PCR en tiempo real: la nueva era de la información genética (página 2)

La PCR en tiempo real puede generar amplicones muy pequeños (desde 60 pb) lo que la hace ideal para la detección de cambios cuantitativos en la expresión génica durante el curso de alteraciones celulares patológicas o experimentales, así como para la cuantificación de niveles de ARNm en muestras de tejidos con ARN parcialmente degradado (Bustin, 2002).

Una característica importante de PCR en tiempo real es su amplio rango dinámico. Esto implica que una amplia gama de ratios en los genes a estudiarse y en los genes normalizadores puede analizarse con similar sensibilidad y especificidad (Dorak, 2008).

En esta prueba el producto de la PCR se mide al final de cada ciclo. Los datos pueden ser analizados mediante un software informático y el número de copias de ARNm o la expresión génica relativa entre varias muestras puede calcularse (Heid et al.,  1996).

2 Transcripción reversa en la PCR en tiempo real

Una limitación de la PCR en tiempo real es que se debe utilizar ADN como secuencia diana, ya que las ADN polimerasas no pueden amplificar ARN de una manera similar. Este problema se puede superar mediante el uso de la enzima transcriptasa inversa para generar ADNc a partir de una plantilla de ARN (Valasek & Repa, 2005).

Hay varias transcriptasas inversas utilizadas comúnmente, entre ellas tenemos la transcriptasa inversa del virus aviar de mioblastosis la y la transcriptasa inversa del  virus de leucemia murina, siendo la primera la más robusta de ellas. También es posible usar mezclas de transcriptasas inversas, pudiendo estas dar lugar a una mejor eficiencia de la transcripción inversa que las enzimas de componente individual (Bustin, 2005b).

Por esta razón la PCR en tiempo real con transcriptasa inversa (RT-PCR en tiempo real) se ha convertido en el método de elección para realizar un examen rápido y cuantitativo de la expresión de genes específicos, lo que no sería posible con anteriores metodologías (Walker, 2002)

Por último, es importante mencionar que dado que la PCR en tiempo real y la transcripción reversa se utilizan en combinación, la señal final obtenida en RT-PCR en tiempo real dependerá de la eficiencia de la reacción de la transcriptasa inversa (Bustin et al.,  2005).

3 Marcadores Fluorescentes

Varios métodos se han desarrollado para cuantificar el producto de la PCR. Sin embargo la PCR se ha aplicado principalmente como un método cualitativo, ya que para llevar a cabo la cuantificación en los productos de estas reacciones se necesita mucho tiempo y los métodos para realizarla son relativamente difíciles de implementar. Además debe tenerse en cuenta que en los últimos ciclos de la reacción de la PCR, la cantidad de producto no guarda relación con la cantidad inicial de ADN o ADNc en las muestras a analizarse (Lee et al.,  2004; Valasek & Repa, 2005).

Por el contrario y en contraste con los métodos anteriores en los que se necesitan componentes adicionales, una de las más importantes ventajas de la PCR en tiempo real es que el proceso completo se realiza en el termociclador. Esta característica ayuda a disminuir el riesgo de posterior contaminación en el laboratorio y permite aumentar el rendimiento de la prueba en tiempo real (Valasek & Repa, 2005). Para obtener estos resultados, este sistema incluye dos componentes: elementos ópticos integrados al termociclador (figura 1) y  marcadores fluorescentes que proporcionan información acerca de amplificación a lo largo de los ciclos de la PCR (Heid et al.,  1996).

Figura 1

Componentes ópticos en el termociclador que permiten  la identificación de marcadores fluorescentes.

Hay dos clases principales de marcadores fluorescentes para la PCR en tiempo real: genéricos y específicos. Las técnicas que usan marcadores fluorescentes específicos emplean sondas de ácidos nucleídos que se unen a amplicones específicos (producto de PCR). Los métodos que utilizan sondas fluorescentes tienen la ventaja de ser muy precisos y evitar posibles artefactos o secuencias inespecíficas presentes en el producto de la PCR. Sin embargo, este enfoque necesita de un diseño de secuencias específicas para su uso como sondas y por consiguiente es más laborioso y costoso (Lee et al.,  2004).

