La plantación primaveral parece dar plantas de mayor vigor en relación con la otoñal y además de ocupar el terreno menos tiempo, reduce el período de exposición a los ataques de parásitos y a la reinfestación.
Las distancias de plantación pueden ser menores en relación con la plantación otoñal, y tanto más cuando se desee efectuar en estación más avanzada para aumentar la producción utilizándose a tal fin plantas madres frigoconservadas.
Las plantas hijas que se desarrollan al principio del período de estolonización cuando los días son largos y la temperatura suficientemente elevada, alcanzan la madurez con anterioridad a las que se forman después.
Las plantas madres para estimular la formulación de muchos estolones, mientras que el enraizamiento de éstos se activará regando por aspersión el substrato sobre el que se desarrollan las plantitas solamente 40 – 60 días antes de su utilización para evitar un excesivo desarrollo de las raíces que dificultaría el arranque y preparación de las plantas.
2.- CLAVEL El clavel se puede multiplicar por semilla y por esqueje. La reproducción por semilla esta reservada a la obtención de nuevas variedades, por ser el clavel híbrido refloreciente, extremadamente heterozigótico y, por tanto, su descendencia por semilla sería totalmente irregular. El único sistema empleado comercialmente es por esqueje.
El esqueje es un brote con dos o tres de hojas bien formadas y el resto en desarrollo, capaz de emitir raíces por su parte inferior. Este se sacará de la parte media de la planta madre por considerarse defectuosos los esquejes muy cerca de la base o del ápice, los primeros, por su escasa tendencia a producir tallos florales, y los segundos, por su tendencia a un prematuro crecimiento en altura y a la formación precoz floral.
Un buen esqueje tiene una consistencia no demasiado leñosa ni excesivamente herbácea, posee cinco – seis pares de hojas y un largo que depende de la variedad y oscila de cuatro – cinco hasta ocho – nueve centímetros Al clavel le afectan muchas enfermedades producidas por hongos, bacterias y también virus. Por tanto, no cabe duda de que hay que partir de una planta madre en perfecto estado para obtener los esquejes que luego proporcionarán plantas sanas con buenos rendimientos.
Para seleccionar los esquejes no basta con tomar esquejes de plantas de apariencia sana, ya que a pesar de su aspecto, pueden tener algún germen interno durante el cultivo afectando a las plantas.
Las plantas libres de virus no se destinan a la venta, sino que sirven como material inicial para obtener plantas madres. Se cultivan en invernaderos aislados, libre de infecciones y pulgones. Los esquejes se obtienen después de diez a doce meses de la planta madre.
A.- RECOJIDA DE ESQUEJES El número de despuntes que se hace a la planta madre está en función de si se tienen o no frigorífico para conservar los esquejes y la época en que interese enraizarlos. Por lo menos se deben dar dos despuntes a la planta madre , para que ramifique bien. Cuando no se tiene frigorífico se suelen dar tres para tener una buena tanda de esquejes para enraizar en un momento dado. Los dos despuntes se hacen sobre una medida de cuatro pares de hojas.
Los esquejes deben tener de dos o tres pares de hojas bien desarrollados. Se recolectan con la mano ( para evitar trasmisión de enfermedades), dejando un par de hojas en la planta para que vuela a brotar de nuevo otra tanda. Se debe tener la precaución de no dejar a la planta madre desnuda, sino que deben dejarse algunos brotes para la próxima recogida, ya que en caso contrario la planta madre se endurece mucho.
La frecuencia de la recolección depende del número de plantas, pero hay que tratar de que sea semanal para aprovechar los que están a punto. Esta operación, como los despuntes, debe hacerse por la mañana, cuando las plantas estén frescas.
El promedio de esquejes por planta es diferente según la variedad y la duración de la época del esquejado, variando entre 12 y 30 esquejes buenos por planta, como media general.
