Análisis del contenido aminoacídico de los alimentos con fines nutricionales (página 2)

4. Reactivos de derivatización.

El problema de la derivatización de aminoácidos está concentrado en la detección selectiva y sensible de los mismos. Las cantidades de muestra disponibles son muy pequeñas, ya sean proteínas cuya estructura vaya a ser determinada o muestras de investigaciones en el campo de la ciencia alimenticia, de modo que la reacción de derivatización debería permitir la detección en el rango del pmol. La derivatización puede ser llevada a cabo antes de la separación. Debería ocurrir cuantitativamente para producir productos sencillos para cada aminoácido, el reactivo no debería interferir. Es probable que la derivatización genere productos que son más parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la alta selectividad de separación de los sistemas cromatográficos implica que raramente haya problemas. La derivatización precolumna puede ser llevada a cabo automáticamente inmediatamente antes de la separación. La derivatización tras la separación requiere, en general, una complejidad instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser optimizados para alcanzar sensibilidad de detección más alta.

Ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los aminoácidos en medio ácido (pH entre 3 y 4) y en caliente produciendo amoniaco, dióxido de carbono y un complejo de color púrpura azulado. Todos los aminoácidos primarios forman el mismo complejo tras su reacción con ninhidrina, haciendo este agente inapropiado para la precolumna de derivatización. La mayoría de columnas de HPLC de intercambio catiónico utilizadas para el análisis de aminoácidos con postcolumna basada en la ninhidrina todavía emplean resinas de sulfonato de poliestireno/divinilbenceno. Los primeros sistemas automáticos para el análisis de aminoácidos descritos en 1958 basados en la separación de aminoácidos por cromatografía de intercambio catiónico y posterior reacción con ninhidrina, permanecen hoy día como la metodología más fiable para el análisis de aminoácidos en péptidos y proteínas. Analizadores comerciales basados en esa metodología están disponibles en compañías como Beckman y Pharmacia. A altas temperaturas (³ 100ºC), todos los aminoácidos primarios reaccionan con dos moléculas de ninhidrina para formar un cromóforo (púrpura de Ruthermann) con máxima absorción a 570 nm. En la cuantificación de los aminoácidos individuales puede utilizarse el coeficiente de absorción molar del compuesto coloreado, aunque su valor varía de un aminoácido a otro y debe determinarse para las condiciones particulares del análisis. Sin embargo, se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificación de los aminoácidos totales de una mezcla. La reacción coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analíticos, así como en la visualización de las bandas de los aminoácidos después de su separación por electroforesis o por cromatografía. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol; cuando se añade 2,4-6colidina, las diferencias de color entre cada mancha ayudan a la identificación de los distintos aminoácidos.

OFtaldehido (OPA). El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina en la postcolumna de derivatización y suministró un significante incremento en la sensibilidad. Los aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11), dando un compuesto fluorescente. La separación en fase reversa seguida de detección fluorescente constituye un método de detección rápido, sensible y selectivo para todos los aminoácidos con grupos amino primario. Los péptidos son menos reactivos que los -aminoácidos y las aminas secundarias no reaccionan. Aunque el OPA fue originalmente aplicado solamente para postcolumnas de derivatización ahora está ampliamente usado como un agente para precolumnas. Mientras que la separación de aminoácidos siguiente a una precolumna de derivatización está llevada a cabo por cromatografía de fase reversa, ambas, cromatografía de fase reversa y cromatografía de intercambio catiónico pueden ser utilizadas cuando el OPA es el agente de derivatización en la postcolumna.

Una desventaja del OPA reside en la relativa inestabilidad de sus derivados, quizás añadida a los problemas de cuantización, aunque ésto no es de gran dificultad en la técnica de derivatización en postcolumna. Sin embargo, en precolumna y desde el punto más bajo de pH 7’2 hasta un pH típico de reacción de 9’5, los productos deben ser inmediatamente aplicados a un sistema cromatográfico. Bajando estos dos pH se amortigua la reacción y sirve para estabilizar ligeramente los productos de reacción. La mayor desventaja del OPA es que no reacciona con aminas secundarias (prolina e hidroxiprolina) aunque ésto puede ser solventado con su oxidación por cloramina-T o hipoclorito. Una estratégica combinación del uso de OPA con FMOC (9-fluorenilmetil cloroformato) ha sido recientemente introducida para solucionar esta deficiencia.

El método con OPA se utiliza específicamente con precolumna de derivatización para el análisis de aminoácidos porque es más sensible y tarda menos tiempo que otros métodos HPLC.

