PCR en tiempo real: la nueva era de la información genética

1. Resumen
2. Introducción
3. tiempo real
4. Marcadores Fluorescentes
5. Análisis de la curva de fusión
6. Umbral y valores umbral del ciclo (threshold cycle values)
7. Optimización de PCR en tiempo real
8. Estrategias para la cuantificación de ARNm en PCR en tiempo real
9. Genes de referencia
10. Aplicaciones de la PCR en tiempo real
11. Futuras perspectivas de la PCR en tiempo real
12. Conclusión
13. Referencias 

Resumen

La identificación de la expresión genética y de secuencias específicas de ADN o ARN es un factor crucial cuando se trabaja con técnicas de biología molecular. Para obtener esta información algunas pruebas han sido desarrolladas, siendo la PCR una de las más usadas. Sin embargo esta técnica tiene algunas limitaciones como la dificultad de cuantificar el producto de la PCR y el riesgo de provocar contaminación en el laboratorio. Para hacer frente a estas desventajas, la PCR en tiempo real ha sido desarrollada. Esta técnica brinda una gran cantidad de datos con una alta sensibilidad y especificidad usando plataformas modernas que evitan la contaminación que puede ser causada en laboratorio por ácido nucleídos. Por otro lado algunas consideraciones como el escoger la estrategia de cuantificación y marcadores fluorescentes, así como la interpretación de los datos obtenidos, deben ser tomadas en cuenta cuando se usa la PCR en tiempo real. En este artículo se revisan los conceptos básicos de la PCR en tiempo real y del manejo de los datos obtenidos con esta técnica de laboratorio.

Palabras clave: PCR en tiempo real | cuantificación genética | biología molecular | genes de referencia | ADN complementario | transcriptasa reversa

(Real Time PCR: the new age of genetic information)

Abstract

Identification of gene expression and specific sequences of DNA or RNA is a crucial fact when working with molecular biology techniques. In order to obtain this information some tests have been developed, being PCR one of the most used ones. However, this technique has some limitations as the difficulty to quantify the PCR product and the risk to carry out laboratory contamination. In order to face these disadvantages real time PCR has been developed. This technique comes out with an elevated data output with a high sensibility and specificity using modern platforms that avoid laboratory contamination that could be caused by nucleic acids. Nevertheless, several considerations, like the choice of the strategy of quantification and fluorescent markers as well as data interpretation, must be taken into account when working with real time PCR. This review goes through the basic concepts on the real time PCR technique and handling of obtained data.

Keywords: real time PCR | genetic quantification | molecular biology | reference genes | complementary DNA | reverse transcriptase

Tipo de trabajo: Artículo de de revisión bibliográfica

Descripción de los recursos: texto, imágenes, 1.46 MB aproximadamente.

1 INTRODUCCIÓN

En todos los organismos vivos las células regulan sus actividades mediante la activación o desactivación de la expresión de sus genes. La expresión genética es generalmente proporcional al número de copias de ARN mensajero (ARNm) de un gen determinado. Este es un hecho crucial cuando se trata de identificar la presencia de productos celulares específicos ya que el ARNm es traducido en los ribosomas para formar proteínas. Por lo tanto es posible obtener datos relativos a la producción de elementos biológicos si la expresión de los genes de una célula es conocida (McPherson et al.,  2008).

Con el fin de abordar esta premisa, una técnica conocida como northern blotting ha sido generalmente utilizada. En este método ARN purificado es separado por electroforesis en gel de agarosa y luego identificado con sondas de ADN específicas (Smith & Old, 1993). Aunque esta técnica se sigue utilizando para investigar la expresión genética celular su principal desventaja es la exigencia de cantidades relativamente grandes de ARN, impidiendo su uso cuando las cantidades de ARNm son limitadas (McGuire et al.,  2004).

Para superar esta limitación se ha desarrollado la técnica de PCR en tiempo real, también llamada PCR cuantitativa en tiempo real. Esta técnica está basada en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y  se usa para amplificar y al mismo tiempo cuantificar moléculas de ADN o ADN complementario (ADNc) específicas y así acceder a datos fiables y precisos sobre la expresión genética de las células en estudio (Heid et al.,  1996).