 µl de cada dilución y de jugo sin diluir fueron absorbidos en los aplicadores de algodón y se conservaron a temperatura ambiente y a -20oC. Se realizaron tres réplicas de cada dilución para ambas temperaturas, evaluándose 90 aplicadores (muestras) a los 30 y 60 días. La amplificación se realizó de acuerdo a lo descrito en el epígrafe II.2, con la adición de los iniciadores específicos para Leifsonia xyli subsp. xyli (Astua-Monge et al., 1996). Se determinaron los parámetros de desempeño del ensayo para la detección de ambas enfermedades, de acuerdo a lo descrito en el epígrafe anterior. III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN III.1 Descripción de síntomas y obtención de aislamientos En los muestreos e inspecciones realizadas a partir de 1994, no se observaron síntomas típicos de esta enfermedad, detectándose solamente infecciones latentes en variedades como la Ja60-5, RB 72454 y C 323-68 y esporádicamente la presencia de rayas blancas finas ("pencil lines"), fundamentalmente en clones del Banco de Germoplasma. Los síntomas típicos de la fase crónica de la enfermedad (Ricaud y Ryan, 1989; Rott et al., 1995) fueron observados a partir de febrero de 1998, caracterizandose por la presencia de rayas blancas o amarillentas paralelas a las nervaduras, de ancho variable, que se extendian hacia el borde de las hojas, provocando marchitamiento y necrosis foliar parcial o total. Adicionalmente se observó un notable desarrollo de brotes laterales desde la base de los tallos y un enrojecimiento en los vasos a nivel de los nudos e inclusive de los entrenudos. En algunas de las variedades afectadas, como la L55-5, los síntomas fueron severos, llegando a ocasionar la muerte de los tallos (Fig.1). Los síntomas más severos y generalizados del brote actual de escaldadura se presentaron en el Banco de Germoplasma de la EPICA de Jovellanos, donde fue encontrado el foco inicial de la enfermedad y en la provincia de Camagüey. Con posterioridad se han observado incrementos discretos de focos en áreas de otras provincias como Ciego de Ávila, La Habana y Pinar del Río. La sintomatología que se ha presentado a partir de 1998 ha sido más severa que la informada por Rivera et al., (1985) durante los años 1979-1982. A partir de los tallos, hojas y brotes de las

diferentes variedades analizadas se obtuvieron 62 aislamientos bacterianos, cuya descripción aparece en la Tabla 1. III.2 Identificación de los aislamientos de X.albilineans mediante PCR anidada (n-PCR) Los aislamientos cubanos obtenidos, fueron identificados como pertenecientes a la especie X.albilineans, de acuerdo a la amplificación específica obtenida de fragmentos de ADN del complejo de genes que codifican la síntesis de la albicidina (Fig. 2). El valor de este ensayo para la identificación del agente causal de la escaldadura foliar ha sido señalado por Rott et al., (1996), quienes demostraron que el complejo de genes involucrados en su síntesis es altamente específico para la especie, única conocida hasta el momento como productora de la mencionada toxina. Nuestros resultados confirman la especificidad de esta prueba y demuestran su utilidad como criterio de identificación molecular, de acuerdo a la tendencia actual debido a las limitaciones crecientes de las pruebas fenotípicas para la identificación de las especies bacterianas fitopatógenas (Henson y French, 1993; Vauterin et al., 1995; Takatsu, 2000).

