Técnicas de toma y preparación de la muestra. Homogenización y dilución. Método de Howard

Normas de seguridad en el laboratorio

• 1. El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén realizando las prácticas.

• 2. No se admiten visitas por razones de seguridad.

• 3. Los laboratorios de investigación son de acceso restringido al personal del Departamento.

• 4. Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se esté trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio.

• 5. Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningún objeto (bolígrafos…) o tocarse los ojos y nariz.

• 6. En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u objetos personales.

• 7. Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, así como de los microscopios que haya usado.

• 8. Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio.

• 9. Está prohibido pipetear con la boca.

• 10. Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo.

• 11. No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos.

• 12. No se manejarán los autoclaves o el material recién esterilizado si no se dispone de guantes apropiados.

• 13. La eliminación de residuos, material desechable y material reciclable se realizará siguiendo las instrucciones indicadas en el manual, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto.

• 14. Se deben lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de contaminación y siempre antes de marcharse del laboratorio.

Introducción

En esta unidad de trabajo se tratan de un conjunto de aspectos previos al análisis microbiológico en sí. Nos referimos a las técnicas de selección, toma y preparación de las muestras, así como a su transporte y conservación. La importancia de estas técnicas no debe ser subestimada, pues un defecto en cualquiera de ellas puede invalidar los resultados del análisis microbiológico.

Dentro del proceso analítico, la influencia del muestreo es la más crucial, ya que de nada sirve un análisis riguroso de la muestra, si esta no representa para nada al sistema que se quiere medir. Por ejemplo, es obvio que si se quiere analizar el contenido de un recipiente, se debe de agitar el mismo antes de tomar la muestra, ya que de no hacerlo, parte del contenido del mismo puede haber sedimentado. Si lo que se busca se encuentra sobre todo en esa fracción, el resultado del análisis, por preciso y exacto que fuera, informará sobre una cantidad muy inferior.

Además para el caso de la microbiología, se da la circunstancia de que es relativamente fácil que el proceso de muestreo contamine la muestra (si los recipientes, utensilios no son estériles) aportándole microorganismos que no estaban presentes. También puede ocurrir que el proceso de muestreo favorezca el crecimiento de un microorganismo frente a otros.

Por ejemplo, para realizar un recuento de bacterias en el agua corriente hay que dejar el grifo abierto durante un tiempo largo antes de tomar la muestra. Si se toma la muestra nada más abrir el grifo y este lleva varios días sin abrirse, el agua del último tramo de cañería llevará estancada allí el tiempo suficiente para que pueda haber habido crecimiento bacteriano. Por lo tanto, la muestra contendrá muchas más bacterias que el agua corriente de la red general y los resultados del análisis no serán ciertos para el agua corriente.

Muestreo

2.1. Definición de muestreo.

Cuando se pretende conocer el estado microbiológico de un sistema, como alimentos envasados en porciones individuales (botellas de leche, latas de conserva, tripas de embutidos, etc.), no envasados (como canales de carnes), sistemas naturales (como un río, un lago), etc. solo se puede analizar una pequeña parte del mismo. Esta fracción del sistema, que se denomina muestra, debe representar plenamente las propiedades a estudio del sistema. El muestreo consiste en tomar esa fracción del sistema, de manera que la muestra recogida sea representativa.

En el caso de alimentos envasados, el muestreo consiste en tomar un pequeño número de muestras de cada lote o remesa, elegidas de modo que estas muestras sean representativas del total. El muestreo se basa en la suposición de que todas las muestras del mismo lote son similares por haber sufrido un trato igual. Sin embargo, hay quetener presente que a veces una unidad estropeada puede escapar al muestreo, aunque esto sucede sólo en muy pocos casos. En el caso de alimentos no envasados, consistirá en tomar un porción de una manera aséptica y en el caso de aguas, tomar un volumen determinado, también de forma aséptica.

