Métodos rápidos para la identificación de Shigella

Objetivo: identificar y prevenir la presencia de Shigella en los alimentos muy manipulados como carne o verduras utilizando métodos rápidos para la identificación de dicha bacteria.

Se desea comprobar si existe presencia de la bacteria Shigella en alimentos, específicamente en verduras y carne, ya que son alimentos muy manipulados y están expuestos al aire libre, estas condiciones propician la contaminación del alimento y el crecimiento de dicha bacteria, es así que se pretende realizar una toma de muestra en diferentes establecimientos como son carnicerías o puestos en el mercado, dicha muestra será analizada con métodos rápidos de identificación, en caso de existir presencia de esta bacteria, poder prevenir enfermedades y el crecimiento de Shigella en este tipo de alimento.

Hipótesis: la identificación de Shigella en los alimentos (verduras y carne) ayuda a disminuir los factores que incrementan el desarrollo de la bacteria.

Generalidades

Shigella es un bacilo gran negativo aeróbico no móvil que se transmite de persona a persona por la ruta fecal-oral, requiriendo una pequeña carga de microorganismos de (10 a 100 bacterias) para causar infección siendo el hombre su único hospedador natural, Se reconocen cuatro grupos de esta especie: S. dysenteriae, S.flexneri, S.boydi y S.sonnei las cuales son la principal causa de disentería (diarrea caracterizada por eliminación frecuente de heces, conteniendo pus, sangre y/o mucus) y son causa común de gastroenteritis bacteriana. (Cabrera. Et al. 2005). Es frecuente en los países tropicales y subtropicales en desarrollo, además es una importante causa de mortalidad en los países en vías de desarrollo, lo que representa alrededor del 25% del total de las defunciones que ocurren en los niños menores de 5 años en el mundo (Martínez. Et al. 2008). La enfermedad causada por Shigella se conoce como shigelosis o disentería bacilar.

El número de personas infectadas por Shigella cuyo origen fueron los alimentos es bajo comparado con salmonella y campylobacter. En países avanzados los causantes de shigelosis en alimentos son principalmente sonnei en torno al 70% y flexneri aproximadamente el 25%.

El alimento desempeña un papel importante únicamente como vector inespecífico. Se ha demostrado que los productos siguientes han tenido un papel epidemiológico:

• 1. Los alimentos ni excesivamente ácidos ni excesivamente secos para permitir el crecimiento, o al menos la supervivencia de las shigellas.

• 2. Los productos muy manipulados, como las carnes cortadas, los sándwiches y las ensaladas.

• 3. Los alimentos que se han dejado durante un tiempo a temperatura ambiente.

• 4. Los alimentos que se consumen sin cocción o cocinado adicional, incluye los sándwiches, las ensaladas y los alimentos marinos pelados y cocidos.

Muchos de los casos de shigelosis transmitida por los alimentos no se han declarado oficialmente, la mayor parte de los mismos pueden transcurrir sin ser detectados (Mossel. Et al.2007).

Las pruebas de identificación bioquímicas estándar y las técnicas serológicas constituyen los métodos de detección rutinaria de Shigella sp.

El personal infectado que maneja los alimentos es la fuente más frecuente de la contaminación de los alimentos por Shigella por lo que una buena higiene personal es necesaria para controlar al microorganismo (León.2002)

Shigella dysenteriae

Las cepas de Shigella dysenteriae serotipo 1 difieren de otras cepas de Shigella por varias razones:

• Solo S. dysenteriae 1 causa epidemias de disentería grandes y prolongadas.

• La infección con S. dysenteriae 1 causa enfermedad con mayor letalidad que las infecciones producidas por otros grupos de Shigella.

• La resistencia a los antimicrobianos se desarrolla más rápidamente y ocurre con mayor frecuencia cuando se trata de cepas de S. dysenteriae 1 que con otros grupos. (Bopp. Et al. 2004)

Con frecuencia origina una diarrea profusa y teñida de sangre. Además de producir la toxina Shiga (potente neurotóxica, que determina convulsiones y es responsables de la acumulación de líquidos en el asa intestinal y de la diarrea acuosa que puede observarse en la fase inicial de la Shigelosis) que puede provocar trastornos sistémicos profundos. (Mossel. Et al.2007)

Ecología

Shigella Invade las células epiteliales del intestino grueso y la porción distal del intestino delgado, alcanza las submucosas del colon y es capaz de ulcerar esos tejidos. (León.2002)

Patología

Una vez que el individuo ingiere el microorganismo este debe fijarse al intestino delgado y multiplicarse; en esta etapa no se observa ningún fenómeno clínico y los síntomas solamente aparecen después de que la bacteria se traslada a través del epitelio, se multiplica formando cúmulos bacilares en el interior de la pared se presenta la inflamación, la lesión progresa y desciende al colon dando lugar a fenómenos hemorrágicos, necrosis y a la formación de ulceras. Las manifestaciones clínicas pueden variar pero algunos de los síntomas incluyen diarrea, dolor abdominal, fiebre y vomito (León.2002).

