Aislamiento y supervivencia de esporas Bacillus thuringiensis en maíz en almacén y en el ambiente

1. Resumen
2. Introducción y Antecedentes
3. Material y Métodos
4. Resultados y Discusión
6. Literatura citada
7. Anexo

Resumen.

La bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) es una alternativa ecológica para reducir el daño de insectos-plaga en la agricultura y evitar el uso de pesticidas químicos.

Bt produce al final de su ciclo de vida, un complejo espora y cristal ó δ-endotoxina que intoxica insectos-plaga (IP) de los ordenes: Lepidoptera, Diptera y Coleoptera. Si a la aplicación de éste complejo sobre hojas, los IP no lo consumen, el cristal expuesto a la radiación solar se desnaturaliza y las esporas mueren rápidamente, excepto en almacén de granos en donde, éste factor físico no existe, en ese ambiente esporas y cristales de Bt persisten por mayor tiempo, que en el exterior.

Los objetivos de este trabajo fueron: 1) aislar esporas variedades de Bt tóxicos a insectos-plaga de granos de almacén, 2) Establecer la supervivencia de esas esporas en maíz almacenado y expuesto a la intemperie.

Para ello se colectaron 120 muestras de grano de los mercados: San Juan, Nicolás Bravo y Vasco de Quiroga de la ciudad de Morelia, Michoacán, México. Los granos se pasteurizaron y sembraron en agar nutritivo, ahí se buscaron las colonias típicas de Bt y en las células, la espora con el cristal característico.

La supervivencia de las esporas de un Bt aislado de un grano y Bt var kurstaki HD-1 del producto comercial Dipel MR analizó en maíz, colocado en un simulador de almacén y otra se expuso a la intemperie, para medir el efecto de la luz solar sobre la viabilidad de las esporas Bt.

Los resultados indican que de las 120 muestras de granos de mercados en Morelia se recuperaron dos aislados que se denominaron: Bt1 y Bt2 de girasol, equivalente al 1.6 %. Este resultado sugiere que la frecuencia de aislamiento de las esporas de la bacteria, fue proporcional al tiempo de almacenamiento de esos granos. Mientras que la supervivencia de las esporas Bt en maíz, fue dependiente de su exposición a la radiación solar. En contraste en el maíz en almacén, la persistencia de las esporas de Bt fue alta. Finalmente Bt1 se identificó como var. morrisoni y Bt2 como var. kurstaki.

Palabras clave: biopesticida, radiación solar, bacteria, insecto-plaga.

Introducción y Antecedentes.

Los insectos-plaga son uno de los factores que limitan la producción agrícola, dado que atacan cultivos vegetales (CV) desde su siembra a la cosecha e incluso en el almacen. Por ello el Declorodifenildicloroetano (DDE) y otros organoclorados se aplican durante el ciclo completo del CV, para protegerlos del ataque de estos IP. El continuo y excesivo uso de estos pesticidas, les indujo resistencia genética.

Actualmente esta situación no cambia y su control se realiza con dosis elevadas de pesticidas en consecuencia para 1989, se reportaron mas de 500 especies de IP de los ordenes Lepidoptera, Diptera y Coleoptera, tolerantes. Además los pesticidas contaminan: aire, suelo, agua y eliminan insectos benéficos (Alpuche, 1991).

Una alternativa para el control de IP, es el microbiológico con ventaja sobre el químico por su especificidad; su inocuidad a humanos, animales, plantas y su relativo bajo costo (Herrero et al., 2001).

Ejemplo de algunas de las especies del género Bacillus, son los de tipo entomotóxico y/o entomopatógeno como: B. thuringiensis (Bt), B. popilliae, B. larvae y B. sphaericus (Kiselek, 1979; Krieg, 1980; Moir y Smith, 1990), de estas especies, Bt se comercializa desde los años 50, por lo que en la actualidad es clave en la racionalización de los pesticidas (Rowe y Margaritis, 1989; Sánchez-Yáñez, 2004).