III.3 Patogenicidad en maíz Las pruebas de patogenicidad realizadas en maíz permitieron la reproducción de los síntomas característicos de la enfermedad. En las evaluaciones visuales no se observaron diferencias en la respuesta provocada por cada aislamiento con respecto a las características de los síntomas y la agresividad con que se desarrollaron los mismos. Los primeros síntomas de líneas blancas finas se presentaron a los 5-7 días después de la inoculación, hasta llegar a tener los síntomas típicos de la enfermedad. En todos los casos fue posible realizar el reaislamiento del patógeno, cuya identidad fue confirmada mediante n-PCR (Davis et al., 1997). Los síntomas obtenidos, constituyen una comprobación de la patogenicidad de los aislamientos cubanos del brote actual. A pesar de no haberse detectado diferencias marcadas entre ellos, es necesario continuar profundizando en este aspecto, particularmente en el análisis de su interacción con diferentes variedades de caña de azúcar. Hasta el momento no ha podido establecerse sin equívoco la existencia de razas patogénicas en esta especie, pero sí de variantes serológicas y genómicas bien definidas. Es por ello que la tendencia actual en los grupos que estudian esta enfermedad es delimitar, como primer paso, las variantes fenotípicas y genotípicas existentes en la población del patógeno y con posterioridad evaluar la variación intraespecífica desde el punto de vista patogénico de los aislamientos representativos de los grupos o variantes establecidas (Clerc, 1997; Davis et al., 1997; Rott y Davis, 2000). Atendiendo a lo anterior, los resultados de este trabajo constituyen la base sobre la que podrían estructurarse las investigaciones futuras en cuanto a la escaldadura foliar en el país. III.4 Caracterización y diversidad de los aislamientos de X.albilineans III.4.1 Caracterización y diversidad morfológica

Las características morfológicas de los aislamientos realizados se corresponden a las descritas para esta especie (Ricaud y Ryan, 1989; Stanley y Williams, 1994). Las células son móviles con un único flagelo polar, bacilares y Gram negativas. Las dimensiones de las células de los diferentes aislamientos y cepas de referencia, fue de 0.39-0.83 x 1.28-1.84 µ, parámetros que coinciden con los descritos para este especie (Holt, 1994). Se encontró variabilidad tanto entre las cepas de referencia como entre los aislamientos cubanos, sin relación directa con su procedencia, propiedades bioquímicas, serológicas o su manifestación patogénica en el país. Los aislamientos procedentes de las variedades L55-5 (C1- C4) y C120-78 (C7- C10), se encontraron variaciones en la longitud media de las células y la morfología de las colonias en cultivo entre los aislamientos hechos a partir de hojas, brotes y tallos de una misma planta, e inclusive entre los aislamientos obtenidos de un mismo tallo. En medio Agar Wilbrink, las colonias se observaron a los 4-7 días después de la siembra, pequeñas, circulares, lisas, convexas, de bordes enteros, brillantes, translúcidas y de color amarillo pálido. No crecieron en medio Agar Nutriente, ni produjeron mucosidad al crecer sobre cuñas inclinadas de medio YDC. La información sobre variabilidad morfológica de esta especie y su correlación con las variaciones serológicas, moleculares y patogénicas de los aislamientos es muy limitada en el ámbito internacional.

III.4.1.2 Caracterización y diversidad bioquímica y fisiológica Las pruebas bioquímicas realizadas confirmaron la presencia de la especie X. albilineans, presentando coincidencia en general para los aislamientos obtenidos. Se observaron espectros de absorción típicos del pigmento xanthomonadina,, los cuales presentaron un pico máximo de absorbancia a 443, 7 nm, lo que se corresponde con lo descrito para el género Xanthomonas (Holt et al., 1994). Los resultados de la caracterización bioquímica se presentan en la Tabla 3. Se encontró una total coincidencia entre las propiedades bioquímicas en la población bacteriana estudiada, con la excepción producción de ácido a partir de fructosa y la utilización de la gelatina, destacándose en este sentido las cepas C4 y C10, que también mostraron diferencias morfológicas en sus colonias y células de mayor longitud. Estos resultados confirman lo señalado por otros autores (Yang et al., 1993; Vauterin et al., 1995), sobre la homogeneidad de las propiedades bioquímicas y fisiológicas de esta especie. III.4.3 Caracterización y diversidad serológica Los aislamientos realizados durante la fase latente de la enfermedad se diferencian de la mayoría de los circulantes actualmente. El análisis estadístico de los resultados obtenidos con diferentes antisueros y cepas cubanas y de referencia mediante la técnica UMELISA Indirecto, estableció la formación de tres grupos serológicamente bien diferenciados (Fig. 3). Las notables diferencias antigénicas de los aislamientos de la fase latente con respecto a los obtenidos a partir de los focos recientes de la enfermedad fueron claramente establecidas en los ensayos de inmunodifusión, mostrando patrones de precipitación de total identidad con las cepas de referencia R3 y R4. Los antisueros del aislado C9 y las cepas del serovar I, reaccionaron positivamente al enfrentarse