Los esquejes de plantas madres jóvenes enraizan más rápidamente y tienen luego mejor desarrollo que los procedentes de plantas viejas, por lo que los límites de duración del cultivo para planta madre está en los doce o como máximo quince meses.
B.- CALIDAD DEL ESQUEJE Para evitar daños en la planta madre, se deben coger los esquejes con las dos manos, y mientras una sostiene a la planta la otra corta el esqueje .
Todos los esquejes deben tener apariencia sana. Los que tengan manchas de enfermedades en la hojas deben ser desechados, lo mismo que los que hayan espigado mucho con tendencia a formar flor pronto.
C.- ENRAIZAMIENTO El esqueje de clavel guarda muy pocas reservas, por lo que si no se tienen ciertas precauciones se puede secar antes de que forme las raíces.
El enraizamiento se debe hacer en una instalación que los protege del sol y del viento, o sea, en invernadero, cajoneras o túneles de plástico. La humedad ambiente debe ser bastante elevada. Para favorecer el mantenimiento de esta humedad relativa puede blanquearse la cubierta, con cal y un poco de sal de cocina para que se adhiera más si es de cristal, y si es de plástico con pintura plástica blanca.
El sustrato, donde vamos a colocar los esquejes, debe ser un medio inerte, poroso y no tener gérmenes de enfermedades, porque la raíz del clavel necesita mucho oxígeno y no admite agua estancada que pudriría los esquejes. Se utilizan muchos materiales de origen volcánico como perlita, vermivulita, piedra pómez, picón, etc., formando gránulos pequeños, también arena de río o barranco. La perlita es muy usada, sobre todo por su menor peso y porque no se rompen las raíces al sacar el esqueje para el transplante, cosa que ocurre con frecuencia cuando se emplea turba solamente.
II.- CULTIVO IN VITRO Es una técnica que usa para propagar plantas a partir de plantas madres por lo que las plántulas obtenidas son idénticas entre si a la planta madre.
El cultivo de vegetales superiores se inicio hace mas de medio siglo y es en eta época que alcanza importancia en la agricultura, en la obtención de nuevas variedades y por la multiplicación vegetativa a escalas industriales.
Ventajas 1.- La multiplicación in vitro es masiva y más rápida .
2.- A veces es posible propagar especies in vitro, que no pueden ser multiplicadas en forma tradicional; esto es posible al fenómeno de rejuvenecimiento, que sólo es posible realizarlo in vitro.
3.- El crecimiento de las plantas propagadas in vitro es frecuentemente más vigoroso que el de las clonadas in vivo; esto se debe sobre todo al rejuvenecimiento y / o al hecho de que las plantas in vitro se encuentran libres de enfermedades.
4.- Utilizando el cultivo in vitro es posible, conseguir una multiplicación libre de enfermedades, bien por una rigurosa selección del material inicial, o bien liberando el material inicial de enfermedades.
5.- Homogenidad del material.
6.- Multiplicación todo el año. Porque se trabaja en condiciones ambientales controladas.
7.- Ya que se necesita una cantidad de material relativamente pequeña para iniciar un cultivo in vitro, se puede realizar una cuidadosa selección del mismo.
8.- Ahorro de espacio con respecto de los sistemas tradicionales.
9.- Conservación del material genético.
10.- Fácil transporte e intercambio de material vegetal.
Desventajas 1.- En algunos sistemas de propagación in vitro la estabilidad genética es débil.
2.- Las plantas producidas in vitro pueden mostrar características poco convenientes in vivo: Excesiva producción de ramas laterales y paso total a la fase juvenil.
3.- La aclimatación de las plántulas es un proceso díficil y puede que muchas veces, los mayores porcentajes de la pérdida se presenten en esa etapa.
4.- Díficil respuesta inicial de algunas especies y genotipos.
5.- Variación de respuesta entre los genotipos.
6.- Alto costo de establecimiento de un laboratorio, lo que incide indirectamente en el precio final de la planta producido de esta manera.