Aunque por otro lado en el mercado se venden semillas transgénicas con el gen de Bt, responsable de la producción del cristal para evitar su desnaturalización en el ambiente en un intento por mejorar el control biológico de IP, con éxito relativo y que es causa de controversia por su aún no predecible impacto negativo ecológico (Doping et al., 2000), como ocurre en la aspersión convencional del complejo espora-cristal, un problema práctico de la aplicación del éste es la persistencia de las primeras en el ambiente, pues influyen en la toxicidad del cristal (Sánchez-Yáñez y Peña-Cabriales, 2000).

Las esporas de Bt, se aíslan con relativa facilidad de diversos ambientes, en función de su origen se recuperan: del suelo, del filoplano de plantas (Smith y Couche, 1991), de larvas enfermas de insectos, de productos almacenados y de alimentos balanceados para animales (Pinnock et al., 1971; Sztejnberg y Blakeman, 1973), aunque si existe diferencia en la frecuencia de aislamiento de las esporas de Bt, entre esos ambientes, ya que que son las responsables de su distribución cosmopolita (Goodfellow, 1968a; Goodfellow y Dawson, 1978b), en el suelo (De Lucca et al., 1981; Martín y Travers, 1989), asi se reporta que las esporas fueron viables en hojas de fríjol y maíz no mayor de 72 horas (Sánchez- Yáñez y Peña-Cabriales, 2000), debido a la acción bactericida de la radiación solar (Alekseev et al., 1982). Aunque otros reportes señalan periodos de persistencia mayores de 15 días (Luna- Olvera y Peña-Cabriales, 1996) similar a lo observado en los productos almacenados como granos y alimentos balanceados para animales. En los cuales las esporas de variedades de Bt se recuperan en por ciento del 7% al 30 % y un periodo de supervivencia de semanas (Waliszweski y Pardo-Sedas, 1991; Meadows et al., 1992), como se informa en las hojas del tabaco en almacén, en el que obtuvo un aislamiento de esporas de variedades de Bt del 20% (Kaelin et al., 1994).

En general la frecuencia de recuperación de las esporas de estas variedades de Bt, es mayor en un ambiente protegido de la radiación solar, por ello se considera al ambiente de almacén, como uno de los sitios con mayor probabilidad en detectar de epizootias causadas por Bt con esporas de más de una variedad de Bt, lo que apoya que en este sitio el un número de esporas viables es suficientes para causar, no sólo la intoxicación del IP, también una verdadera enfermedad (Dulmage y Aizawa, 1982; Lambert y Perferoen, 1992).

Con base en lo anterior los objetivos de este trabajo fueron i) Analizar esporas de variedades de Bt en granos de almacén. ii) Establecerr la supervivencia de sus esporas en maíz en almacén y expuesto a la intemperie.

Material y Métodos.

I. Origen de muestras.

Se colectaron 120 diferentes muestras de grano de almacén de los mercados de San Juan, Independencia y Vasco de Quiroga de la Ciudad de Morelia, capital del estado de Michoacán, México.

II. Recuperación de las esporas Bt.

El aislamiento de las variedades de esporas de Bt, se suspendió 1g/ de granos de los mercados en tubos de 18x 150 mm con 10 ml de solución salina (NaCl 0.85%,p/v), los tubos se agitaron/ 1 min en un vortex (Thermolyne). Los granos con daño por IP se trituraron y posteriormente ambas muestras se pasteurizaron a 65°C/ 13 minutos y aumentar la probabilidad de la recuperación de variedades de esporas Bt. Se tomó 0.1 ml del pasteurizado y se inoculó en tubos con 10 ml de caldo nutritivo (Bioxon) g/l: peptona gelatina 5.0, extracto de carne de res 3.0, pH 6.9 ± 0.2, los que se incubaron/24 h y se resembraron con aza bacteriológca en cajas con agar nutritivo o AN (Bioxon) g/l: peptona gelatina 5.0, extracto de carne de res 3.0, agar 15.0, pH 6.9± 0.2, las cajas se incubaron a 30°C/72 h.