La detección genérica se basa en la utilización de colorantes que se unen a todas las secuencias de doble cadena de ADN en una reacción de PCR (figura 2). Una vez que el colorante se une al ácido nucleído formado en la reacción, este emite una señal fluorescente que se procesa en tiempo real (Walker, 2002). Por lo tanto, un aumento del producto de la PCR conduce a un aumento de la fluorescencia detectada en cada ciclo de la PCR; esto permite que las concentraciones de ADN o ADNc puedan ser cuantificadas (Ririe et al.,  1997).

Varios de estos marcadores se han descrito pero los más utilizados son los colorantes SYBR ® Green y SYBR ® Gold (Lee et al.,  2004). Estos marcadores son populares para su uso en la PCR en tiempo real porque no sólo son más baratos sino que también son distribuidos por los proveedores de reactivos como cócteles listos para usar y no requieren un diseño experimental adicional (Ririe et al.,  1997; Giglio et al.,  2003).

La principal limitación de estos marcadores es que al unirse al total de ácidos nucleídos en la reacción de la PCR, emiten una señal luminosa tanto para productos específicos como para aquellos que no lo son (primer-dimers). Para hacer frente a esta situación se debe realizar un análisis de los resultados en la curva de fusión (Melt Curve). Este análisis permite que los productos no específicos puedan ser discriminados de los amplicones específicos (Ririe et al.,  1997).

Figura 2

Los marcadores fluorescentes genéricos en la PCR en tiempo real emiten una señal luminosa para todas las secuencias de doble cadena. Esta señal luminosa puede ser medida posteriormente.

4 Análisis de la curva de fusión

Los datos que se obtienen con diferentes mezclas de SYBR ® Green (cócteles comerciales o mezclas realizadas en laboratorio) pueden variar. Sin embargo se observa constantemente que los amplicones detectados con SYBR ® Green I son significativamente grandes y tienen un alto contenido de GC (Giglio et al.,  2003). En consecuencia es posible identificar productos específicos de la PCR mediante el análisis de la temperatura de fusión que se expresa en una curva cuya forma se relaciona con el contenido de GC, tamaño de los amplicones y la secuencia de los mismos (Ririe et al.,  1997).

El análisis de la curva de fusión puede llevarse a cabo en la mayoría de plataformas disponibles para la PCR en tiempo real, por lo general al final de la reacción de amplificación. La  medida de la fluorescencia dependiente de la temperatura se realiza mientras la temperatura en el termociclador aumenta de alrededor de 50°C a 95°C, siendo la fluorescencia detectada dependiente de la presencia de secuencias de doble cadena de ADN o ADNc (Giglio et al.,  2003; Lee et al.,  2004).

Cuando las dobles cadenas de ADN o ADNc se separan por efectos de la temperatura, la fluorescencia disminuye porque el colorante deja de estar unido al producto de la PCR. La mayoría de los instrumentos proporcionan un análisis de estos datos teniendo en cuenta el punto en donde aparece el primer diferencial negativo de la señal de fluorescencia con respecto a la temperatura y la temperatura de fusión (figura 3). Este punto aparece como uno o más picos que representan las temperaturas a las que los máximos niveles de cambio de la fluorescencia se producen, correspondiendo estos a un producto particular en la PCR (Lee et al.,  2004).

Para discriminar los productos específicos de la PCR es necesario saber que estos se disocian a una temperatura más alta que los artefactos como primers dimers  (Ririe et al.,  1997).

Figura 3

Análisis de la curva de fusión. Los picos de las curvas muestran que los productos específicos de la PCR en tiempo real tienen una temperatura de fusión mayor a la de productos inespecíficos.

Vale la pena tener en cuenta que el método de análisis de la curva de fusión es análogo al de electroforesis en gel de agarosa (Giglio et al.,  2003). Con ambos métodos se puede evidenciar la presencia de productos no específicos, sin embargo también están expuestos a errores. Estos casos ocurren cuando las masas moleculares de los productos de la PCR en cuestión son similares. Adicionalmente, la exactitud de estos datos depende también de las plataformas de hardware utilizadas (Lee et al.,  2004).