7.- Necesidad de una mano de obra especializada.
I.- CULTIVO DE MERISTEMOS A.1 PRODUCCIÓN DE PLANTAS LIBRES DE VIRUS Una de las características necesarias para la propagación es que las plántulas obtenidas deben estar libres de virus. Se sugiere que por medio del cultivo de meristemos, se obtienen de forma automática plantas libres de virus, pero en realidad no ocurre así. Las investigaciones llevadas a cabo por More (1960) con Cymbidium, demostraron que se obtenían plantas libres de virus, sólo en el caso de que se utilizen meristemos ( de aprox. Un 1 mm) con dos primordios foliares. El clonado que se hace actualmente, con porciones apicales de vástago mucho más grandes que la utilizadas por Morel, tiene pocas probabilidades de producir plantas libres de virus.
Existen 5 métodos utilizados para producir planta libres de virus:
1.- Tratamiento por calor El tratamiento por calor es un método eficaz de inactivar algunos virus. El tratamiento por calor es eficaz solamente contra virus isométricos y contra los micoplasmas. El hecho de que el tratamiento por calor sea a veces ineficaz, puede ser debido a que la planta sea demasiado sensible al calor, o q que los virus y micoplasmas no sean afectados por el calor, por razones desconocidas. Se debe elegir una temperatura y tiempo de tratamiento tales que la planta (vástago, rama) sea capaz de sobrevivir, pero que permita la inactivación del virus.
El tratamiento por calor es especialmente eficaz contra virus y micoplasmas que se encuentran en frutales, caña de azúcar y mandioca. Este tratamiento resulta muy interesante en el caso de los árboles frutales, donde el cultivo de meristemos es díficil.
En el caso de especies leñosas, en lugar de limpiar toda la planta de virus con el tratamiento térmico, se tratan sólo las yemas axilares. En estos casos, una rama injertada sobre una plántula se toma generalmente después de haber crecido durante 20 – 40 días (preferibles algunos meses), a una temperatura constante o alternada de 37 – 38 º C; las yemas potencialmente libres de virus, se aislan e injertan sobre un patrón (plántula), libres de virus. Este método suele producir un porcentaje relativamente alto de plantas libres de virus.
Se pueden obtener
2.- Cultivo de Meristemos Para la realización es aconsejable usar vástagos en crecimiento, siempre que sea posible, cuando se vaya a hacer cultivos de meristemos ( Fig.1); cuando el meristemo que se va a aislar está activo ( compuesto de una zona meristemática y una subapical que crece rápidamente), la posibilidad de eliminar virus es mayor.
Los vástagos se debe limpiar cuidadosamente, de forma previa. Se retiran las hojas de los vástagos, siempre que sea posible, y entonces los vástagos ( o yemas, si no se han retirado las hoja) se sumergen durante un momento en alcohol de 70 % para eliminar el aire que pueda haber atrapado. Después de estos e realizan la esterilización en lejía diluída o Ca(OCl)2, aclarando finalmente con agua estéril. Se retiran entonces algunas hojas, trabajando con la ayuda de un estereomicroscopio (aumento de 20 – 40 x). Se continua el proceso de esterilización, utilizando concentraciones más bajas de lejía, o con tiempos más cortos de esterilización, aclarando posteriormente con agua estéril. En algunos laboratorios, se usa alcohol de 70 % (v/v) para la segunda esterilización, no haciéndose en este caso ningún aclareo más. S i se emplea agua para el aclarado, es posible que las gotas dificulten el aislamiento. Se retiran entonces uno por uno los primordios foliares y hojas restantes, trabajando con la ayuda del estereomicroscopio, y utilizando frecuentemente es esta operación agujas o fragmentos de cuchilla de afeitar, montados sobre el mango de aguja de siembra. El ápice del vástago se mantiene firmemente con una mano (pinza o dedos limpios), mientras que la operación se realiza con la otra mano. La aguja se debe esterilizar de forma libre, junto con uno o dos primordios foliares (generalmente un pequeño cubo de material), se corta usando una cuchilla de afeitar, y se siembra inmediatamente ( para evitar que se seque), sobre un medio nutritivo. Para impedir la deshidratación del meristemo, se debería emplear luz fría, para ilumina el campo en el que se trabaja con el estereomicroscopio. El meristemo con los primordios foliares es muy pequeño ( 0.1 mm de diamétro; 0.2 – 0.4 mm de longitud).