2.2. Condiciones que deben cumplirse en la toma de muestras.

Las condiciones que se deben cumplir para realizar una toma de muestras adecuada son:

• a. El operador debe poseer unos conocimientos microbiológicos generales y usar estos conocimientos aplicando el sentido común

• b. Se deben conocer las características físico-químicas y microbiológicas del material que se va a analizar.

• c. La muestra debe ser representativa del alimento que se analiza. Para ello es necesario realizar el muestreo con el procedimiento adecuado para cada caso.

• d. La cantidad de muestra tomada debe ser suficiente para realizar todo el proceso analítico. Es conveniente tomar al menos el doble de la cantidad mínima para tener una reserva de muestra en previsión de algún error que pueda obligar a repetir el análisis.

• e. Las operaciones de toma de muestra deben preservar la identidad de la misma. Esto significa que deben evitarse contaminaciones de la muestra, lo que obliga a trabajar con instrumentos y recipientes estériles. Si por descuido del operador se produce

• f. contaminación de una muestra con los resto de otra se dice que es una contaminación cruzada.

Técnicas de toma de muestra

3.1 Toma de muestras de alimentos envasados

Cuando se va a hacer un muestreo de alimentos envasados de modo individual, las muestras pueden ser elegidas de manera aleatoria para ser representativas. Esto se consigue con métodos tales como el empleo de la tabla de números al azar. Este método consiste en separar del lote un número de muestras calculado previamente, utilizando la tabla de números al azar. Dicha tabla está integrada por columnas y filas de dígitos obtenidos mediante cálculos estadísticos.

Una vez establecido el número de muestras que se deben tomar del lote, se numeran ordenadamente cada uno de los paquetes, contenedores o unidades del producto por muestrear. Si, por ejemplo, el lote está integrado por 200 unidades, su numeración se marcará del 1 al 200, correlativamente. Con un lápiz se señala un lugar cualquiera en la tabla de números al azar, coincidiendo con un dígito o su proximidad. Este dígito sirve de punto de partida para la separación del número de muestras destinadas al análisis.

Supongamos que se ha punteado con el lápiz un lugar que corresponde a la fila 15 y a la columna 10. Este número es el 1 y los que le siguen en las columnas 11 y 12 son el 4 y el 6. En este caso, la unidad que se tiene que separar del lote es la marcada con el número 146. A continuación se pasa a la fila 16 y a las mismas columnas 10, 11 y 12, a las que corresponde el número 078, una nueva unidad que se separa del lote. Pasando a la fila 17, columnas 10, 11 y 12, figura el número 152, que será también separado del lote. Se procede de la misma forma hasta obtener el número de muestras señalado previamente.

3.2 Toma de muestras de productos a granel sólidos

Cuando se trata de muestrear productos a granel, si se trata de sólidos lo que se hace es tomar varias muestras en partes diferentes del material sólido que estén alejadas entre sí. Deben tomarse muestras tanto con zonas aireadas del sólido como con material profundo. En los alimentos constituidos por componentes diferentes hay que asegurarse de que la proporción de cada componente en la muestra tomada es similar a la original.

3.3 Toma de muestras de productos a granel líquidos

En los productos a granel líquidos basta con mezclar bien y tomar una muestra del líquido bien homogeneizado. Si el producto por muestrear tiene salida por un conducto, se desechan las primeras porciones antes de tomar la muestra. Si la toma es de agua de un grifo, se desinfecta éste con alcohol. Luego se abre y se desecha el agua que sale en las primeras porciones. Se cierra de nuevo el grifo y se flamea la gota que queda pendiente hasta que emita vapores. A continuación se vuelve a abrir el grifo, dejando fluir el agua durante 1-2 minutos antes de recogerla en el recipiente estéril de la toma de muestras. Este será cerrado convenientemente en condiciones asépticas.

3.4 Toma de muestras de productos sólidos

Para productos sólidos (queso, jamón serrano o cocido, y similares) se tomarán las muestras en varias zonas con cuchillos, taladros, sierras, etc., estériles. Las muestras se introducirán, asépticamente, en recipientes estériles.