Esta bacteria tiene un periodo de incubación relativamente corto, generalmente de unas 48horas, pero varía de 7 a 66 horas, Predomina en los meses de verano y la trasmisión intrafamiliar ocurre frecuentemente. (Mossel. Et al.2007)

La temperatura optima de crecimiento de los agentes causales es de 37oc, creciendo dentro de un intervalo de temperaturas comprendido entre 10 y 40oc. Estos microorganismos toleran concentraciones de sal del 5 al 6 % y son relativamente termosensibles también liberan una endotoxina de naturaleza polisacarídica que ataca la mucosa intestinal (Frazier. Et al. 2001).

Para el tratamiento de la shigelosis y cualquier enfermedad diarreica la primera consideración en tratar es la corrección de las anormalidades que resulta de la deshidratación: la acidosis metabólica y la pérdida significativa de potasio, aunque la deshidratación severa es rara en shigelosis, con hidratación apropiada la shigelosis es generalmente una enfermedad autolimitada. La decisión para prescribir antibióticos es indicada por la severidad de la enfermedad, la edad del paciente y la probabilidad de mayor transmisión de la infección. Los antibacterianos (trimetropim-sulfametoxazol, ciprofloxacina u ofloxacina en adultos sulfametoprim-sulfametoxazol, ampicilina o acido nalidíxico en niños) acortan el curso de enfermedad y su intensidad y la duración de la excreción del agente patógeno; deben utilizarse en aquellos casos que lo justifiquen la gravedad de la enfermedad, o como la protección a los contactos (como guarderías o instituciones) cuando este indicado desde el punto de vista epidemiológico. La elección de medicamentos específicos dependerá del antibiograma de la cepa aislada o de los patrones de sensibilidad local a los agentes antimicrobianos. (León, 20002).

Métodos rápidos

Los métodos rápidos para la identificación de de para Shigella pueden ser los siguientes:

 Métodos de PCR: se realizan en Kits de PCR (The PrimerDesign) utilizados para la detección y cuantificación simultánea de varios patógenos importantes, este método consiste en  realizar un número de copias de la curva estándar que se proporciona para la cuantificación mediante una plantilla de la extracción interna (ADN o ARN), como controles de la calidad de la extracción de ácidos nucleicos, además elimina los resultados falsos negativos.

Otro método rápido es la técnica de epifluorescencia la cual es una forma de identificación de microorganismos por la emisión de colores, causada por la longitud de onda que emiten las muestras al aplicarles fluorocromos (sustancias fluorescentes). Esta técnica se basa en la filtración de la muestra a través de una membrana de policarbonato donde quedan retenidos los microorganismos (la muestra previamente se trata con detergentes y enzimas proteolíticas con el fin de evitar la saturación del filtro con partículas del alimento). Posteriormente, la membrana se tiñe con naranja de acridina, que es un fluorocromo nucleofilico que origina distintos patrones de fluorescencia en el ADN y el ARN dependiendo de la fase de crecimiento celular. Los filtros teñidos se observan en un microscopio de fluorescencia y los recuentos de microorganismos se obtienen mediante el contaje de las partículas fluorescentes en un número determinado de campos de fluorescencia. Las células viables emiten una fluorescencia que va del naranja al rojo y las células muertas emiten fluorescencia verde. (Martin)

También se pueden utilizar las APIS las cuales son kits de pruebas bioquímicas que se componen de diferentes pocillos donde se agrega la muestra y determina la presencia de ciertas bacterias. La muestra es colocada en los pocillos de los kits para identificar a la bacteria y conocer si el número de bacterias presentes son causa alarmante para la salud de los que consumen este tipo de alimentos.

Técnicas de identificación

Otra manera de identificar a la bacteria Shigella es mediante su aislamiento en medios de cultivo. Para un aislamiento óptimo de este microorganismo, deben utilizarse dos medios selectivos diferentes: uno de siembra para propósitos generales de baja selectividad, como el AMC (Agar MacConkey), y otro de agar más selectivo, como es el agar DXL (Agar desoxicolato xilosa lisina). No se debe utilizar agar SS (agar salmonella-Shigella), porque frecuentemente inhibe el crecimiento de S. dysenteriae serotipo 1. (Bopp. Et al. 2004)

Después de obtener las muestras, los medios selectivos se pueden inocular utiliza hisopos o el asa de siembra. Cuando se inoculan las muestras a una placa para aislamiento, la superficie completa de la placa de agar debe ser utilizada para aumentar las oportunidades de obtener colonias bien aisladas. Los medios de alta selectividad (por ejemplo, DXL) requieren, cuando se estrían, más solapamiento que los medios de baja selectividad (por ejemplo, AMC), por lo cual debe prestarse especial atención al estriado. Después de la incubación, registre la cantidad y el tipo de crecimiento (por ejemplo, si fermenta o no fermenta la lactosa ya que con esta bacteria no existe fermentación). En AMC las colonias de Shigella aparecen convexas, incoloras, de aproximadamente 2–3 mm de diámetro, aunque las colonias de S. dysenteriae 1 pueden ser más pequeñas. Las colonias de Shigella en agar DXL son de color rosado a rojo, transparentes, lisas, de aproximadamente 1 a 2 mm de diámetro, aunque las colonias de agar DXL de S. dysenteriae 1 son frecuentemente diminutas. Seleccione las colonias sospechosas de las placas de AMC y agar DXL e inocúlelas en medios de pesquisaje apropiados, tales como agar hierro de Kligler (AHK) o agar hierro triple azúcar (AHTA).