Existe una mayor posibilidad de obtener plantas libres de virus, si sólo se aisla el meristemo; la posibilidad de que un meristemo sobreviva sin primordios foliares, es muy pequeña, como se ha demostrado en el caso de clavel. Por otro lado, el aislamiento de meristemos más grandes ( con primordios foliares), hace que la posibilidad de obtener plantas libres de virus sea muy pequeña.
Aunque en principio todos los meristemos de vástago de una planta son adecuados como material inicial, en realidad, la posibilidad de éxito depende del tipo de yema o vástago ( terminal o axilar) y / o de la posición de la yema (basal o terminal).
La composición del medio nutritivo es compleja, ya que un meristemo es una porción mínima de la planta. Cada especie vegetal diferente, e incluso distintas variedades de una misma especie pueden requerir un medio diferente. El medio de aislamiento no es generalmente el mismo que el de enraizamiento. Debido a que la elección del medio adecuado requiere un gran esfuerzo, el cultivo de meristemos debería ser utilizado exclusivamente cuando un clon está completamente infectado y cuando el tratamiento por calor no produce efecto deseado.
Los meristemos se aislan sobre medio sólido, aunque en algunos casos se utilizan medios líquidos. El pH por lo general se sitúa entre 5.4 y 6, siendo la sacarosa el azúcar habitual ( 2 – 5 % p/v). Frecuentemente se utiliza vitaminas: Vitamina B1, piridoxina, ácido nicotínico, ácido pantoténico Los reguladores suelen utilizarse en bajas concentraciones ( o.1 – 0.5 mg l -1); la auxina puede ser necesaria para la formación de raíces, auxinas y citokininas para estimular la división celular; el GA3 se añade a veces para lograr la elongación del vástago. La temperatura normal de crecimiento es de 21 – 25 ºC; aunque la mayor parte de las plantas bulbosas requieren una temperatura más baja Temperaturas más altas ( 35 – 39 o C) se utilizan solamente, para inactivan al virus. Los meristemas se cultivan generalmente con la luz fluorescentes (longitud del día de 14 – 16 horas, irradianc alrededor de 8 – 12 W m2); a veces la luz fluorescente se suplementa con algo de luz roja. En ocasiones es necesario utilizar una irradiación más baja, durante los primeros días después del aislamiento.
A veces puede surgir el problema de que el meristemo produce un buen vástago, pero sin raíces. Morel ( 1964) resolvió este problemas, en dalias, injertando el vástago libre de virus, obteniendo in vitro, sobre una plántula libre de virus. Cuando la planta se hace mayor, es posible obtener esquejes sin problemas. En caso de que no se tenga más que un vástago libre de virus , es posible estimular el desarrollo de yemas laterales, de manera que se puedan obtener así más vástagos libres de virus.
3.- Tratamiento por Clon y cultivo de Meristemos Para aumentar las posibilidades de obtener plantas libres de virus en los casos díficiles ( especialmente cuando hay mas de un virus presente), se da con frecuencia por calor, al principio del cultivo de meristemos; así se puede disminuir la concentración de virus y/o aumentar la zona libre de virus. La duración del tratamiento por calor ( 35 – 38 ºC) puede ser entre 5 y 10 semanas. Este procedimiento ha sido utilizado con éxito en papa, crisantemo, clavel y fresa. Morel aconsejó que se almacenen los tubérculos de papa, a 37oC, durante un mes, antes de iniciar el cultivo de meristemos.