3.5 Toma de muestras de aguas

Las muestras serán recogidas en un recipiente estéril en un punto de muestreo representativo. Proceder como en 3.3.

3.6 Concepto de muestra única

En ocasiones, las muestras que se deben recoger son únicas, circunstancia frecuente cuando se trata de alimentos sospechosos de toxiinfección alimentaria. Las muestras únicas en muchos casos son irreemplazables y entonces hay que tratarlas con un cuidado especial porque su pérdida o deterioro puede suponer un problema serio.

3.6 Útiles empleados en la toma de muestras

En la toma de muestras de alimentos se utilizan útiles de diversos tipos:

• Frascos de boca ancha y bolsas de plástico estériles.

• Instrumentos esterilizados para abrir envases: tijeras, cuchillos, abrelatas, sondas, etc.

• Sacabocados estéril: para uso en alimentos sólidos.

• Etiquetas, rotuladores y bolígrafos.

• Líquido desinfectante: etanol 70°.

• Termómetro.

3.7. Identificación de las muestras.

Las muestras recién tomadas deben ser identificadas adecuadamente y de modo inmediato. En muestras de alimentos se anotará el tipo de muestra, la fecha, el número de lote, el lugar de procedencia y otros datos que puedan ser interesantes en cada caso: temperatura de almacenamiento del alimento, método de muestreo, precauciones para el transporte de la muestra, etc.. Estos datos se anotarán en etiquetas adhesivas que no puedan despegarse o rotuladas sobre el envase de modo que no pueda borrarse accidentalmente. Además, las anotaciones deben ser perfectamente legibles sin que haya posibilidad de confusión.

Transporte y conservación de las muestras

El adecuado transporte y conservación de las muestras se consigue cumpliendo una serie de requisitos:

• a. El espacio de tiempo transcurrido entre la toma de muestra y el comienzo del análisis en el laboratorio debe ser lo más corto posible.

• b. Toda muestra debe estar correctamente identificada.

• c. Deben seguirse todas las precauciones necesarias para preservar la representatividad de la muestra. Esto significa que:

• deben evitarse contaminaciones de las muestras durante su transporte y almacenamiento;

• deben evitarse sobrecrecimientos de microorganismos; esto es especialmente importante.

• en aquellas muestras destinadas a realizar recuentos de gérmenes (orina, agua, leche, etc.). La refrigeración es un método útil, pero sólo por tiempo limitado.

• d. Deben conocerse las características de la muestra para evitar su transporte y conservación inadecuados.

• e. Los envases utilizados y su manipulación deben evitar derrames que pueden llegar a ser muy peligrosos. Los recipientes deben, por tanto, ser herméticos y mecánicamente resistentes. Debe evitarse cuando sea posible el empleo de envases de vidrio.

Preparación de muestras para su análisis

5.1 Introducción

Hay muestras que pueden ser cultivadas o sometidas a pruebas de identificación tal y como se reciben en el laboratorio. Sin embargo, muchas otras deben ser preparadas (modificadas) antes del análisis microbiológico. Esto sucede cuando se presenta una de estas situaciones:

• a. La muestra es sólida o pastosa y se hace necesario licuarla.

• b. La muestra contiene una elevada carga de bacterias y hay que diluirla.

A continuación estudiaremos las técnicas utilizadas en cada una de estas situaciones, pero antes tenemos que advertir que en las operaciones de preparación de muestras hay que guardar todas las reglas de asepsia que permitan evitar la contaminación de la muestra.

5.2 Muestras sólidas o pastosas que es necesario licuar.

En el análisis microbiológico de alimentos sólidos o de elevada viscosidad es necesario transformar la muestra en una suspensión líquida que contenga los microorganismos repartidos de forma homogénea.

Esto se consigue agregando un volumen medido de diluyente estéril a una cantidad pesada de muestra sólida y utilizando después algún procedimiento de trituración y homogeneización.