a sus antígenos homólogos y las cepas R1 y R2, pero no con los aislados latentes ni las cepas de referencia francesas. Resultados similares fueron obtenidos por UMELISA Indirecto (Fig. 4). Las evaluaciones realizadas han demostrado que la mayoría de los aislados bacterianos circulantes en los focos recientes de la enfermedad pertenecen al serovar I, no identificado con anterioridad en nuestro país. No obstante, se detectaron variaciones antigénicas entre los aislamientos del propio serovar. Adicionalmente, los aislados de la fase latente fueron identificados como serovar III. Los restantes aislamientos que mostraron diferencias antigénicas con los dos grupos anteriores, han presentado una reacción semejante con los antisueros de las cepas R7, R10 y R12, por lo que no es posible identificarlos hasta el momento dentro de alguno de los serovares conocidos. Es por ello que se hace necesario ampliar el estudio con nuevos antisueros producidos frente a un mayor número de cepas pertenecientes a estos serovares para lograr su identificación definitiva. Los resultados de este trabajo establecen por primera vez la presencia en Cuba de los serovares I y III y demuestran la diversidad antigénica de la población cubana de X. albilineans. Coincidentemente, la presencia de diferentes serovares ha sido registrada también en Guadalupe, Martinica y las Islas Saint Kitts (Daugrois, 1993; Rott et al., 1994). De los tres serovares identificados, el I (Mascarena), es el más representado en la mayoría de los aislamientos circulantes en el mundo actualmente, habiéndose demostrado la variabilidad dentro del propio serovar (Autrey et al., 1993; Rott et al., 1994; Alvarez et al., 1996). En nuestro trabajo se demuestra que éste constituye el serovar predominante entre los aislamientos del brote actual de escaldadura, lo que lo vincula directamente al resurgimiento de la enfermedad en el país. Los resultados obtenidos en este trabajo determinan la necesidad de introducir cambios en el sistema nacional de diagnóstico de la escaldadura foliar, con vistas a garantizar la adecuada detección de las variantes serológicas identificadas. Tales modificaciones incluyen la utilización de antisueros específicos para los serovares I y III. De acuerdo a las evaluaciones realizadas, los antisueros C9 y L2 son capaces de detectar la gama de aislamientos circulantes en la actualidad en el país y funcionan adecuadamente en el sistema UMELISA, establecido para la evaluación de los donantes y líneas del programa nacional de micropropagación de la caña de azúcar,y de los materiales sometidos a cuarentena. Estas modificaciones han sido convenientemente analizadas con los órganos científicos y productivos del MINAZ, habiéndose comenzado ya su implementación.

III.3.2 Caracterización y diversidad genotípica mediante rep-PCR En este trabajo, el patrón electroforético generado por la amplificación de las secuencias conservadas y repetitivas en el ADN genómico de X. albilineans resultó en múltiples bandas, con variación en el tamaño de aproximadamente 260 a 1700 pb con el iniciador BOX, 270 a 1800 pb con ERIC y 200 a 1200 pb para REP. Con los iniciadores REP fue posible la amplificación de un mayor número de fragmentos por aislamiento. La comparación de los patrones de amplificación, reveló la presencia de 12 haplotipos con los iniciadores ERIC (E1-E12), 19 con BOX (B1-B19) y 22 con REP (R1-R2), de los cuales B1-B7, E1-E5 y R1-R6 representan los aislamientos cubanos (Tabla 4).