Entonces se buscaron las colonias típicas de Bt y en ellas se buscaron sus esporas con los cristal característicos, mediante tinción simple y la especifica de Anthony para esporas bacterianas (Martín y Travers, 1989). La purificación de las posibles variedades de Bt se udó la técnica de pasteurización en el aislamiento de las esporas de Bt, var kurstaki HD-1 del producto DipelMR (Shell, Co).

Se realizó un bioensayo horizontal de la toxicidad de Bt1 contra gorgo (Sitophilus zeamaise L) como lo indica Dulmage (1970) y posteriormente la identificación bioquímica con los criterios aceptados para éste género y especie bacteriana (Krieg, 1980; Rowe y Margaritis, 1989).

Conservación de las esporas de Bt.

Los aislados y las esporas de Bt se cultivaron en caldo nutritivo e incubaron a 30°C/72 h, se mezclaron en turba estéril (121°C/2 h) en tubos de 18×150 mm con tapón de rosca (Sánchez-Yáñez et al., 2002; 2004) y se mantuvieron en refrigeración a 10°C para asegurar la viabilidad y pureza.

III. Microscopia electrónica de los aislados de Bt.

La observación de las esporas y cristales producidos por Bt1 y Bt2 se utilizó el microscopio electrónico de barrido (MEB) JEOL Model JSM 6400, del Instituto de Investigaciones Metalúrgicas de la UMSN. En este ensayo tomo una asada de cada Bt y se fijó en una placa metálica (1×1 cm) de oro, estas se sumergieron en glutaraldehido/45 min. y se deshidrataron en alcohol al 90% para su posterior observación al MEB, luego se recubrieron con una capa de oro (metalización). Las microfotografias se tomaron a 5,000 y 10,000 magnificaciones.

Otra técnica empleada para la observación de Bt fue la siguiente: después de fijar en la placa metálica de oro se sumergió en glutaraldehído al 70% durante 30-45 minutos, luego se le aplicó un baño metálico, con oro o plata. Y se observo en el MEB (Guillen-Rodríguez et al., 2001).

IV. Marcaje de los aislados y cepa de Bt.

La persistencia de las esporas en los granos de maíz en almacén y al intemperie se seleccionó Bt2, por su abundancia y como comparación se usó la cepa comercial de Bt HD-1. Se diseñaron dos medios de cultivo selectivos para la recuperación de las esporas de Bt con base a su patrón de susceptibilidad a los antibióticos de un Multidisco *MR Gram positivo (Sanofi).

La cepa HD-1 con resistencia a ampicilina en AN, agregada estéril por filtración con membrana milipore (Gelman, Co) en concentración de 1500 µg/ml (Lakeside). En el caso del aislado de Bt2 se agrego al AN 750 µg/ml del mismo antibiótico en la forma señalada. Para inhibir el crecimiento de hongos en el AN se usaron U/ml de nistatina (Mendoza et al., 2003).

V. Producción y recuperación del complejo espora/cristal de Bt.

Ambos aislados de Bt se usaron para la producción del complejo espora/cristal, se crecieron individualmente en matraces de 1000ml con 500 ml de: caldo soya tripticasa (CST), caldo soya tripticasa lactosa (CSTL) y caldo nutritivo (CN).

Cada matraz se incubó a 30°C/96h, Tiempo al cual por con el microscopio se buscó un 95% de esporas/cristales, con la técnica de Anthony como indicador del final del crecimiento de Bt. Luego cada caldo se centrifugó a 10,000 rpm/10 minutos, u cada/complejo espora-cristal se recuperó por el método de coprecipitación lactosa-acetona y se realizó el bioensayo horizontal con gorgo (Sitophilus zeamaise. L) y con gusano cogollero (Spodeptera frugiperda. L). Finalmente se determino la especificidad toxica del complejo de Bt1 y 2 (Dulmge, 1970).