Procedimiento.

1 Separación de la muestra analítica.

Llamamos muestra analítica a la porción de la muestra total (la cantidad llevada al laboratorio) que va a ser usada en el análisis. El resto de la muestra, utilizada como reserva, no es muestra analítica.

La cantidad de muestra analítica tomada para homogeneizarla debe ser suficientemente grande como para que sea representativa, como ya se mencionó antes. En algunas situaciones la cantidad de muestra a homogeneizar está establecida por la legislación sanitaria. Cuando el alimento está formado por distintos componentes (por ejemplo: una lata de cocido que contiene garbanzos, caldo y trozos de carne), la muestra analítica debe contener todos los componentes de la muestra completa y además mantener las mismas proporciones.

2 Pesada de la muestra.

Se hará en condiciones asépticas. Puede operarse de dos formas:

a) Se pesa la cantidad exacta de muestra y después se agrega un volumen previamente medido de diluyente.

b) Cuando resulta difícil pesar una cantidad exacta de muestra, se pesa una cantidad aproximada y después se mide el diluyente necesario en una probeta estéril.

3 Diluyente.

La principal característica que debe tener un diluyente es no producir modificaciones cualitativas ni cuantitativas en la flora de la muestra, es decir, debe mantener lo más fielmente posible la flora de la muestra sin suprimirla ni favorecer su desarrollo. En microbiología alimentaria se utilizan varios diluyentes.

Entre los más usados se encuentran:

• Agua de Triptona con NACL

• Disolución de Ringer 1/4

• Agua de Peptona Tamponada.

• Solución Reguladora de Fosfatos.

El mismo diluyente empleado en preparar la suspensión madre es el empleado en preparar la serie de diluciones decimales.

4. Homogeneización de la muestra.

En la homogenización hay que evitar la destrucción de los gérmenes por rotura de su membrana o por calentamiento excesivo. Además de la perfecta trituración de la muestra es necesario obtener una mezcla homogénea que tenga una distribución uniforme de los gérmenes y de sus toxinas. Hay varios tipos de homogenizadores y dentro de cada tipo puede haberlos de capacidades diversas:

• a. Homogeneizadores de jarra: consisten en un vaso de vidrio o acero con una hélice en su base que funciona cuando se acopla a un motor.

• b. Homogeneizadores de vástago con hélice: el vástago se introduce en un vaso con la mezcla que se va homogeneizar. Funciona como una batidora clásica de cocina.

Estos dos tipos de homogeneizadores tienen el inconveniente de que necesitan una limpieza exhaustiva y una esterilización antes de cada homogeneización. Esto supone un engorro. Otro inconveniente es que producen aerosoles que pueden contener microorganismos patógenos. Además, por el tipo de homogenización tan agresiva que realizan, pueden destruir los microorganismos que queremos estudiar. Los inconvenientes de estos homogeneizadores no están presentes en los:

• c. Homogeneizadores de paletas: la mezcla de muestra y diluyente se introduce en una bolsa de plástico estéril. Esta bolsa se sitúa en el homogenizador, que está provisto de paletas que golpean rítmicamente la bolsa. Esto dilacera (desmenuza) el alimento y pone los gérmenes en suspensión. Para homogeneizar una nueva muestra no hay que limpiar nada: se utiliza una nueva bolsa. Modelos comerciales conocidos son: Stomacher y Masticator.

En la homogeneización de alimentos sólidos es frecuente que la suspensión se prepare al 10 % peso/volumen. De este modo, la cantidad de alimento pesada expresada en gramos se multiplica por 9 y el número obtenido es el volumen en centímetros cúbicos de diluyente a agregar. A la suspensión obtenida se le llama suspensión madre, dilución 1/10 o dilución -1, porque: 1/10 = 10-1

Las muestras de alimentos líquidos no es necesario licuarlas, pero puede ser necesario homogeneizarlas.Esto puede conseguirse simplemente agitando bien el envase antes de abrirlo.