4.- Formación de vástagos adventicios , seguida de cultivo de meristemos. La obtención de plantas libres de virus, por el método de los vástagos adventicios in vitro, ha tenido éxito con azucena y también jacinto. Los explantos de brácteas de azucena, infectados con virus, regeneran bulbillos in vitro; cuando el tamaño de los meristemos es de alrededor de 1mm se transfieren a otro medio para su posterior desarrollo. Hakkaart et al. (1983), indicaron que utilizando el método de vástagos adventicios, combinando con el del cultivo de meristemos, se podían producir plantas de Kalanchoe. Yucatan, libres de síntomas de virus.
El método de los vástagos adventicios, se utiliza de diferentes forma, para obtener plantas libres de virus, con algunas otras especies como petunia, tabaco y col. En estas plantas se puede ver como alunas áreas de sus hojas se encuentran libres de virus, mientras que la planta como conjunto se encuentra infectada. Se obtuvieron plantas libres de virus aislando áreas no infectadas y regeneradas a partir de vástagos adventicios.
Si i el método de vástagos adventicios se utiliza con plantas que presentan quimeras, como Pelargonium variegado, esta forma variegada se pierde, ya que la formación de vástagos adventicios generalmente tiene lugar a partir de una única célula ( o capas de células).
5.- Plantas libres de virus obtenidas a partir de callos y protoplastos. En 1962 Cooper demostró que después de unos cuantos repicados, los callos de tabaco puedan quedar libres de virus; aparentemente los callos pueden escapar a la infección vírica; las células meristemáticas, activas y jóvenes, son mucho más resistentes al TMV que la células mas viejas e inactivas. Los resultados de la investigación de Cooper, fueron mas tarde corroborados por Chandra y Hildebrandt ( 1967). Abo – El – Nil y Hildebrant ( 1971) aislaron anteras de Pelargonium, y obtuvieron de ellas callos y plántulas que resultaron libres de virus; el mismo resultado se consiguió con callo de papa que se infectó con el virus X de la papa. Walkey ( 1978) afirmó que se podía liberar de virus el callo de Nicotiana rustica, con un tratamiento por calor.
Mori et al. ( 1982) aislaron protoplastos de hojas de tabaco infectadas con TMV; a partir de esos protoplastos regeneraron plantas libres de virus. También se obtuvieron plantas libres de virus, a partir de protoplastos aislados de la zonas verdes oscuras, con pocas o ninguna partícula vírica, de hojas de tabaco infectadas con TMV.
Sin embargo, poco realista pensar que la producción de plantas libres de virus, por medio de callos y protoplastos, pueda tener importancia práctica, ya que en este tipo de cultivos las mutaciones son muy frecuentes.
6.- Injerto de Meristemos sobre patrones ( plántulas), libres de virus ( micro – injerto) En el caso de que un meristemo no cresca, o un vástago obtenido por cultivo de meristemos no sea capaz de formar raíces, es posible injertar el meristemo sobre un patrón plántula) libre de virus, y que se cultiva o multiplica in vitro. El micro – injerto resulta de gran importancia en el caso de especies leñosas, ya que en este grupo el cultivo de meristemos es frecuentemente imposible. Los primeros micro – injertos con éxito fueron llevados a cabo por Murashige et al. ( 1972) y por Navarro et al. ( 1975), que ,, trabajando con Citrus, consiguió eliminar dos virus.
En el caso de albaricoquero y la vid, antes del micro – injerto se realizó un tratamiento por calor. Jonard et al. ( 1983) , y Kartha ( 1986), han valorado las posibilidades de micro – injertos en frutales. Para tener una visión amplia sobre fenómenos de incompatibilidad que tienen lugar durante el micro – injerto.