VI. Supervivencia de esporas en granos de maíz en almacén y expuestos a la intemperie.

Las esporas y cristales de Bt2 y de HD-1 se ajustaron a 4×106 esporas/semilla, luego se asperjaron en el maíz, que se colocó en costales de polipropileno de 15 x10 cm, como conservan en almacén.

Los costales se introdujeron en un simulador de un ambiente de lamacen de 50 x 50 cm, y esteblecer el tiempo de supervivencia de las esporas, mediante el análisis de un 1 g de maíz, a intervalos de 24 h,con la técnica de cuenta viable en placa, la disgregación de las esporas unidas a los granos, se uso peptona (Difco) al 0.1% y 10 ppm de N- laurilsarocosine sodium Salt (LSD, Sigma), así se determinó la densidad de las esporas de Bt2 en granos con y sin pasteurizar. Mientras que el maíz asperjado con Bt2 se expuso al intemperie, para medir el efecto de la radiación solar en el tiempo de supervivencia de esporas de Bt, con intervalos de 12 h, por ello se tomó 1 g de maíz como se describió con las esporas de Bt en maíz en almacén, simultáneamente registró la temperatura y la humedad relativa del ambiente durante el periodo del experimento (Guillen- Rodríguez et al., 2001).

VII. Análisis estadístico.

La persistencia de las esporas de Bt2 y la cepa comercial HD-1 en granos de maíz se evaluó con la prueba estadística por comparación de medidas de Tukey.

Resultados y Discusión

En la figura 1 se muestra una magnificación de cristal sintetizado por Bt1 que se recuperó de granos en almacén, con cristales rectangulares y cúbicos e incluso amorfos, lo cual sugiere que tentativamente en esos granos existe también la típica variedad morrisoni de Bt en almacén (Sánchez-Yáñez, 2004.

En la figura 2 muestra la morfología típica de las esporas y cristales bipiramidales producidos por Bt2 a la 96h, lo que sugiere que se trata de la variedad kurstaki.

La figura 4 presenta el resultado del bioensayo horizontal del complejo espora-cristal de Bt2 el que define que su toxicidad, con una mortalidad de 100% al gusano cogollero (Spodoptera frugiperda. L) IP del orden Lepidoptera. ; lo cual fue dependiente de la composición del cultivo en donde creció (Dulmage, 1970) y del origen del Bt (Lambert y Perferoen, 1992). Estos resultados apoyan que en productos de almacén como los granos es posible detectar más de una variedad de Bt diferente a la común en este sito: la morrisoni.

Los resultados de este bioensayo y las pruebas bioquímicas indican que se trata de Bt variedad kurstaki

En la figura 5 se presenta el resultado del bioensayo horizontal del complejo espora-cristal de Bt1 en el gorgojo del maíz (Sitophilus zeamaise. L). En el que se registró una mortalidad del 70%, lo que depende en cierta nivel de la composición químico del medio de cultivo donde Bt1 se cultivó, este resultado apoya que la variedad de Bt1 aislada pertenece morrisoni, que es solo tóxica para ciertos IP del orden Coleoptera como el gorgojo.

En el cuadro 1 se muestra el tiempo de supervivencia de las esporas de Bt2 y la cepa HD-1 en granos de maíz en el almacén a temperatura promedio de 20°C ± 1 y humedad relativa del 10%. Mientras que a la intemperie fue 10°C a las 5 AM, 25°C a las 12 AM; 35°C a las 16 pm, humedad relativa de 40%; entre 17-19 pm de 28°C y humedad del 30% entre h durante la primavera. En donde la visibilidad de las esporas de ambos aislados de Bt fue mayor en el almacén y restringida cuando el maíz se expuso al ambiente (Pinock et al., 1971), se cree que la muerte de las esporas fue causada por la acción germinada de la luz solar, que se relacionó con la carencia de las pequeñas proteínas solubles en el ácido (PPSA) de la cubierta de las esporas de Bt, las PPSA les proporcionan a las esporas tolerancia a la radiación solar (Benoit et al., 1990, Griego y Spence, 1979; Ignoffo y García, 1978).

