Indice1. Introducción. 2. Métodos de análisis de aminoácidos en alimentos. 3. Técnicas de separación de aminoácidos 4. Reactivos de derivatización. 5. Derivatización pre-columna frente a post-columna 6. Bibliografía.
Los aminoácidos, péptidos y proteínas son componentes importantes de los alimentos. Por un lado proporcionan los elementos necesarios para la síntesis proteica. Por otro lado, los aminoácidos y péptidos contribuyen directamente al sabor de los alimentos y son precursores de los componentes aromáticos y las sustancias coloreadas que se forman mediante las reacciones térmicas y/o enzimáticas que ocurren durante la obtención, preparación y almacenamiento de los mismos. Aminoácido. Los aminoácidos son ácidos carboxílicos que contienen un grupo amino. Existen unos cien en la naturaleza. En el hidrolizado total de las proteínas existen veinte aminoácidos que tienen, con algunas excepciones, la fórmula general siguiente: R-CH-COOH NH2
En el caso más sencillo, el radical R es un átomo de Hidrógeno (ácido aminoacético o glicina), en los demás aminoácidos R es un resto alifático, aromático o heterocíclico, que puede ser portador de otros grupos funcionales. Existen diez aminoácidos, denominados aminoácidos esenciales, que el organismo es incapaz de sintetizar y que deben ser aportados por la alimentación. El organismo no los puede sintetizar porque carece del mecanismo necesario para elaborar los cetoácidos correspondientes; se ha comprobado que si se le suministran éstos y sales de amonio es capaz de elaborarlos. Los aminoácidos constituyentes de las proteínas son, aproximadamente, veinte: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Todos ellos son aminoácidos excepto dos, que son iminoácidos, la prolina y la hidroxiprolina, que también pueden considerarse como aminoácidos por su similitud estructural. Se les llama aminoácidos porque el grupo amino está unido al carbono de la cadena que es, por convenio, el átomo de carbono adyacente al grupo carboxilo. Los aminoácidos contienen tantos grupos ácidos como básicos, por lo que tienen propiedades ácidas y básicas débiles y se les llama anfolitos. Se comportan como anfipróticos porque pueden aceptar o donar electrones. Las moléculas de aminoácidos transportan una carga negativa y otra positiva, lo que da como resultado una carga total nula, esta forma se conoce como "zwitterion" del aminoácido. La carga total transportada por un aminoácido depende del pH de la solución y de los valores de la constante de acidez de los grupos ionizables presentes. Si el pH es mucho mayor que el valor de la constante de un grupo, se libera un protón y la molécula tendrá una carga negativa, pero si el pH es menor, tendrá carga positiva. El hecho de que a diferentes valores de pH el aminoácido tenga distintas formas y lleve distintas cargas netas se utiliza en muchos métodos analíticos, como en la electroforesis y en la cromatografía de intercambio iónico. El punto iso-iónico de una molécula es el pH en el que el número de cargas negativas debidas a los protones perdidos es igual al número de cargas positivas debidas a los protones ganados, entonces predomina la forma zwitteriónica. El punto isoeléctrico es el pH en el que las moléculas no presentan migración en un campo eléctrico y puede determinarse experimentalmente por electroforesis; en los aminoácidos es igual que el punto iso-iónico.
Un aspecto importante en el análisis de los aminoácidos es el hecho de que no se pueden detectar en el visible-UV. Existen varios reactivos que reaccionan con los aminoácidos dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, por tanto, pueden utilizarse para análisis cualitativos o cuantitativos. Esto es lo que se denomina derivatización de los aminoácidos. Los métodos fluorimétricos tienen muchas ventajas respecto a la espectrofotometría para el análisis de aminoácidos. Necesidades proteicas. Se requiere un criterio para fijar las necesidades o exigencias en proteínas para el ser humano. Por ello se establece una "proteína de referencia" o "patrón". Conocida la composición en aminoácidos de las proteínas de los distintos alimentos que se consumen y cuales han demostrado poseer mayor valor biológico, a saber: la de la leche, la del huevo y las de la carne; y teniendo en cuenta la composición cuali-cuantitativa en aminoácidos, se ha adoptado dicha "proteína de referencia" o "patrón".