Fluorescamina. La fluorescamina fue también introducida como una posible alternativa a la ninhidrina en postcolumnas de derivatización. Todas las aminas primarias reaccionan con la fluorescamina en medio básico (pH 9-11) dando un producto fluorescente con un incremento en sensibilidad de detección mayor que la ninhidrina, aunque la fluorescamina por si misma no tiene fluorescencia. El producto fluorescente es inestable en disolución acuosa y el reactivo debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan, a menos que se conviertan previamente en aminas primarias, lo que puede hacerse con N-clorosuccinimida, hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene interés por su rápida velocidad de reacción con los aminoácidos a temperatura ambiente, la reacción no es tan sensible como la de la ninhidrina.

Isotiocianato de fenilo (PITC). El PITC, también conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado para la secuenciación de polipéptidos y proteínas y fue introducido para el análisis de aminoácidos al principio de los años ochenta. Es actualmente, el agente más usado para precolumnas de derivatización, seguido de cromatografía en fase reversa, en análisis de aminoácidos, siendo empleado para mezclas de aminoácidos de una gran variedad de fuentes. En lugar de ser analizados como derivados de PTH (feniltiohidantoin), como ocurre durante la secuenciación de péptido o proteínas, los aminoácidos son analizados como derivados de PTC (feniltiocarbamol). Así, a pH alcalino, los aminoácidos primarios y secundarios producen derivados de PTC, que pueden ser registrados por absorbancia UV (240-255 nm) con un límite de detección en el rango de 5 a 50 pmol. Todos los aminoácidos forman derivados mono-PTC, excepto lisina y cisteína, que producen dobles formas PTC. Los productos son relativamente estables, aunque alguna conversión al derivado PTH puede ocurrir si el pH no se controla adecuadamente. Aunque la metodología PITC puede ser considerada superior al resto de las técnicas en un gran número de aspectos, tiene una mayor desventaja en que algunos derivados PTC de aminoácidos son fuertemente afectados por la presencia de algunas sales, cationes divalentes, metales e iones tampon. Así, mientras el acetato amónico, el cloruro sódico y el borato sódico se ha encontrado que no tienen efecto en aminoácidos PTC, otras sales, como el fosfato de sodio y el bicarbonato de sodio si que lo tienen. Además la contaminación por trazas de iones metálicos se ha encontrado que reduce la formación de aminoácidos PTC. Incluso añadiendo EDTA se han conseguido mejores rendimientos para la derivatización.

Cloruro de dansilo y cloruro de dabsilo. El cloruro de dansilo (cloruro de 1-dimetilaminonaftaleno-5-sulfonilo) fue inicialmente introducido para el análisis del nitrógeno terminal de los aminoácidos en péptidos y proteínas, un propósito para el cual todavía es empleado. Reacciona con aminas primarias y secundarias para producir derivados fluorescentes. Su aplicación adolece de la presencia de numerosos productos laterales y de la formación de múltiples derivados de ciertos aminoácidos. Además de ésto está el requerimiento de un largo tiempo de reacción. Así, aunque el cloruro de dansilo es frecuentemente empleado por lo investigadores para la derivatización en precolumna seguida de cromatografía en fase reversa, este método nunca ha sido ampliamente aceptado para el análisis automático de aminoácidos. El cloruro de dabsilo (cloruro de dimetilaminoazobencenosulfonilo) es un agente muy relacionado con el cloruro de dansilo. Fue introducido y desarrolla por Chang y sus colaboradores, para la detección de aminoácidos en el rango del visible y en el nivel del pmol. Reacciona con aminoácidos primarios y secundarios para producir derivados que tienen una gran absorbancia en el rango del visible. La reacción se realiza a unos 70ºC y un pH de 8 a 8’5, produciendo derivados altamente estables en 10 o 12 minutos. Se forman mono y bis-derivados de lisina, tirosina e histidina.

A pesar de las ventajas sobre el cloruro de dansilo como agente de derivatización, la técnica del cloruro de dabsilo tiene una tolerancia limitada a la presencia de sales, y aun no está clara cómo se vería afectada la detección a altos niveles de sensibilidad (rango del 10 al 20 pmol) por la presencia de metales, sales y otros contaminantes. Aunque no se usa ampliamente en análisis automáticos de aminoácidos como la ninhidrina, el OPA y el PITC, una adaptación comercial del método del cloruro de dabsilo está disponible en Beckman Instruments.

Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl). El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados altamente fluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente y todavía usado como grupo amino protector en síntesis de péptidos, fue primeramente aplicado como un agente derivatizante en precolumna para análisis de aminoácidos. El FMOC-Cl reacciona con todos los aminoácidos a pH alcalino y temperatura ambiente para producir derivados aminoacídicos altamente estables que tienen una fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- y bis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas de estos derivados varían en función del pH y de la proporción de reactivo y aminoácido. Durante la reacción con FMOC-Cl, los productos de hidrólisis del reactivo que se forman tienen fluorescencia parecida a la de los derivados aminoacídicos. Estos productos interfieren en la separación por cromatografía de fase reversa a menos que sean eliminados por el disolvente orgánico de extracción, antes de aplicar la muestra a la columna de cromatografía de fase reversa. Una versión automatizada de este procedimiento de derivatización ha sido desarrollada y comercializada. Betnér y Foldi solucionaron el problema de las interferencias por la elución de grandes picos de FMOC-Cl y sus productos de hidrólisis, FMOC-OH, que son eluídos en la misma región cromatográfica que muchos de los aminoácidos FMOC, por derivatización del volumen de exceso FMOC-Cl con una amina hidrofóbica. El derivado resultante es eluído más tarde en el cromatograma después de todos los aminoácidos FMOC. Una combinación entre OPA/FMOC ha sido descrita, la cual usa un analizador comercialmente disponible (Hewlett-Packard Amino Quant). La reacción de aminoácidos primarios es llevada a cabo inicialmente por OPA, seguida por la reacción de prolina e hidroxiprolina con FMOC. La determinación de la fluorescencia para los derivados de aminoácidos primarios OPA y FMOC-prolina es llevada a cabo entonces a longitudes de onda apropiadas.

7-cloro y 7-fluro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl y NBD-F). Reactivos de derivatización basados en la estructura del nitrobenzofurazan, NBD-Cl y NBD-F, tienen probada utilidad para aplicaciones específicas en el análisis de todos los aminoácidos. El NBD-Cl fue introducido por Ghosh y por Whitehouse como un agente fluorigénico para aminas, incluyendo aminoácidos y posteriormente Rot como una útil herramienta para el análisis de aminoácidos, particularmente por su realzada reactividad con aminas secundarias. Desde entonces, este reactivo ha tenido empleo ocasionalmente para la detección de aminoácidos, con particular énfasis en la detección de prolina e hidroxiprolina. NBD-Cl ha sido aplicado a la derivatización en pre- y post-columna, con un límite de detección en éstas últimas de 1 nmol para prolina e hidroxiprolina y un límite de detección en las primeras algo menor. Aunque NBD-Cl es estable y permite una detección sensible de aminoácidos, reacciona algo más despacio con aminas y no ha tenido un uso extendido como agente analítico general para aminoácidos.

NBD-F es más reactivo que su análogo de cloro, permitiendo una derivatización más rápida, acompañada de una gran fluorescencia para prolina e hidroxiprolina. De forma similar al NBD-Cl, el NBD-F ha sido aplicado tanto a derivatizaciones precolumna como postcolumna. Los límites de detección para la precolumna están definidos en el rango de 5-15 fmol para la mayoría de los aminoácidos. El NBD-F tampoco ha sido utilizado ampliamente como método analítico para aminoácidos, aunque algunos investigadores emplean este reactivo habitualmente.

Otros reactivos derivados del isotiocianato. El 4’-N,N-dimetilamino-4-azobencenoisotiocianato (DABITC) ha sido usado satisfactoriamente en la secuenciación manual y análisis de nitrógeno terminal de péptidos y proteínas. La degradación tipo Edman de péptidos y proteínas efectuada por este agente produce derivados tiohidantoin coloreados (DABTH), que pueden ser separados por cromatografía de fase reversa. El método de degradación generalmente comprende un doble acoplamiento, primero con DABITC y luego con PITC. La 4-N,N-dimetilnaftilazobenzeno homologa del DABITC (DANABITC) ha sido también aplicada con éxito, aunque en menor grado que el DABITC. Difenilindenonilisotiocianato (DIITC) ha sido estudiada para ser utilizada cuando la espectrometría de masas por ionización química es acoplada con identificaciones previas por cromatografía de fase reversa. La detección de derivados de tiohidantoin (DITH) se lleva a cabo por determinación UV (en el rango por debajo del pmol). La detección electroquímica es un utensilio alternativo. Otros reactivos isotiocianatos de derivatización precolumna son 4-(t-butiloxicarbonilaminometil)fenil isotiocianato (BAMPITC, detección fluorescente), trimetilsisil isotiocianato para análisis de secuencia de carbono terminal (detección UV) y p-N,N-dimetilaminofenil isotiocianato (DMAPI) como una instrumento electroquímico para el análisis de aminoácidos.

Reactivos mixtos.

