Métodos de esterilización en el laboratorio químico

1. Objetivos
2. La Esterilización
3. Métodos físicos
4. Calor húmedo – Autoclave Chamberland
6. Métodos químicos
7. Radiación
8. Bibliografía

OBJETIVOS DE LA ESTERILIZACIÓN:

No se puede hablar de esterilización sin considerar el concepto de microorganismo. Un microorganismo es un agente microscópico vivo e imperceptible a los sentidos que generalmente está agrupado en colonias, aunque bien puede estar como una unidad formadora de colonias (U.F.C.), la que se desarrolla en un medio apropiado para formar colonias perceptibles. Los microorganismos pueden ser patógenos (productores de ciertas enfermedades) o banales (los habitualmente hallados en los alimentos, el aire, el polvillo ambiental, que no perjudican al hombre.

El hecho de que existan distintos tipos de gérmenes en el medio ambiente, crea grandes dificultades en los estudios bacteriológicos, cuando es necesario obtener las especies microbianas en estado de pureza, ya que tanto el instrumental como los medios de cultivo son invadidos con suma facilidad por los microbios del medio ambiente.

Con el fin de subsanar éstos inconvenientes se practica la esterilización, procedimiento que consiste en destruir todos los gérmenes vivos que existan sobre los objetos o sustancias que se desean libre de ellos (asépticos).

Los Microorganismos pueden clasificarse en criorresistentes, que son los resistentes al frío y termorresistentes o resistentes a las altas temperaturas, aunque la clasificación más común es por la temperatura a la que se reproducen. Así se los puede clasificar en Criófilos (-5 a 14 °C); Mesófilos (25 a 47 °C) y Termófilos (50 hasta 113 °C). Por ejemplo, muchos hongos se destruyen con la temperatura, pero sus esporas aún son viables y cuando encuentran un medio apropiado, rico en nutrientes y humedad, se reproducen. Por tal motivo la tecnología para su destrucción debe considerar éstas variables.

LA ESTERILIZACIÓN

Esta operación comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos, que se emplean para destruir, inactivar o retener gérmenes en general y patógenos en particular. A través de esta, los materiales de laboratorio para determinados diagnósticos y los elementos quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria.

CAPÍTULO 2

2. MÉTODOS FÍSICOS:

Calor La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

2.1 Fuego Directo: Este procedimiento consiste en exponer a la llama de un mechero de Bunsen el objeto que se desea esterilizar. Cuando éste es de metal se deja permanecer en el área de reducción de la llama hasta que se ponga al rojo (asas de cultivo; algunas agujas, etc) . Si es de vidrio se deja un tiempo prudencial, procurando que la llama llegue a todos lados. Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario dejarlo enfriar en un sitio aséptico. Este procedimiento tiene limitaciones debido a que deteriora los objetos y si son de gran volumen, la esterilización nunca es perfecta.

2.2 Calor Seco: El calor seco produce desecación de la célula, esto es tóxico por niveles elevados de electrolitos y fusión de membranas, residuos que quedan adheridos al objeto estéril. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.

Aún así se sigue utilizando el calor seco en todos los laboratorios para la esterilización de placas de petri y pipeteros (recipientes metálicos para alojar pipetas para la siembra de sustancias líquidas).

La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos componentes o nutrientes de los microorganismos, requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.

2.3 Estufas: Para esterilizar por intermedio del aire caliente es necesario colocar los objetos

en aparatos especiales llamados ESTUFAS. Y llevar el aire interior a una temperatura entre 150 y 190 °C. Uno de los primeros aparatos utilizados para este fin fué el horno de Pasteur, que luego se sustituyó por estufas de aire caliente. Estas constan de una doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia eléctrica circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas vatriables, siendo la más aconsejadas 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores. Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal denominados de par bimetálico, consistente en dos metales de distinto coeficiente de dilatación. Cuando uno se dilata, el otro no lo hace y se arquea. Uno de los extremos de éste dispositivo se halla en contacto con un interruptor que corta la alimentación de la resistencia calefactora.