En la calidad de las proteínas influye el contenido en aminoácidos esenciales, y es importante la presencia de "limitantes". En efecto, se llama así al aminoácido esencial que en una proteína dada se encuentra en cantidad relativa más baja con respecto a la proteína patrón porque limita el aprovechamiento de esa proteína a los fines biológicos. Es importante determinar el contenido en aminoácidos, en conjunto, para estimar el grado de proteólisis enzimática que ha sufrido el producto, así como la proporción de cada uno de ellos, como componentes de la proteína, cuando se desea establecer su valor biológico. La determinación de aminoácidos en alimentos permite extraer algunas conclusiones acerca de su composición; por ejemplo, la gelatina usada como espesante se diferencia rápida y sencillamente, de otros hidrocoloides (grasas vegetales, almidón, etc.), en función de su composición aminoacídica.
Objetivos. En primer lugar recogemos los distintos métodos oficiales y estándares para el análisis de aminoácidos en alimentos, encontrados en Métodos Oficiales de Análisis editados por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (1986) y en Methods of Analysis of AOAC (1995), así como algunos métodos recomendados. Posteriormente, en la discusión, tratamos sobre las distintas técnicas de separación (cromatográficas y electroforesis), del analizador automático de aminoácidos, de los distintos reactivos derivatizantes y el tipo de detección apropiada para cada uno, y las ventajas y desventajas de la derivatización, tanto antes (precolumna) como después (postcolumna) de la separación.
2. Métodos de análisis de aminoácidos en alimentos.
Métodos oficiales. Determinación de prolina en miel. Reacción de la prolina con ninhidrina en medio ácido y posterior determinación a 517 nm de la absorbancia del compuesto formado. Preparación de la muestra: Suponiendo que la miel ya ha sido separada del panel por escurrimiento a través de un filtro de luz de malla, optaremos por realizar el siguiente paso, la homogeneización. Reblandecer la muestra calentando entre 25-30ºC agitándola al mismo tiempo. Una vez homogeneizada se calienta a 50ºC al baño María hasta que se consiga la fusión y se deja enfriar rápidamente.
Determinación de hidroxiprolina en carnes. Previa hidrólisis en medio ácido de las proteínas y oxidación de la hidroxiprolina. El derivado formado con el p-dimetilaminobenzaldehido se valora colorimétricamente a 560 nm.. Preparación de la muestra: Primero, se quitan las diferentes capas protectoras del producto para poder tomar una muestra representativa. Se parten trozos de 0,5 – 1 cm y se cortan dichos trozos en pequeños cubos. Después se pasan por una trituradora varias veces hasta conseguir una mezcla homogénea. Se guarda en frascos limpios y secos para prevenir la pérdida de humedad. Se conserva en refrigeración de forma que evite su deterioro y cualquier cambio en su composición.
Métodos estándares. Determinación de prolina en miel. Determinación de hidroxiprolina en carnes. Determinación de aminoácidos en preparados vitamínicos. Determinación de lisina en suplementos nutricionales. Los grupos amino de las proteínas reaccionan con DNFB dando lugar a los derivados lisina-DNFB. Posteriormente se produce una hidrólisis ácida y la determinación en un analizador de aminoácidos de la lisina.
Determinación de triptófano en alimentos. La muestra es hidrolizada en medio básico, seguidamente se realiza un ajuste de pH. El triptófano es separado por cromatografía líquida de intercambio iónico y determinado por un detector UV a 280 nm.