5 Umbral y valores umbral del ciclo (threshold cycle values)

Como se ha descrito, los resultados de la PCR en tiempo real se basan en la detección y cuantificación de los marcadores fluorescentes a lo largo de la reacción de la PCR. Esto permite conocer la cantidad de fluorescencia emitida durante la fase exponencial de la reacción, donde un aumento significativo del producto de la PCR se correlaciona con la cantidad inicial de ADN o ADNc en estudio (Walker, 2002).

Para obtener estos resultados, los valores umbral de ciclo (Ct por sus siglas en ingles) deben ser obtenidos. Anteriormente, un umbral adecuado debe ser fijado por el operador en un punto significativamente por encima de la línea base (Figura 4). Los valores Ct son determinados por la identificación del ciclo en el cual la emisión de la intensidad del marcador fluorescente se eleva por encima del ruido de fondo en la fase exponencial de la reacción de la PCR (Figura 5). En otras palabras, el valor Ct está representado por el ciclo en el cual la producción de fluorescencia cruza el umbral establecido (Bustin, 2005a).

Es importante considerar que un valor Ct superior a 40 ciclos indica que no hay amplificación y por consiguiente no deben incluirse en los cálculos. En la actualidad hay software que puede determinar valores Ct mediante un análisis matemático de la curva de crecimiento pudiendo tener así una mejor reproducibilidad en las pruebas de PCR en tiempo real (Dorak, 2008)

Figura 4

Umbral (threshold) fijado con anterioridad para la determinación de los valores Ct.

Gráfico 5

Los números de ciclo en los cuales la curva de fluorescencia atraviesa el umbral establecido corresponden a los valores Ct que se utilizarán en cálculos posteriores.

6 Optimización de PCR en tiempo real

Para obtener resultados confiables en las pruebas realizadas con la PCR en tiempo real es necesario optimizar la reacción en el laboratorio. La optimización consiste en hacer que las variaciones normales de la prueba no causen efectos importantes en los valores Ct y que tengan un impacto mínimo en la cantidad de fluorescencia observada. Los criterios más importantes para la optimización son especificidad, sensibilidad, eficiencia y reproducibilidad de la PCR en tiempo real (Edwards, 2004).

Los factores que deben ser optimizados son las mezclas maestras de reactivos, la concentración de los primers, concentración de los marcadores fluorescentes y la concentración de la muestra. Las mejores concentraciones de reactivos y condiciones de la PCR son aquellas en las que se observa resultados óptimos en términos de la curva de fusión y de la eficiencia de la amplificación en reacciones llevadas a cabo con controles positivos o calibradores (Edwards, 2004).

También es útil realizar electroforesis en gel de agarosa cuando se optimiza una PCR en tiempo real. Los resultados de este análisis proporcionan datos para relacionar la longitud del producto con los picos del análisis de la curva de fusión y la posible presencia de artefactos como primer dimmers (Dussault & Pouliot, 2006).

7 Estrategias para la cuantificación de ARNm en PCR en tiempo real

Comúnmente se emplean dos estrategias para llevar a cabo la cuantificación de la expresión genética con PCR en tiempo real. Estas estrategias son: cuantificación absoluta y cuantificación relativa de la PCR en tiempo real.

7.1 Cuantificación absoluta

La técnica de cuantificación absoluta relaciona la señal obtenida con la PCR en tiempo real al número de copias fijo de una secuencia estándar utilizando una curva de calibración. Las curvas de calibración son altamente reproducibles y permiten la generación de datos específicos y sensibles. Sin embargo el modelo de curvas de calibración externas tiene que ser rigurosamente validado con absoluta exactitud pues la cuantificación de la expresión genética en la PCR en tiempo real depende exclusivamente de la precisión de los estándares empleados (Pfaffl, 2008).

Además, el diseño de secuencias estándar, su producción y la determinación exacta de sus concentraciones así como su estabilidad a largo plazo y su almacenamiento son factores complejos y puede presentar algunos problemas (Pfaffl, 2004). Estas consideraciones hacen de la cuantificación absoluta un procedimiento laborioso, costoso y que no siempre pueden llevarse a cabo en todos los laboratorios.