Así se explica que en almacén de granos en ausencia de la luz solar, a relativa baja humedad, se evita la actividad depredadora de microorganismos que eliminan las esporas de Bt, lo que favorece la supervivencia de las esporas de la bacteria por un mayor tiempo, en contraste con la menor persistencia de las esporas de Bt en ambiente abierto o intemperie (Guillén-Rodriguez et al.,2001).

Esto justifica en parte el empleo de complejos encapsulados que contienen la δ-endotoxina y la espora de Bt, para aumentar su persistencia y la eficacia del control biológico de insectos-plaga de almacén y agrícola.

En el cuadro 2 se muestra la caracterización bioquímica de Bt1 que apoyan variedad morrisoni como la utilización de glucosa, de almidón, la hidrólisis de caseína, y la síntesis de catalasa así como su incapacidad para la producción de ureasa (Guillén-Rodríguez et al ., 2001).

La presencia de esporas de Bt de distintas variedades, supone que durante la siembra, cosecha y transporte de los granos desde el campo al almacén se dieron las condiciones para su contaminación con esporas de diversos tipos de Bt; probablemente provenientes de insectos y pájaros con contacto con las plantas (Dulmage y Aizawa, 1982).

A pesar de que las esporas de otras variedades de Bt no son comunes y su persistencia es relativamente breve, se supone que el tiempo en el cual, esos granos se colectaron y luego almacenaron prolongo la supervivencia de las esporas de la bacteria por esa ruta (De Lucca et al., 1982; Demock et al., 1989).

Conclusión

Los granos de almacén son una fuente potencial para el aislamiento de variedades de Bt tóxicos para insectos-plaga agrícola y de almacén. Aunque en el caso de los insectos-plaga que atacan granos, su control por Bt, puede ser relativamente sencillo por la persistencia de sus esporas puesto que se comprobó que sus esporas tienen baja viabilidad expuesta al ambiente abierto.

Dedicatoria. A Juan Manuel Sánchez Marín por su ejemplo de disciplina y trabajo

Agradecimientos. Al proyecto 2.7 (2005-2006) de la CIC de la UMSNH, por el apoyo económico para la presente publicación. Al IIM-UMSNH por las facilidades del microscópico de barrido y su técnico Francisco Solorio por su apoyo en este trabajo, a Beatriz Noriega por su paciencia en la escritura.

Literatura citada.

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ANEXO

Figura 1. Microfotografía electrónica de barrido de las esporas y cristales cúbicos, rectángulares y amorfos producidos por Bacillus thuringiensis (Btl) variedad morrisoni aislada de granos en almacén, cultivo de 96 h (10,000 magnificaciones). E= espora, C=cristal.

Cuadro 1. Persistencia de esporas de Bacillus thuringiensis (Bt2) y B. thuringiensis var kurstaki (HD-l) asperjados en maíz en almacén y expuesto a la intemperie.

Letras iguales sin diferencia estadística Tukey ( PO.Ol), CV 10%. Datos ambientales: material ~ métodos.

Cuadro 2 Comparación de las características bioquímicas de Bacillus thuringiensis (Bt1) de granos almacenados y Bacillus thuringiensis variedad morrisoni**.

(+)= respuesta positiva; (-) = respuesta negativa, los resultados son el promedio de 4 repeticiones **Cepa de referencia, donada por el Laboratorio. H.T. Dulmage, Facultad de Ciencias Biológicas-Universidad Autónoma de Nuevo León. Monterrey, Nuevo León, México.

Villegas, M. J1.,

2Guillen, R, D.,

Martínez, M, H

2*Sánchez-Yáñez J. M.

1Ecología Microbiana, 2*Microbiología Ambiental.

1*autor correspondiente

Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Ed. B-1, Ciudad Universitaria. C.P. 58030. Morelia, Michoacán, México.