Determinación de aminoácidos sulfurados en alimentos (metionina y cisteína). En primer lugar las proteínas son oxidadas con ácido perfórmico para conseguir ácido cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una hidrólisis ácida con HCl. Realizamos una cromatografía de intercambio iónico aplicándole un detector que sea capaz de medir a 570 nm.
Métodos recomendados. Análisis de aminoácidos por HPLC seguido del método del fenilisotiocianato. (Lab. Enzymology and Physical Chemistry of Proteins). A continuación, incluimos un protocolo típico del análisis de aminoácidos en harinas: – Dejar a reflujo la muestra con HCl 6N durante 24 horas. Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio. – Añadir agua y evaporar a sequedad. – Realizar el examen cromatográfico de una solución problema al 10% de la muestra tratada en solución – acuosa de isopropanol a 10%. – El sistema solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporción 12:3:5. – Soporte papel Whatman nº1. – Longitud del papel 50 cm. – Método cromatográfico descendente. – Duración: 12 horas. – Solución reveladora: solución acetónica de ninhidrina al 0.25%. – Condiciones de revelado: 20 min a 105ºC. – Comparación frente a muestras puras de clorhidratos de aminoácidos.
3. Técnicas de separación de aminoácidos.
A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individuales de una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de la estructura de las proteínas. El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes aminoácidos presentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisis cuantitativos es necesaria la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos.
Cromatografía en capa fina. Una importante aplicación de la cromatografía en capa fina es la de servir como guía para el desarrollo de las condiciones óptimas para realizar separaciones por cromatografía de líquidos en columna. Proporciona una idea rápida de los aminoácido mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la opinión de que los ensayos en capa fina deberían preceder siempre al uso de la columna En la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes volúmenes de muestra, lo que permite la elución posterior de un aminoácido en particular para su posterior purificación y análisis, factor que tiene gran importancia en la identificación de un constituyente desconocido de la muestra. Antes de la realizar la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como proteínas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación añadiendo a la columna un pequeño volumen de amoniaco y lavando después con agua destilada. La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se reparten de modo diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el eluyente que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa. La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debiéndose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad.
La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolución de los componentes ácidos, básicos o neutros. En general, aumentando la proporción de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de Rf e introduciendo pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composición química del disolvente puede también limitar el rango de reactivos de localización que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse con disolventes fenólicos. El poder de resolución de la cromatografía de capa fina puede aumentarse empleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separación cromatográfica de una dimensión (aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensión. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el reactivo de localización elegido. En la cromatografía de dos dimensiones, la composición de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse. Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran número de aminoácidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensión se separan en la segunda. Ésto es muy útil en la detección de los componentes que están en muy baja concentración y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentración alta cuando se utiliza la cromatografía en una dimensión.
Electroforesis. La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partículas coloidales) se separan en función de su distinta velocidad de migración en un campo eléctrico. Desde los años cincuenta, las separaciones electroforéticas fueron la piedra angular de gran parte de la investigación de químicos y biólogos moleculares relacionada con la separación y análisis de proteínas, polinucleótidos y otros biopolímeros. Estas separaciones han sido (y continúan siendo) muy eficientes y de una extensa aplicación, pero por desgracia, son unas técnicas muy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco reproducibles. A mediados de los ochenta, esta situación cambió espectacularmente con la aparición de aparatos comerciales para realizar electroforesis analíticas a microescala en columnas capilares (electroforesis capilar). El hecho de que los distintos aminoácidos transporten diferentes cargas netas a un pH particular, permite separarlos de una mezcla mediante la electroforesis de alto o bajo voltaje. Los medios utilizados más frecuentes como soporte son el papel o las placas de capa fina (celulosa o gel de sílice), pudiéndose utilizar para visualizar las manchas, los reactivos de localización que describiremos más adelante. Las separaciones se pueden realizar más fácilmente con alto que con bajo voltaje, siendo una de las principales ventajas de la primera, el que las sales y otras sustancias presentes en la muestra afectan en menor extensión la calidad del electroforetograma. A pesar de que se pueden conseguir separaciones electroforéticas con támpones a distintos pH, en la práctica los valores de pH escogidos están entre 2 y 5’3. A pH 2 todos los aminoácidos tienen carga positiva y los de tipo básico que tienen la mayor carga positiva migran más rápidamente hacia el cátodo, mientras, que a pH 5 los aminoácidos se dirigen hacia ambos electrodos, dependiendo de la carga transportada. Las separaciones a pH 5’3 se utilizan para determinar la naturaleza ácida o básica de un aminoácido desconocido.