A.2.- PRODUCCIÓN DE PLANTAS LIBRES DE HONGOS Y DE BACTERIAS POR CULTIVO DE MERISTEMOS Se pueden obtener también plantas libres de hongos y de bacterias por el cultivo de meristemos. Los géneros importantes de bacterias que se pueden eliminar son : Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas y Bacillus. Los géneros mas importantes de hongos son : Fusarium, Verticillium, Phialaphora y Rhizoctonia. Se puede utilizar un medio rico en nutrientes, en algunas ocasiones conteniendo peptona, triptona y extracto de levadura, para determinar de una forma rápida si una planta esta libre o no de bacterias y hongos.
Citaremos algunos trabajos realizados en la producción de plantas libres de hongos y bacterias por cultivo in vitro.
B.- Propagación por cultivo de Meristemos De acuerdo con Champagnat ( 1977), Rao (1977), y Fast ( 1980), se deberían utilizar como material inicial, para el cultivo de meristemos, vástagos jóvenes en crecimiento de 10 – 15 cm de longitud, que acaben de desarrollarse sus hojas.
Cualquier residuo de suelo o suciedad se lava bien con agua corriente, y se retiran las hojas de manera que se puedan ver las yemas axilares. Se baña el vástago sin hojas, en alcohol de 70 % (v/v), y después se esteriliza durante 10 minutos en una lejía 3 – 10 % (v/v), conteniendo (Tween 20 u 80, volviéndolas después de aclarar un agua estéril. Las bases de las yemas más pequeñas se cortan y eliminan en una cámara de flujo laminar, y se realiza la siembra. En el caso de las yemas más grandes se retiran algunas hojas antes de proceder su siembra. En el caso de yemas más grandes se retiran algunas hojas antes de proceder a que se forman los primeros cuerpos protocornos. Una vez que esto ocurre, los protocornos se separan y son repicados. Actualmente se siembran yemas mayores ( con al menos 3 – 4 primordios foliares), con lo que se consigue un nivel en el prendimiento de esquejes. Si los protocornos no se separan, el ápice del vástago del protocorno crece y se forman raíces y vástagos; si se separan, continúa la formación de protocornos adventicios.
La formación de protocornos es definitiva también posible, sin el meristema apical.
El medio que se utiliza para Cattleya es más es más complicado que el que se usa para Cymbidium (Fast 1980; Champagnat 1977); añadiéndosele a veces auxinas, citokininas, leche de coco y peptona. La formación de protocornos en Catteya necesita bastante tiempo y generalmente empieza en las bases de las hojas más viejas; aquí el meristemo apical; no juega de hecho ningún papel y al final pierde. Los primordios foliares de Cattleya aislados responden también de forma positiva formando protocornos.
El medio para el cultivo de meristemos es muy semejante al relativamente simple, que se utiliza para la siembra de los distintos géneros. Cymbidium y Miltonia ( que son relativamente fácil de multiplicar), se cultivan frecuentemente en medio Knudson C. (1946) o sobre el medio modificado de Vacin y Went (1949). Cattleya y algunos otros géneros necesitan un medio especial ( Morel 1974). Los medios tipo para los diferentes géneros han sido dados por Bergman ( 1972), Withner (1974), Arditii (1977), Fast (1980) y Zimmer (1980). Los medios Murashige y Stoog (MS) (1962), y Wimber (1963) fueron utilizados más tarde ( DE Bruyne y Deberg 1974).
El aislamiento de meristemos generalmente tiene lugar en medios sólidos, con la excepción de Cattleya; la propagación de protocornos generalmente tiene lugar en medios líquidos, y el crecimiento de protocornos hasta plántulas, nuevamente en medio sólido (Leffring 1968).
El pH del medio se selecciona entre 4,8 y 5,8. La fuente azucarada es sacarosa en la proporción de 1 – 3 % (p/v), o a veces glucosa 1,5 % + fructuosa 1.5 %.