Es de señalar que los iniciadores BOX y ERIC, agruparon en los haplotipos B2 y E2 al 75.8% y 62.9% de los aislamientos obtenidos en el brote actual y las cepas de referencia R7 y R8, representativas del haplotipo B-01 (PFGE) procedentes de Texas y la Florida. Por otra parte, en los haplotipos B1 y E1 están representados los aislamientos de la fase latente de la enfermedad y las cepas de referencia R3, R4 y R16 de Francia. Sin embargo el polimorfismo revelado por los iniciadores REP los agrupó en haplotipos diferentes, aunque con una homología superior al 90%. Las Figuras 5 muestran patrones de amplificación representativos de los diferentes haplotipos obtenidos con los iniciadores BOX y ERIC respectivamente. Las otras especies patógenas a caña de azúcar, mostraron patrones únicos y distintivos. El análisis de los haplotipos combinados resultó en la formación de 28 grupos genómicos (GG-1 a GG- 28) entre los aislamientos de X. albilineans estudiados, estando la población cubana representada por once de los mismos (GG-1 a GG- 11), diez de ellos correspondientes a los del brote actual (Tabla 4).

El 85.48% de estos aislamientos, representados en 7 de los grupos genómicos establecidos, presentaron una homología superior al 91% con las cepas de referencia de la Florida (R8) y la de Texas (R7), ambas representantes del haplotipo B-01 (PFGE) y responsables del explosivo resurgimiento de la escaldadura en esa región. El grupo GG-1 (cepas "latentes"), mostró una homología de 97% con el GG-17 que representa las de referencia procedente de Francia, los cuales a su vez presentaron la mayor homología (88%) con el haplotipo G-01. Por otra parte los grupos GG-3 y GG-6 se agruparon con el haplotipo B-06, con un 88 y 84% de homología respectivamente, mientras que el GG-10 presentó un 85% de similitud con el haplotipo E-01, ambos procedentes de Guadalupe (Fig.6). Los grupos más numerosos, heterogéneos y representados en las diferentes localidades fueron GG-2 y GG-4, presentes en cinco provincias, que agrupan el 62,9% de los aislamientos estudiados. Por el contrario los grupos GG-3, GG-5, GG-8, GG-9, GG-10 y GG-11 están representados en una sola provincia. Aunque se obtuvieron variantes genómicas entre los aislamientos del brote actual, se evidencia la predominancia de un mismo patrón, fundamentalmente entre los de la provincia de Matanzas, lugar donde surgió el primer brote de la enfermedad y en el que el 74.35% de los aislamientos está representado por los haplotipos B2 y E2, y el 84.6% por la suma de los haplotipos mayoritarios R2 y R4, con independencia de la variedad o clon del que se obtuvo el aislamiento. El patrón observado en estos aislamientos también está presente en los de otras provincias. Estos resultados indican que los grupos GG-2 y GG-4 han sido los responsables del resurgimiento de la enfermedad en el país. El hecho de encontrarlos representados en otras provincias, sugiere que se han diseminado rápidamente en nuestras condiciones a partir del foco inicial. La prevalencia de estos grupos dentro de la población cubana de X.albilineans, su alto nivel de homología con el haplotipo B-01 y la identificación de gran parte de los aislamientos que lo forman como serovar I, sugiere que el brote actual de escaldadura foliar en Cuba tiene un origen similar a los ocurridos recientemente en la Florida, Guadalupe, Louisiana y Texas. La mayor variabilidad genética en las diferentes provincias pudo apreciarse en Matanzas y la Habana, ambas con 6 grupos. Estos grupos pudieran estar vinculados a variantes presentes en el país y no detectadas con anterioridad o a múltiples introducciones del patógeno.