Cromatografía de gases. Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que ofrece la cromatografía de gases, pero aunque se han realizado considerables progresos en el desarrollo de tales métodos, aún no se utiliza de forma rutinaria para el análisis de aminoácidos en muestras biológicas. La razón de ésto radica en el hecho de que los aminoácidos, aunque similares, son compuestos químicamente heterogéneos y además no son suficientemente volátiles a menos que se conviertan en algún derivado apropiado. Aparecen dificultades no sólo a la hora de elegir el método de obtención de tales derivados, sino también en la selección de una fase estacionaria que sea capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A lo hora de elegir el detector aparecen también problemas similares.
Analizador automático de aminoácidos – HPLC. Existen dos técnicas para la determinación de aminoácidos a través de cromatografía líquida: cromatografía de reparto en fase reversa y cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada. Las razones más importantes son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otros.
Cromatografía de reparto en fase reversa. La cromatografía en fase reversa consiste en un disolvente fundamentalmente polar como fase móvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las ventajas más sustanciales de esta alternativa son su gran reproducibilidad, tiempos de retención cortos, velocidad de muestreo alta, sistema cromatográfico simple y amplio campo de aplicación. Por todo ello, las aplicaciones son cada vez más numerosas. La selectividad se basa en las interacciones específicas entre el soluto y la fase móvil, ya sea de tipo polar, de formación de puentes de hidrógeno o mediante equilibrios secundarios provocados al variar la composición de la fase móvil (ácido-base, formación de complejos o pares iónicos, adición de complejos metal-ligando o reactivos quirales para separar los isómeros ópticos, etc.).
Cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y eficaces para la determinación de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio iónico. Existen métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidos y otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empezó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación por intercambio iónico se retraso debido a la inexistencia de un método general y sensible para la detección de especies como los cationes alcalinos y alcalinotérreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se remedió en 1975 al desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la técnica de supresión del efluente, la cual hace posible la detección conductimétrica de los iones eluídos. El analizador de aminoácidos, con el que se lleva a cabo la cuantización de los aminoácidos se basa en esta técnica.
Analizador automático de aminoácidos. La separación de aminoácidos fue el primer proceso cromatográfico automatizado con derivatización post-columna. La separación fue llevada a cabo por Moore, Spackman y Stein (1958), mediante un intercambio iónico, seguido de su cuantización de cada componente eluido de la columna por reacción con ninhidrina y posterior detección en el visible. Este método se ha realizado durante más de treinta años, en cualquier laboratorio de proteínas. El equipo usado actualmente se basa en el original pero introduciendo algunas modificaciones para conseguir un mejor grado de eficacia. Consiste en bombear tampones de pH o de fuerza iónica variables, a través de una columna termostatizada. Entre las novedades está la fabricación de resinas de alta calidad, desarrollo del HPLC, sistemas de automatización sofisticados y un aumento en la sensibilidad de los métodos de detección.