UN AVANCE EN EL CONTROL DE TEMPERATURA: En la actualidad la mayoría de las estufas de esterilización o de cultivo se termorregulan por medio de un termostato hidráulico que consiste en una ampolla metálica con gas en su interior, hermética, unida por medio de un capilar de metal a un tambor que varía su volumen cuando aumenta la temperatura. Este tambor está en contacto con una llave interruptora, de manera que si el gas interior del tambor se dilata por el calor, la llave a la que está unido interrumpe el fluido eléctrico a la resistencia, manteniendo así la temperatura de la cámara.

MODERNIZACIÓN EN EL DISPOSITIVO DE CONTROL DE TEMPERATURA: Se ha logrado controlar la temperatura mediante un circuito electrónico que utiliza el microprocesador 555, utilizando como sensor una termorresistencia. Esta baja la resistencia a la corriente al aumentar la temperatura y la señal es enviada al procesador, el que corta un relé que alimenta la corriente de la resistencia de calefacción. Tanto éste como otros dispositivos electrónicos ofrecen extrema sensibilidad de control, ya apto mas para estufas de cultivo que para esterilización.

Ventajas del calor seco:

• No es corrosivo para metales e instrumentos.
• Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.

Desventajas:

*Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

CAPÍTULO 3

Calor Húmedo: El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: *El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua. *El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

Antecedentes: El primer antecedente fue la marmita de Papin en 1681, semejante a una olla a presión que permitía mantener el agua por encima de los 100° C.

En 1830 William Henry, médico de Manchester; trataba ropa y otros utensilios provenientes de personas infectadas exponiéndolos en una vasija a vapor recalentado y aire caliente obteniendo el material libre de infección.

Pasteur en 1876, Koch y Wolffhugel en 1881 dan los fundamentos de la esterilización por calor seco y calor húmedo: 30 minutos a 110° – 120° C de exposición al vapor eran equivalentes a una hora de calor seco a 130° – 150° C.

En 1884 aparece en París con el nombre de Chamberland un equipo para usar en laboratorio, el que luego se masificaría en todos los laboratorios biológicos.

AUTOCLAVE Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland.

Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos. Equipo: Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica.

La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete (también llamado espita) y el tercero, para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

Funcionamiento y método para esterilizar adecuadamente en Autoclave: Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de metal. Se cierra asegurando la tapa, ajustando los bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.

Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A partir de allí se cuenta el tiempo de esterilización, luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave nuevamente.

Este proceso de esterilización es el que mejor resultados dá en microbiología. El vapor de agua a fuerte presión actúa a mayores temperaturas:

Tiempos de esterilización en autoclave:

Del tiempo, temperatura y presión usados en la esterilización depende el éxito alcanzado. Generalmente los datos presión y temperatura son fijados, y el único factor que se varía es el tiempo. Los materiales necesitan diferentes tiempos de esterilización dependiendo de su textura, porosidad, y otras características propias de cada material. Algunos materiales como el hule, necesitan poco tiempo, mientras otros como el metal quirúrgico necesitan más. Los siguientes datos han sido tomados para una temperatura de esterilización de 250ºF (121ºC) a 15-20 PSI.

• Guantes de Caucho (Hule) 15 minutos

• Sondas (base tejida) 15 minutos

• Sondas (látex) 15 minutos

• Frascos de Vidrio, Cristalería en General 20 minutos

• Agua en frascos 20 minutos

• Jeringas de Vidrio 20 minutos

• Bandeja 30 minutos

• Equipo de transfusión 30 minutos

• Paquetes de maternidad 30 minutos

• Ropa 30 minutos

• Torundas 30 minutos

• Paquete quirúrgico 45 minutos

• Instrumental de acero inoxidable 45 minutos

*Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y bien ordenados, para que haya

buena penetración de vapor en el material.

No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilización. Ej. : Lencería y Vidrio.

El método utilizado para envolver los paquetes deberá garantizar el mantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento.

Como Cargar el Autoclave

a) Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulación de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo).

b) Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de material seco. Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rápido contacto del vapor con las superficies de las vasijas y su contenido. También facilita el secado.

c) Esterilizar los líquidos separándolos de otros materiales.

d) Cuando se esterilizan líquidos, debe hacerse con los recipientes destapados.

e) La cristalería deberá esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales (nunca con la boca hacia arriba).

CAPÍTULO 4

Tyndalización: Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndall Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones. Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.