De igual forma se estableció la presencia de diferentes grupos genómicos en aislamientos de la misma variedad. Se destaca en este sentido que sólo en el caso de la C 88-382, aislamientos de diferentes localidades coincidieron genéticamente. Las mayores variaciones se encontraron en C120-78 y C323- 68, esta última incluyendo la cepa L3 de la fase latente. Aunque es necesario profundizar en este aspecto, llama la atención la presencia de los grupos genómicos 2 y 3 en las variedades L55-5 y C120- 78, que presentaron los síntomas más severos de la enfermedad en el foco inicial y también aislamientos con diferencias morfológicas y bioquímicas, aspectos que deben tenerse en cuenta para los futuros estudios de patogenicidad. III.5 Desarrollo y validación del diagnóstico molecular de X. albilineans mediante PCR anidada (n-PCR) III.5.1 Establecimiento del límite de detección con diferentes tipos de muestras La utilización de los iniciadores seleccionados, permitió la amplificación de los dos fragmentos específicos a X.albilineans (400 y 308 pb) a partir de las diferentes muestras analizadas. El límite de detección determinado a partir del ADN fue de 0.1pg, mientras en las suspensiones bacterianas puras fue de 1-2 ufc/reacción (2×103 ufc/ml). A partir de los difusatos foliares y jugos de tallos se obtuvo amplificación hasta la dilución 10-4, lo que representó concentraciones de 2-4 ufc/reacción (4x103ufc/ml). No se encontró amplificación con los controles negativos utilizados. A partir del difusato foliar y el jugo de caña, los mejores resultados fueron obtenidos con las muestras diluídas y tratadas con calor, tratamiento que probablemente destruye los inhibidores de la PCR (Prosen et al., 1993 Los resultados obtenidos, superan el límite de detección descrito por otros autores que utilizan la PCR clásica para el diagnóstico de esta especie, el cual ha sido de 5-10 ufc/reacción y 0.3pg de ADN (Honeycutt et al.,1995; Pan et al.,1997, 1998). La n-PCR evaluada en este trabajo, además de altamente específica para X.albilineans, resultó más sensible para el diagnóstico del patógeno que la BIO-PCR descrito anteriormente (,Wang et al., 1999), ventaja importante para el análisis de donantes de los procesos de micropropagación y la evaluación de variedades de interés sometidas a cuarentena post-entrada. III.5.2 Evaluación de la utilización de aplicadores de algodón. III.5.2.1 Establecimiento de las condiciones óptimas de conservación y el límite de detección de la n-PCR utilizando los aplicadores de algodón En la Fig. 7 se observan los productos de PCR (440 y 308 pb) obtenidos al analizar cada una de las muestras conservadas durante 60 días en los aplicadores de algodón a las diferentes temperaturas. Todas las muestras conservadas hasta los dos meses a las temperaturas evaluadas, resultaron positivas, para un 100% de eficacia. Se considera en este caso como definitivo el producto interno de la segunda amplificación, aspecto en el cual radican las ventajas de la n-PCR con relación al PCR clásico (Schadd et al.,(1995). Estos resultados establecen la factibilidad del uso de los aplicadores de algodón como forma de toma y conservación de los jugos de tallos para su análisis mediante n-PCR, sin afectar el diagnóstico de la enfermedad. El límite de detección obtenido en estos ensayos fue similar al señalado anteriormente

para la n-PCR a partir de la suspensión bacteriana y de las diluciones del jugo de plantas con síntomas típicos de la enfermedad. Los parámetros de desempeño determinados sobre la base de los resultados experimentales, muestran la potencialidad del uso de los aplicadores de algodón como una solución a las limitaciones de la toma, transporte y conservación de las muestras para el diagnóstico masivo de la enfermedad con grandes perspectivas de aplicación en los programas de mejoramiento genético y de producción de semilla certificada. Este método ha sido extensamente utilizado en medicina humana y veterinaria (Ushijima et al, 1994; Krepel et al, 1995; Marquard et al, 1995; Stone et al, 1995; Sykes et al,1998; Vitale et al,1998; Moss y Haas, 1999), pero no se refiere su uso para el diagnóstico fitosanitario, por lo que los resultados expuestos en este trabajo constituyen el primer informe sobre su utilización para el diagnóstico de fitopatógenos. III.5.2.2 Evaluación de diferentes variantes para la toma de la muestra La extracción de la muestra por centrifugación permitió obtener mejores resultados, con 95% de sensibilidad, 100% de especificidad y 97,5% de eficacia. La extracción por alicate disminuye la sensibilidad del ensayo hasta un 86,66%. Wang et al (1999) señalaron que los resultados de la n-PCR eran comparables a los del aislamiento in vitro. Nuestros resultados demuestran que ambas técnicas son igualmente eficaces para el diagnóstico de X. albilineans, con indicadores de validación superiores al 98% (100% de especificidad, 98,3% de sensibilidad y 99,16% de eficacia). Aunque estos disminuyen ligeramente al introducir la utilización de los aplicadores para la toma de la muestra, los parámetros de desempeño estimados demuestran que puede ser empleada para el diagnóstico con una elevada eficacia (100% de especificidad, 95% de sensibilidad y 9,5% de eficacia, Tabla 5). III.5.2.3 Evaluación de los aplicadores de algodón para el diagnóstico múltiple de escaldadura foliar y raquitismo de los retoños Se obtuvo la amplificación de los dos fragmentos que identifican a X.albilinenas y el de 229 pb específico para y L.xyli subsp.xyli, tanto en muestras infectadas por uno de los patógenos como en aquellas en que se mezclaron los jugos infectados de ambas (Fig.8). Al emplear aplicadores conservados a -20oC, los parámetros de desempeño del ensayo son superiores al 95%, con un 97.78% de eficacia para la detección de estas especies bacterianas. La conservación a temperatura ambiente de los aplicadores afecta particularmente la sensibilidad de la detección de L.xyli subsp.xyli. Aunque la validación de este procedimiento de detección simultánea es susceptible de ser mejorado con la evaluación de un mayor número de muestras, los resultados preliminares obtenidos en este trabajo, demuestran que es posible utilizarlo para detectar la presencia de ambos patógenos en muestras de tallos infectados conservadas en los aplicadores de algodón durante dos meses a -20º C con una elevada eficacia.