Otros reactivos están siendo continuamente desarrollados y utilizados para detecciones de aminoácidos. Algunos tienen aplicaciones muy específicas y limitadas, mientras otros son tratados como posibles competidores para amplios usos en sistemas automáticos. Tales reactivos incluyen el ácido 2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) y su análogo 2,4-dinitrobenceno (DNBS), N,N-dietil-2,4-dinitro-5-fluoroanilina, fluoro-2,4-dinitrobenceno, ácido 1,1-difenilbórico y 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (reactivo de Marfey). La detección fluorescente es posible cuando se emplean reactivos tales como pentano-2,4-diona/formaldehido, 9-antrildiazometano, cloruro laril, 2,3-naftaleno-dicarboxialdehido, succinimida -naftilcarbamato, 3-benzoil-2quinolina-carboxaldehido, 9-hidroximetilantraceno e isotiocianato fluorescente y 1-naftil isocianato. Un reactivo quimioluminiscente, 4-isocianatoftalhidrazida, también ha sido investigado. Con excepción del pentano-2,4-diona/formaldehido, donde el reactivo fue usado en derivatización postcolumna seguida de intercambio iónico HPLC de aminoácidos, todos los demás fueron utilizados para la derivatización previa de cromatografía de fase reversa. En la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes características de los reactivos de derivatización más importantes para la determinación de aminoácidos:

Preparación de las muestras. La reacción con los derivatizantes forma el mismo cromóforo con las aminas primarias que con las secundarias, por tanto las muestras deben estar libres de sales y lípidos antes de que tengan lugar la hidrólisis y los pasos de derivatización. La mayor causa de los bajos rendimientos en las reacciones de derivatización es la presencia de contaminantes en la muestra, como son las sales no-volátiles, detergentes y lípidos. Las sales y los támpones interfieren tanto en la hidrólisis como en la posterior derivatización, distorsionan la cromatografía y añaden picos extra al cromatograma. Las sales pueden ser eliminadas de las proteínas y de los péptidos usando támpones volátiles y HPLC de fase reversa, precipitación, diálisis o columnas de filtración de gel.

5. Derivatización pre-columna frente a post-columna

Las opiniones de investigadores sobre los ventajas relativas de la derivatización antes o después del HPLC, de aminoácidos serán determinadas por los requerimientos de la aplicación específica. Factores como la sensibilidad requerida en la detección, cantidad de muestra disponible, tipo de muestra, fuente de muestra, velocidad de análisis y reproducibilidad e incluso consideraciones económicas influirán en la elección entre la derivatización pre- o post-columna de aminoácidos. Derivatización post-columna. La derivatización siguiendo a una cromatografía de intercambio catiónico de aminoácidos libres tiene distintas ventajas, con tal de que la instrumentación produzca velocidades y temperaturas de reacción reproducibles. Además, para la derivatización no es necesario proceder al completo, y los problemas de estabilidad del derivado son insignificantes. Otras ventajas son que la automatización es fácil y que el tiempo consumido y la pérdida a causa de la preparación de la muestra son innecesarias. También pueden ser usados detectores en serie. Una gran cantidad de experiencias han sido adquiridas del tradicional método de intercambio catiónico y tinción con ninhidrina, el cual ha resultado ser fiable, preciso y capaz de una separación excelente de mezclas complejas de aminoácidos y sus metabolitos.

Una desventaja con un sistema HPLC convencional es que son necesarios instrumentos más complejos que para el método de pre-columna. La derivatización post-columna requiere la adición de una o más bombas para los disolventes y reactivos derivatizantes. También se requiere la adición de un reactor post-columna, el cual llevará a un ensanchamiento de banda adicional, y por esto, un decrecimiento en la sensibilidad de detección. La columna de elución es continuamente diluida por el reactivo derivatizante, provocando un descenso en la sensibilidad de detección. Así, la máxima sensibilidad alcanzable por derivatización post-columna será menor que en el caso de la precolumna.

Derivatización pre-columna. Ésta, acoplada con cromatografía de fase reversa en lugar de con cromatografía de intercambio catiónico, fue originalmente introducida como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor velocidad de análisis. Las ventajas de la metodología de la derivatización pre-columna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere máxima sensibilidad de detección, un reactivo fluorescente combinado con la derivatización pre-columna es el método más indicado. Como desventaja está la necesidad de garantizarse la completa reacción del reactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separación por exceso de reactivo, el medio de reacción o la producción de diferentes derivados de un componente. Además, la estabilidad del derivado puede ser un importante factor durante la derivatización pre-columna, la demora entre la derivatización y la inyección llega a ser fundamental para los resultados obtenidos.

6. Bibliografía.

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Autor:

Óscar Burriel López Daniel Salavera Muñoz Víctor M. Gimeno Gil