Ventajas del calor húmedo:

• Rápido calentamiento y penetración
• Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
• No deja residuos tóxicos
• Hay un bajo deterioro del material expuesto
• Económico

Desventajas:

• No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

Ebullición: Durante mucho tiempo se "hirvieron" los utensilios y materiales quirúrgicos o jeringas hipodérmicas para esterilizarlas. El agua a 100 °C no garantiza una adecuada esterilización, no obstante posee la propiedad de desprender las colonias o los microorganismos y destruir aquellos que son susceptibles a ésta temperatura.

Un claro ejemplo de ello fue el sistema utilizado hasta hace pocos años para esterilizar jeringas de vidrio y agujas hipodérmicas de níquel con embocadura de bronce ó en el mejor de los casos, platino, hirviéndolos en agua.

FILTRACIÓN: Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos y gases, especialmente los primeros. Cuando el líquido a filtrar no puede resistir, sin descomponerse , la acción del calor, se aplica la técnica de filtración, la que puede efectuarse mediante presión o aspiración.

Se basa en el pasaje de líquidos a través de sustancias porosas que detienen a los microbios. Los antiguos filtros se fabricaban en forma de bujías que son cilindros huecos abiertos por una extremidad y cerrados por otra, de paredes de espesor variable.

La filtración se reconoció como técnica de esterilización a partir de las observaciones de Koch en 1893, con la epidemia de cólera y la presencia del vibrión en el agua. Esta observación fue ilustrada en la epidemia Hamburgo-Altona en 1892. El agua del río Elba, que contenía Vibrio comma pasaba a las cañerías de agua de Hamburgo. Solo aparecieron unos pocos casos de cólera en el suburbio de Altona, donde el agua del Elba era filtrada por arenas (nótese el plural, refiriéndose tal vez a varios grados de arena), antes de su distribución.

Los filtros de porcelana se llaman "de Chamberland" y los de tierras infusorias calcinadas se denominan "Berkefield"

En la actualidad se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice. La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

Existen tres tipos básicos de filtros: a- Filtros profundos o Filtros de profundidad: Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retención de las partículas se produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matriz.

b- Membranas filtrantes: Tienen una estructura continua, y la retención se debe principalmente al tamaño de la partícula. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos electrostáticos.

La firma Millipore ha desarrollado membranas de 0,45  y 14 cm de diámetro, con un soporte de papel siliconado para su protección debido a la fragilidad de la misma, la ue debe ser monada en un soporte estéril y que permita el ingreso del líquido a esterilizar a presión.

c- Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo): Son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro.

CAPÍTULO 5

MÉTODOS QUÍMICOS:

Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

En comparación con los procedimientos físicos, éstos métodos tienen una importancia secundaria. Los antisépticos son considerados venenos protoplasmáticos que, al actuar sobre los gérmenes, los destruyen. Algunos de ellos ejercen su acción nociva sobre todas las células, por lo cual se les considera venenos generales, por el contrario otros actúan sobre algunas especies bacterianas, mostrándose como venenos específicos. Este método es óptimo para la antisepsia de las manos del operador, de locales, de mesas de trabajo, de jaulas de animales, y para destruir gérmenes que puedan caer en lugares de trabajo.

AGENTES QUÍMICOS

La Iodopovidona (pervinox), el Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o Cloruro de Zefirano) son ejemplos de antisépticos útiles para desinfectar manos y superficies. Cuando la superficie es resistente, el mejor agente biocida es el Hipoclorito de Sodio (agua lavandina).

ESTUFAS DE ESTERILIZACION POR OXIDO DE ETILENO Destruye todos los organismos y microorganismos conocidos, incluso esporas y virus. Esteriliza sin deterioro artículos de goma, plástico, metal, madera, lana, piel, papel, productos farmacéuticos. Esterilización con embalajes: a este gas son permeables sustancias como polietileno, nylon, celofán, etc. En 1928, autores americanos: Bac, Cotton y Ellington; Schrader y Bossert y Autores alemanes: Gassner y Hase, descubrieron las propiedades del óxido de etileno. En 1933 fueron certificadas las propiedades del óxido de etileno en un laboratorio de La Sorbona y en 1939 se estudió en un laboratorio de investigación del Ejercito de U.S.A. El óxido de etileno era bactericida, esporicida, con gran poder de penetración, efectivo a bajas temperaturas y penetra sustancias porosas; para evitar su poder explosivo y su alto potencial inflamable se mezcló con CO2 en una proporción de 7,15 veces el volumen de óxido de etileno. Trabajo de Phillips y Kaye. El tiempo de esterilización que requiere el material depende de múltiples variables, el vacío que se produce, la humedad, la concentración del gas expresado en gs./l y la temperatura, es decir que reduciendo la temperatura aumenta el tiempo de exposición requerido. El gas se adquiere en botellas metálicas o cartuchos que se vaporizan, cambian de líquido a gas a 10º C. Todos los artículos deberán airearse por 6 hs. después de una esterilización. El Oxido de etileno es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plastico, papel, etc.), equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerigeno.