Es de señalar el interés práctico de este resultado que contribuye a reducir el tiempo y el costo del diagnóstico de las dos enfermedades bacterianas más importantes del cultivo en la actualidad.

IV. CONCLUSIONES • Se demostró que el brote actual de escaldadura en Cuba ha sido producido por nuevas variantes de la bacteria no detectadas con anterioridad en el país, determinándose que el 85.48% de los •

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• aislamientos obtenidos presentaron una homología superior al 91% con las cepas de referencia del grupo genómico B-01 (PFGE) de la Florida y Texas, identificados como los causantes del explosivo resurgimiento de la enfermedad en áreas de la región. Se demostró que los aislamientos cubanos procedentes de infecciones latentes difieren serológica y molecularmente de los involucrados en el resurgimiento de la enfermedad en 1998. Se determinaron variaciones entre los aislamientos cubanos con respecto a la producción de ácido a partir de fructosa, la utilización de la gelatina, la morfología de las colonias y la longitud de las células bacterianas, no encontrándose una correspondencia directa entre éstas y las características serológicas y moleculares de los aislamientos. Se estableció la presencia en el país de los serovares I y III de Xanthomonas albilineans. Los iniciadores BOX y ERIC, agruparon en los haplotipos B2 y E2 al 75.8% y 62.9% de los aislamientos obtenidos en el brote actual y las cepas de referencia R7 y R8, representativas del haplotipo B-01 (PFGE) procedentes de Texas y la Florida. Por otra parte. En los haplotipos B1 y E1 están representados los aislamientos de la fase latente de la enfermedad y las cepas de referencia R3, R4 y R16 de Francia Se identificaron once grupos genómicos entre los aislamientos cubanos de X. albilineans (GG1- GG11) que están formados por los haplotipos combinados BOX, ERIC y REP Los grupos genómicos GG2 y GG4 agruparon el 62.9% de los aislamientos estudiados y presentan la mayor distribución nacional, encontrándose en cinco provincias. En las variedades L55-5, C120-78, C323-68, C1051-73, Ja60-5, Ja64-19 y RB72454 se encontró la presencia de más de un grupo genómico de X. albilineans. Se demostró que el procedimiento de PCR anidada validado es igualmente eficaz que el aislamiento in vitro del patógeno y permite la detección de las diferentes variantes de X. albilineans presentes en el país con parámetros de desempeño superiores al 98%. Se registra por primera vez el uso de aplicadores de algodón para la toma y conservación de de muestras, demostrándose su utilidad para el diagnóstico de la escaldadura foliar con una elevada eficacia.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Akiba, F.(1978). Isolamento, inoculação e sobrevivência de Xanthomonas albilineans e avaliação da resistência à escaldura das folhas em cana-de-açúcar. ESALQ/USP. Piracicaba.95p. (Dissertação do Mestrado). Alvarez, A.M., Schenck, S., and Benedict, A.A.(1996).Differentiation of Xanthomonas albilineans strains with monoclonal antibody reaction patterns and DNA fingerprints. Plant Pathol.45:358- 366. Astua-Monge, G.