La separación tiene lugar en una columna de resina de poliestireno sulfonado. Inicialmente el pH de la fase móvil es bajo, por lo que los aminoácidos cargados positivamente se verán atraidos por los grupos sulfurosos ( SO3- ). Conforme se va aumentando el pH del támpon los aminoácidos se eluyen diferencialmente al disminuir su carga positiva y ser menos atraidos por el anión. A pH 3.5 los aminoácidos con un grupo ácido extra, de su cadena tendrán muy poca afinidad por la resina y serán los primeros en salir de la columna, mientras que los que tengan un grupo extra ionizable capaz de transportar una carga positiva (e.g. lisina, histidina) serán retenidos fuertemente por la resina y se eluirán sólo cuando el pH haya aumentado sustancialmente y se haya reducido su carga neta positiva. Además del pH también hay que considerar la concentración del tampón eluyente, pues influye en la elución de tal modo que cuando la concentración de ion aumenta en mismo, los aminoácidos se eluyen más rápidamente.
Las interacciones no iónicas entre los aminoácidos y la resina también influyen en la secuencia de elución, permitiendo que algunos aminoácidos que tienen un comportamiento similar se eluyan de forma separada. La resolución cuantitativa de mezclas de aminoácidos se consigue variando la composición del támpon, bien incrementando del pH y manteniendo constante la concentración, o viceversa, o incluso variando ambos. Hay otros factores menos significativos en la calidad de la separación como son la temperatura, la velocidad de flujo del tampón o el tipo de catión utilizado.
Aspectos prácticos del analizador: Columna: en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para separar los aminoácidos ácidos y neutros y otra para los básicos. Las de vidrio o acero inoxidable dan picos estrechos y altos, mejorando la separación de aminoácido similares. Solución tampón: suele ser citrato sódico o de litio, al que se le añade un detergente, un antioxidante y un conservante. Actualmente se utilizan dos disoluciones tampón, una ácida y otra básica. Se mezclan en proporciones variables para conseguir un aumento de pH. De esta forma se mejora la separación disminuyendo el tiempo de análisis y se eliminan las fluctuaciones bruscas de la linea base debidas a cambios repentinos en el tampón, como sucedia con anteriores técnicas. Temperatura: puede ser constante para evitar cambios en el pH y en la ionización de los aminoácidos, o bien puede utilizarse un programa de temperaturas que implica un cambio de ésta en diversos momentos del proceso. Flujo de la columna: se requiere un flujo de tampón constante para permitir la reproducibilidad. Se consigue por uso de bombas de presión o de desplazamiento constante. Detección: es necesaria una segunda bomba para el reactivo derivatizante (generalmente ninhidrina) que se ha de mezclar con el eluyente de la columna. Cuando la reacción ha tenido lugar, la corriente se controla en una célula de flujo de un colorímetro o un fluorímetro. Se mide la absorbancia continuamente a 570 y 440 nm. para detectar los amino e iminoácidos respectivamente. El análisis aminoacídico es un buen ejemplo del hecho de que raramente hay un único sistema de separación para problemas analíticos, sino que de la elección del sistema apropiado depende el problema analítico. Por ejemplo, de la matriz en la cual los aminoácidos van a ser determinados, de la sensibilidad deseada y en la velocidad requerida para el análisis. Los actuales métodos de detección para aminoácidos dependen de la reacción del grupo amino primario del aminoácido para formar un derivado coloreado o fluorescente, esta derivatización tiene lugar tanto antes como después de que la separación de los aminoácidos haya sido efectuada. La menor variedad de tipos de aminoácidos en comparación con las estructuras de los péptidos hace que los modos de HPLC disponibles para el investigador sean la cromatografía de intercambio catiónico (CEC), y la cromatografía de fase reversa (RPC). La cromatografía en fase reversa es más apropiada para la separación de derivados aminoacídicos que para aminoácidos libres. La elección de HPLC está limitada por la elección del agente de derivatización y/o la decisión de usar tanto pre- como post-columna de derivatización, de hecho, algunos de los más interesantes descubrimientos llevados a cabo en la separación de aminoácidos por HPLC reside en el desarrollo y optimización de nuevos agentes de derivatización. Reacciones muy rápidas como la derivatización con fluorescamina y ortoftaldehido (OPA) están siendo empleadas en aumento con el clásico método de la ninhidrina.
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