7.2 Cuantificación relativa

La cuantificación relativa no requiere estándares con concentraciones determinadas. Esta técnica se utiliza para obtener la magnitud de los cambios fisiológicos en los niveles de expresión genética de un gene en estudio en comparación con uno o más  genes de referencia (Pfaffl, 2004). Hay que tomar en cuenta que la expresión de los genes de referencia debe ser constante en las células estudiadas. Por esto, las secuencias utilizadas para cuantificación relativa son generalmente genes "housekeeping" (Ambion, 2008).

Los cálculos en cuantificación relativa de expresión genética se basan en la comparación de los valores Ct utilizando la eficiencia de la reacción de la PCR como factor de corrección. Sin embargo, hay un modelo que no requiere la eficiencia de la reacción para acceder a un factor de corrección. Este modelo supone una eficiencia óptima e idéntica (correspondiente al 100%) en la eficiencia de reacción en las PCR en tiempo real tanto del gen en estudio como del gen de referencia (Livak & Schmittgen, 2001). Este es el método 2 delta-delta Ct  que sólo es aplicable para una estimación rápida de la proporción relativa de la expresión genética en estudio (Pfaffl, 2001). El método 2 delta-delta Ct expresa la proporción obtenida de la relación entre los valores Ct de la muestra y los valores Ct del control tal y como se muestra en la siguiente ecuación:

Otro modelo para cuantificación relativa ha sido publicado por Pfaffl (2001). En este modelo las diferentes eficiencias de la PCR tanto para los genes en estudio como para los genes de referencia se toman en cuenta como se muestra en la siguiente ecuación:

En esta ecuación el ratio del gen en estudio se expresa en una muestra frente a un control en comparación con un gen de referencia. Etarget representa la eficiencia de la PCR en tiempo real del amplicon en estudio; Eref representa la eficiencia de la PCR en tiempo real del gene de referencia; ΔCPtarget  es la desviación en Ct del control menos la muestra del gene en estudio; y ΔCPref es la desviación en Ct del control menos la muestra del gen de referencia.

Como se mencionó, en este modelo también es necesario conocer la eficiencia de PCR de cada gen estudiado. Las eficiencias de la PCR en tiempo real se calculan a partir de las pendientes de la curva estándar obtenidas después de realizar diluciones seriadas con las reacciones de la PCR en tiempo real (Pfaffl, 2004) de acuerdo a la siguiente fórmula:

E=10[-1/slope]-1.

Es importante mencionar que la eficiencia de la PCR en tiempo real es la capacidad de la reacción de duplicar el número de copias de las cadenas de ADN o ADNc en cada ciclo (Bustin & Nolan, 2004a)

Se ha observado que la cuantificación relativa de ARNm tiene algunas limitaciones. En primer lugar, se puede introducir un sesgo estadístico importante cuando hay grandes diferencias en los niveles de expresión del gen en estudio y del gen normalizador lo que pueden conducir a una interpretación biológica equivocada y en segundo lugar, es difícil encontrar genes de referencia adecuados (Bustin et al.,  2005). Por estas razones es recomendable la utilización de más de un gen de referencia con el fin de tener datos fiables en la investigación (Bustin & Nolan, 2004b).

8 Genes de referencia

Algunos de los genes de referencia más utilizados incluyen: β-actina, Glyceraldehyde 3-fosfato deshidrogenasa, hipoxantina guanina phosphoribosyl-transferasa y 18S del RNA ribosomal (Huggett et al.,  2005).

La elección correcta de los genes de referencia para la normalización de PCR en tiempo real es esencial para reflejar datos fiables sobre los procesos biológicos de las proteínas objeto de estudio (Robinson et al.,  2007). Además se ha demostrado que el uso de un solo gen como  gen de referencia es susceptible a tener errores en la interpretación de los resultados de la PCR en tiempo real (Lee et al.,  2002). En consecuencia, para normalizar las expresiones de genes cuando se trabaja con PCR en tiempo real, es necesario utilizar más de un gen de referencia, sobre todo cuando no se puede encontrar un único gen de referencia con características óptimas para realizar cuantificación relativa (Huggett et al.,  2005; Robinson et al.,  2007)

Actualmente existe software adecuado para realizar el análisis de la idoneidad se genes de referencia para cada experimento que se realice y pueden ser encontrados de forma libre en internet. Un ejemplo es BestKeeper con el cual se puede acceder a la calificación de hasta 10 genes de referencia y puede ser descargado de http://www.gene-quantification.info/.