(1995). Detection of Clavibacter xyli subsp.xyli, the causal agent of ratoon stunting disease of sugarcane, based on amplific of DNA in the ribosomal DNA spacer. Thesis presented to the requirements for the degree of Master of Science, University of Florida, 58 págs. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K.(1992). Current Protocols in Molecular Biology, Vol.I, Greene Publishing Associates and Wiley- Interscience, New York. Autrey, L.J.C.; Saumtally, S.; Dookun,A., and Médan, H.(1995).Studies on variation in the leaf scald pathogen, Xanthomonas albilineans. Proc. Int. Soc. Sugar Cane Technol. 21:485-497. Caffer, M.M., Giglioti, E.A. and Masuda, Y.(1999).Comparação de meios de cultura para detecção e quantificação de Xanthomonas albilineans e Xanthomonas Sp. em cana de açúcar. Fitopatologia Brasileira, 24 (Suplemento): 247, Agosto, 1999. Chen, C. T., Lin, C. P., and Liang, Y.G.(1993). Leaf scald of sugarcane in Taiwan. Taiwan sugar, 40:8-16. Clark, C.A., Chen, C., Ward-Rainey, N,and Pettis, G.S. (1998). Diversity within Streptomyces ipomoeae based on inhibitory interactions, rep-PCR, and plasmid profiles. Phytopathol., 88:1179-1186. Clerc, F.(1997). Diversité génétique des Xanthomonas pathogénes de la canne á sucre. Maîtrise em Bioingénieries. Titre d` Ingénieur- Maître.CIRAD. Montpellier. Comstock, J.C., and Irey, M.(1992). Detection of the sugarcane leaf scald pathogen, Xanthomonas albilineans, using tissue blot immunoassay, ELISA and isolation techniques. Plant Dis. 76:1033- 1035. Comstock, J.C., and Shine, J.M.(1992). Outbreak of leaf scald of sugarcane, caused by Xanthomonas albineans, in Florida. Plant Dis. 76:426. Comstock, J.C., Wang. Z.K., Hatziloukas, W., and Schaad, N.W. (1997). Comparison of isolation, serological and PCR techniques to detect the leaf scald pathogen, Xanthomonas albilineans. ISSCT Pathology and Molecular Biology Workshop, Abstracts, South Africa, May, 1997. Croft, B.J., Greet, A.D., Leaman, T.E.and Teakle, D.S.(1994). Evaporaive- binding enzyme linked immunoassay for diagnosis and varietal resistance screening of ratoon stuting disease in sugarcane. 4th ISSCT Pathology Workshop, Brisbane, Australia. Davis, M.J., Rott, P., and Astua-Monge, G.(1998). Nested, Multiplex PCR for detection of both Clavibacter xyli subsp. xyli and Xanthomonas albilineans in sugarcane. Abstracts 7th International Congress of Plant Pathology. Edinburgh, Scotland.No.3.3.4. Davis, M.J., Rott, P., Baudin, P., and Dean, J.L. (1994). Evaluation of selective media and immunoassays for detection of Xanthomonas albilineans, causal agent of sugarcane leaf scald disease. Plant Dis. 78:78-82. Davis,M.J., Rott, P., Warmuth, C.J., Chatenet, M., and Baudin, P. (1997). Intraspecific genomic variation within Xanthomonas albilineans, the sugarcane leaf scald pathogen. Phytopathol. 87: 316-324. de BRUIJN, F.J.(1992). Use of repetitive (repetitive extragenic palindromic and enterobacterial repetitive intergenic consensus) sequences and the polymerase chain reaction to fingerprint the

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ANEXOS

Tabla 1. Aislamientos de X. albilineans obtenidos durante la fase latente y el brote actual de la enfermedad a partir de variedades de caña de azúcar procedentes de diferentes localidades.