Con aldehídos Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas, provocando una modificación irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimática. Estos compuestos destruyen las esporas.

Glutaraldehído: Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos. Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Puede esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc.

Formaldehído: Se utilizan las pastillas de paraformaldehido, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón, que después pueden ser expuesta al calor para un rápida esterilización (acción del gas formaldehído). También pueden ser usadas en Estufas de Formol, llamadas también de formalina, que son cajas de doble fondo, en cuya base se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden esterilizar materiales de látex, goma, plásticos, etc. Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.

CAPÍTULO 6

RADIACIÓN: Su acción depende de:

• El tipo de radiación
• El tiempo de exposición
• La dosis

Radiaciones Ionizantes: Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas

descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos.

Rayos Ultravioleta: Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilización en quirófanos.

Rayos Gamma: Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energia atomica. Este tipo de esterilización se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas, alimentos, etc.

Control de calidad: La correcta esterilización se puede controlar mediante dos métodos, siendo el segundo el más seguro. Indicadores: Cintas comerciales que se colocan en el paquete o caja a esterilizar, que viran de color, cuando se alcanzan las temperaturas adecuadas para la esterilización.

Se describe la composición de los llamados "testigos de esterilización" preparadas por sustancias químicas.

1- Mezcla de Demande:

Safranina…………… 0,01 g.

Benzonaftol……….. 100,00 g.

Ésta mezcla se colorea de rojo cuando sufre una temperatura de 110 °C.

2- Mezcla de Gérard:

Fucsina……………. 1 g.

Benzonaftol………..250 g.

Esta mezcla toma un color rojo rubí a 110 °C.

3. Mezcla de Gérard

4. Verde Brillante……… 1 g.

   Acetanilida…………100 g.

   Esta mezcla es azul a la temperatura ordinaria, a 115 °C toma un color verde oscuro)

5. Mezcla de Gérard

Metil Violeta………..1 g.

Hidrato de Terpina….100 g.

Mezcla violeta pálido que a 117 °C se vuelve violeta oscuro.

Las mezclas se colocan en ampollas y se cierran a la lámpara, colocándose junto con el material a esterilizar.

Pruebas de cultivo:

También pueden colocarse gérmenes vivos, especialmente esporulados y los que presentan mayor resistencia como el bacilus subtilis o el b. Mesentericus de la papa (también responsable de la filamentación en el pan), esterilizándose conjuntamente con el material para luego sembrar una suspensión de los gérmenes para observarse en agar nutritivo a las 24 Hs. Si existe o nó desarrollo de colonias.

Bibliografía:

1-Carlos M. Barzizza – Microbiología – Tomo 1 y 2– Librería Hachette, Bs. As, 1960.

2-Microbiología de ZINSSER. Revisada por Smith y Martín. UTHEA, 1970.

3-Catálogo Cole – Parmer 2002.

4-Catálogo Sigma, 2002.

5-Téchnique de Sterilisation. (texto en Francés) Ern. Gérard, Paris, Vigot fréres, 1950.

6- A manual of Bacteriology – H. Williams- Blakiston’s son & Co, 1919.-

7- Catálogo Cat-Lab. Editorial Elefantre, 2003-2005.

8- Deutsche Gesellchaft fur thechnische. Proyecto de mantenimiento hospitalario. S. Salvador, Marzo de 1997.-

9- Material publicado en internet.

9-Notas, experiencias y material personales.

Ricardo Botta

Técnico en Electromedicina – Químico.

2004.