Para el AHK o el AHTA Seleccione cuidadosamente al menos una colonia bien aislada de cada tipo en cada tipo de placa de las que fueron estriadas para aislamiento, con una aguja de inoculación toque ligeramente solo el centro de la colonia sin tocar el resto de la colonia ni la superficie de la placa porque si lo hace, puede tomar contaminantes que podrían estar en la superficie del agar.

Materiales y métodos

Materiales:

-Guantes.

-Cubre bocas.

-bolsas estériles.

-cloro.

-2 cajas petri.

– 2 tubos de ensayo

-Medios de cultivo (DXL, AMC y AHK).

– agua

– mecheros de bunsen.

-Soporte universal.

-anillo de hierro.

-gradilla

-1 Matraz

-1 agitador

-1 bascula granataria.

-Muestra (lechuga y carne)

MÉTODO:

Primero se realizan los medios de cultivo, se mide la cantidad de agua a utilizar y se pesan las concentraciones de agar para cada una de las mezclas, después se calienta el agua y se le agrega el agar , esta solución es llevada a ebullición (100oc) y posteriormente se deja enfriar, cuando baje la temperatura a 40oc es vaciada en las cajas petri( de cada tipo de agar DXL y AMC) y los tubos de ensayo (AHK) (Los tubos deben dejarse de manera inclinada) se deja que el medio se solidifique, si el medio de cultivo no se utiliza después de que se solidifique se debe llevar a refrigeración. Teniendo los medios de cultivo se procede a obtener la muestra, la cual se adquiere del sitio de estudio (puesto del mercado), estas son colocadas en bolsas estériles y llevadas al laboratorio (las áreas a utilizar son de desinfectadas con cloro).

La muestra es homogeneizada (son disgregados sus tejidos y se rompen sus células) y es utilizada para inocular las cajas petri. La inoculación consiste en esparcir la muestra homogeneizada en el medio selectivo DXL y AMC realizando un estriado, posteriormente se cubre la placa después de haberla estriado y se coloca la placa de agar con la tapa hacia abajo (invertida) en la incubadora para evitar el exceso de condensación. Se Incuban las placas durante 18 a 24 horas entre 35°C y 37°C. (Bopp. Et al. 2004)

Después de obtener colonias de Shigella aisladas (se presentan en color rojo) se selecciona una con el asa de siembra (de cada una de las placas estriadas) y se toca ligeramente solo el centro de la colonia para evitar tomar contaminantes que podría estar en la superficie del agar Para inocular los tubos de AHK se pincha el extremo (tope) y se estría la superficie de la cuña. Después de incubar por 18 a 24 horas a 35°C–37°C, se debe observar la superficie inclinada del agar para ver las reacciones típicas de Shigella. La presencia de Shigella en AHK no produce gas, la cuña es de color rojo con fondo amarillo (Bopp. Et al. 2004).

También se pueden comprar algunos métodos rápidos para la identificación de Shigella para ahorrar tiempo y es una manera más fácil de saber si la muestra está contaminada.

Posibles resultados

Se encontraron bacterias de Shigella en la muestra pero la cantidad no es lo suficientemente grande para causar grandes daños o el desarrollo de la enfermedad, aun así se debe tener cuidado e identificar el área de mayor contaminación.

Referencias bibliográficas

Bopp, Cheryl, Gloria Ajello,MS, John Elliott, PhD Richard Facklam, PhDoan S. Knapp, PhD, Tanja Popovic, MD PhD Joy Wells, MS. 2004 Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. (Salmonella serotipo Typhi, Shigella y Vibrio cholerae). Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades: Centro Nacional para las Enfermedades Infecciosas Y Organización Mundial de la Salud, Enfermedades Transmisibles: Vigilancia y Respuesta, pp.131-135.

Cabrera. C .C., Purizaca. F.R., León P. A. y Celis s. J. Sepsis por Shigella flexneri. Revista peruana de medicina experimental y salud pública, abril-junio vol.22, núm.002, 2005, Instituto Nacional De Salud. Lima, Perú, pp.145-147

Frazier. W.C y D.C.westhoff. 2001. Microbiología de los alimentos. Editorial ACRIBIA, México.

León Ramírez Sergio, shigelosis (disentería bacilar), salud en Tabasco, abril vol. 8, núm. 001,2002. Secretaria.

Martin, S. R. Métodos rápido y automatizado aplicado al análisis microbiológico de los alimentos, Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.

Autor:

Guillermina