5.3. Muestras con una elevada carga bacteriana.

Las muestras con una carga bacteriana elevada no deben cultivarse directamente, pues las colonias de bacterias crecerían demasiado juntas. Es necesario entonces diluir la muestra. El procedimiento de dilución depende de los fines perseguidos.

Diluciones decimales seriadas.

Se hacen para realizar recuentos microbianos. Una serie de diluciones decimales suele prepararse así:

1. La muestra se homogeneiza al 10 % (p/v), obteniéndose la dilución -1.

2. A un tubo que contenga 9 cc de diluyente estéril se le agrega 1 cc de la dilución -1. Tras mezclar muy bien se obtiene la dilución -2 (1/100).

3. Puede obtenerse la dilución -3 agregando 1 cc de la dilución -2 a un tubo de ensayo que contenga 9 cc de diluyente y mezclando bien después.

4. Las diluciones sucesivas que sean necesarias (-4, -5, -6, etc.) se preparan de modo similar. Para preparar cada una de las diluciones debe utilizarse una pipeta limpia y estéril. La serie decimal así preparada debe inocularse en el medio de cultivo de inmediato o, como máximo, dos horas después de haberla preparado. Siempre que su uso se retrase más de 10 minutos deben refrigerarse los tubos. De no respetar estas limitaciones probablemente haya crecimiento bacteriano que invalide las diluciones preparadas.

Referencias Bibliográficas

Norma Oficial Mexicana Nom-110-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

Método de Howard

Objetivo

Enumerar fragmentos de micelio en muestras de alimentos como purés, jugos, salsas.

Fundamento

El método de Howard se utiliza mucho en la industria para el conteo de filamentos de mohos en ciertos productos como el jugo de tomate. Es un método rápido, casi no se gastan reactivos y es relativamente sencillo de practicarse, solo se requiere de mucha experiencia para obtener resultados confiables.

Se recomienda estudiar el producto bajo el microscopio antes de contar mohos para familiarizarse con la apariencia del alimento. El puré de tomate puede usarse sin diluir para cuentas de rutina. Se diluye cuando los limites son superiores a un 40 %.

En el caso de cítricos centrifugar 50 ml de jugo por 10 minutos a 2200 r.p.m. decantar, añadir 5 ml de pectina u otro agente engrosante y mezclar.

Procedimiento de conteo.

En un portaobjetos se coloca la muestra

Se examina con el microscopio. La cantidad de muestra debe ser de 0.1 ml y debe ocupar un área de 1 cm2. Se cuentan 25 campos en un portaobjetos y 25 en otro. Se comienza en un extremo y se recorre el portaobjetos hasta el otro lado. Un campo es positivo si la longitud del filamento del moho excede en 1/6 del diámetro del campo.

La cuenta de mohos por el método de Howard es el porcentaje de campos positivos en 2 laminillas con la muestra. La cuenta de un solo portaobjetos no es muy significativa.

Identificación de cuentas de mohos

Su identificación se aprende por experiencia. Si se tiene duda sobre una estructura, no la cuente. Los filamentos de mohos tienen las siguientes características:

• Estructura tubular gruesa.

• Paredes dobles paralelas de apariencia similar.

• Material interior granulado y a menudo separado en segmentos.

• Hifas claras.

Cuestionario

1. -Analice las siguientes muestras: salsa catsup, puré de tomate, puré de un tomate sano, puré de un tomate podrido, infestado de hongos.

2. -Reporte sus resultados en porcentajes, indique si están dentro de los limites o los rebasan.

3. -Indique cuales son los límites para salsa catsup, puré de tomate, salsas y sopas.

4.- ¿ En qué casos nos puede servir como indicador, el método de Howard?. ¿Qué otro tipo de indicadores deben complementar la información?. Elabore un mapa conceptual.

5.- Explique el método de Howard.

Autor:

Mireya XXX