Leyenda: SS: SF: BL:

SIT: MuT: (1):

*: **: H: T: Br: Th: Cm: Sin síntomas. Síntomas foliares (presencia de rayas blancas de ancho variable; necrosis foliar). desarrollo de brotes laterales desde la base del tallo, con la presencia, por lo general, de rayas blancas finas en las hojas de los brotes. Síntomas internos de los tallos (haces vasculares de coloración roja). Muerte de tallos. Estas variedades presentaron síntomas típicos y fueron cortadas. Se muestrearon dos meses después del corte, sin síntomas visibles. Aislamientos utilizados para la caracterización morfológica, bioquímica y patogénica. Aislamientos recibidos del Laboratorio Central de cuarentena sin otras referencias. Hojas Tallos Brotes Tratamiento hidrotérmico Cultivo de meristemos

Tabla 2. Cepas de referencia de X. albilineans y otras especies utilizadas en los estudios de caracterización y diversidad.

Leyenda: IBC = Instituto Biológico de Campinas, Sao Paulo, Brasil; ESSC = Estación Experimental de Caña de Azúcar, Africa del Sur; CCBP= Colección CIRAD-CA de Bacterias Fitopatógenas, Montpellier, Francia; LAFIMEG= Laboratorio de Fitopatología Molecular e Ingeniería Genética, Araras, Brasil; BSES= Buró de Estaciones Experimentales de Caña de azúcar, Australia; LBV = Laboratorio de Bacteriología Vegetal, CENSA.

Figura 1. Principales síntomas observados en cañas enfermas con escaldadura foliar en la EPICA “Antonio Mesa” (variedades L 55-5, C 120- 78).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 440 pb 308 pb a

b

c

d Figura 2. Identificación de los aislamientos cubanos de X. albilineans mediante n-PCR a) 1-15 (R1-R15); 16-18 (L1-L3); 19-23 (C1-C5); b) 1-23 (C6-C28); c) 1-23 (C29-C51); d)1- 11 (C52-C62); 12-18 (S1-S7)

440 pb 308 pb a

b

c

d

Tabla 3. Resultados de la caracterización bioquímica de los aislamientos seleccionados

Leyenda: O: oxidativo +: reacción positiva -: reacción negativa (d): del 11 al 89% de los aislamientos son negativos para la especie

Figura 3. Dendograma que muestra el comportamiento de diferentes aislamientos cubanos frente al antisuero de la cepa R7 (AsR7). Se distingue la diferenciación de los aislamientos de la fase latente, poniéndose en evidencia además diferencias entre los aislamientos del brote actual en su reacción con este antisuero.

C3 C4 C5 C6 C7 C9 R3 R5 R7 C34 C38 C43 R9 L3 60

50

40

30

20

10

0 Valores de fluores- cencia Aislamientos AsR5 AsR7 AsR9 Figura 4. Variaciones intraespecíficas detectadas en aislamientos cubanos y cepas de referencia pertenecientes al serovar I mediante UMELISA Iindirecto. En la figura aparecen algunas de las cepas de referencia y aislamientos evaluados, en las que puede apreciarse un comportamiento diferente de los aislamientos y cepas de referencia con respecto a los distintos antisueros utilizados. C38, L3 y R3 no pertencen al serovar I.

Figura 5: Patrones característicos de los aislamientos cubanos de X. albilineans seleccionados (A: BOX; B: ERIC). De izquierda a derecha: • • •

• • A B Marcador 1Kb Aislamientos de referencia R1, R2, R3, R4 y R16 (Brasil, A. Sur y Francia) Aislamientos cubanos: L2, C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C34, C33, C47, C50, C41, C44, C45, C48, C55, C59 Marcador 1Kb X.c.pv. vasculorum (S3)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14151617181920 21222324 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14151617181920 21222324 2526272829 HB HB HB 2526272829 HB HB HB

Tabla 4. Grupos genómicos establecidos entre los aislamientos de X. albilineans mediante la utilización de los iniciadores BOX, ERIC y REP (rep-PCR).

PR (Pinar del Río), H (Habana), M(Matanzas), C(Camagüey), CA(Ciego de Ávila), T (Tunas)