9 Aplicaciones de la PCR en tiempo real.

La PCR en tiempo real tiene amplias aplicaciones en investigación científica y como herramienta de diagnóstico. Vale la pena resaltar que se han hecho grandes logros en el estudio de virus que afectan al hombre y a los animales (Bustin, 2005a) así como en la investigación de bacterias y hongos patogénicos, pues esta prueba ofrece una gran sensibilidad y especificidad en menor tiempo y a un menor costo. También es ampliamente utilizada en identificar mutaciones o polimorfismos genéticos valiéndose de sondas específicas y sus resultados en el análisis de los cambios de la curva de fusión (Valasek & Repa, 2005). Asimismo la PCR en tiempo real se utiliza para acceder a datos relevantes a la biodinámica de los organismos que producen enfermedades (Clementi et al.,  1993).

Sin embargo uno de los campos de mayor aplicación de esta técnica es la investigación de cambios en la expresión genética de células a través de la cuantificación de su ARNm, permitiendo asociar dichos cambios a estados fisiológicos celulares, presencia de fármacos, agentes infecciosos, etc (Bustin et al.,  2005).

Una ventaja adicional de esta técnica es que para implementarla es suficiente contar con una cantidad pequeña de muestra. Esto la hace ideal cuando se usa conjuntamente con microcirugía laser para hacer biopsias de tejidos o células específicas y estudiar, por ejemplo, el comportamiento de células cancerosas (Edwards et al.,  2004; Johnson et al.,  2005).

La PCR en tiempo real también se está usando en otros campos como la investigación forense y la bioseguridad. En estos casos las investigaciones se basan en la identificación con una alta sensibilidad y especificidad de organismos patógenos o saprófitos difundidos en el medio ambiente. La caracterización de pequeñas cantidades de material genético procedente de tales organismos hace posible conocer su procedencia e identificar su dinámica (Johnson et al.,  2005).

Otro campo en el que se utiliza la PCR en tiempo real es el de la seguridad alimentaria. Aquí, la identificación de organismos genéticamente modificados (OGM) en alimentos o aditivos alimentarios es una necesidad que se puede cubrir utilizando esta tecnología. Bajo los principios revisados anteriormente también se puede acceder a la cuantificación de OGM, recurriendo a genes de referencia para normalizar la cantidad de ADNc ingresado en los ensayos (Bustin, 2005a).

10 Futuras perspectivas de la PCR en tiempo real

Uno de los usos que se desprende de la tecnología utilizada en la PCR en tiempo real es la realización de pruebas diagnósticas moleculares en el mismo lugar en donde se toma la muestra a ser estudiada y no en laboratorios lejanos. Esto no solo volvería a este tipo de tecnologías más baratas, sino que hará que los datos colectados sean más fáciles de procesar y estén a disposición de los investigadores de manera inmediata. Estas visiones, conjuntamente con el desarrollo de plataformas de hardware portátil, darán paso al inicio de la era de pruebas genéticas individualizadas (Walker, 2002). La disponibilidad y facilidad de uso que se proyectan a futuro con la PCR en tiempo real también harán posible utilizar este tipo de plataformas en instituciones educativas para enseñar de forma práctica y evidente las características e implicaciones de la biología molecular (Valasek & Repa, 2005).

11 Conclusión

En la actualidad, la investigación basada en biología molecular está abriendo un inmenso espectro de posibilidades para un mejor entendimiento de los fenómenos biológicos que nos rodean. Las implicaciones que tiene este nuevo conocimiento abarcan campos tan diversos como la medicina, la conservación medio ambiental y la industria. En este contexto las pruebas como la PCR en tiempo real son una prometedora ayuda para el desarrollo de aplicaciones que permitan realizar investigación en biología molecular obteniendo un gran flujo de datos fiables y precisos sobre los organismos estudiados. Sin embargo mayor investigación y desarrollo serán necesarios para hacer de esta prueba accesible a un gran público y sus resultados interpretados de manera directa y fiable.

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 Autor:

Christian Vinueza Burgos

2008