La temperatura y la luz es variable dependiendo la especies a cultivar.
Cuando las plántulas con tres o cuatro hojas son suficientes grandes ( 5-7 cm de altura), después de varios repicados, se transfieren a las cajas. II.- PROPAGACION VEGETATIVA En principio las plantas se pueden multiplicar de dos maneras: Vegetativamente ( de forma asexual, también llamada clonado), y de forma generativa ( sexualmente, por semilla). Los dos tipos de propagación pueden ser imposibles en determinadas condiciones. Los dos tipos de propagación pueden ser imposibles en determinadas condiciones. Cuando la multiplicación sexual no es satisfactoria ( no se forman semillas o se forman muy pocas, las semillas pierden rápidamente su capacidad germinativa), se suele buscar la multiplicación vegetativa. La multiplicación sexual puede también ser poco conveniente cuando la descendencia obtenida es heterógenea, al ser fuertemente heterocigota.
La multiplicación vegetativa tradicionalmente ( por esquejes, división, acodo, y distintos injertos), ha jugado durante muchos años un importante papel en la agricultura; por ejemplo en el caso de la papa, manzana, pera, muchos bulbos ornamentales y planta tuberosas, cultivo leñosos, claveles, crisantemo, etc. La reproducción vegetativa es importante en la mejora vegetal.
Los métodos clásicos de la reproducción o bien son insofucientes para las necesidades reales ( demasiados lentos, difíciles o caros) o a veces son completamente enviables. En los últimos 10 años, desde que se descubrió que la plantas pueden ser clonadas mas rápidamente in vitro que tradicionalmente.
MÉTODOS DE PROPAGACIÓN VEGETATIVA IN VITRO
1.- ESQUEJES DE SEGMENTOS NODALES Con este nombre se conoce el aislamiento de una yema , junto con una porción de tallo, para obtener un vástago a partir de la yema. Este es el método mas natural de propagación vegetativa de las plantas in vitro, ya que también puede aplicarse in vivo. Cada una de las yemas que se encuentran en las axilas de las hojas, idénticas a la del apice del tallo, pueden ser aisladas sobre un medio nutritivo, idénticas a la del apice del tallo, pueden ser aisladas sobre un medio nutritivo, intentándose así su desarrollo in vitro, realizandose los repicados cinado son necesarios. Cuando se obtiene un numero suficientemente grande de vástagos, estos son enraizados y finalmente se realiza transferencia al suelo. El aislamiento de yemas y apices del vástago, es una técnica, donde en principio no se añaden citokininas para evitar la dominancia apical. El primer trabajo de investigación sobre aislamiento de yemas y el consiguiente enraizamiento de los vástagos, se llevo a cabo en esparrago ( Gaiston 1947, 1948). En este caso el enraizamiento de los vástagos fue especialmente difícil, y se demostró que para conseguirlo se necesitaba tanto la oscuridad como una alta concentración de NAA. También se recomienda que el enraizamiento se lleve a cabo sobre medio liquido, ya que se supone un mejor suministro de oxigeno; para inducir la eleongación radical se debe rebajar la concentración de NA. Además en el caso del esparrago es necesario la presencia de un patrón cuya preparación no es fácil.
2.- MÉTODO DE LA YEMAS AXILARES En principio este método es muy similar al de los segmentos nodales; siendo la diferencia mas importante el que en este ultimo caso se utilizan casi exclusivamente plantas con tallos largos, y que generalmente no se necesita la citokinina para el desarrollo de las yemas.
Cuando se utiliza el método de la yemas axilares, se aisla un apice del vástago, a partir del cual se desarrollan las yemas axilares, de las axilas de las hojas, bajo la influencia de una concentración relativamente alta de citokininas. Esta elevada concentración de citokininas frena la dominancia apical y permite el desarrollo de las yemas axilares. Es interesante hacer notar que los principios de este método ya se conocían en 1925;. El meristemo apical impide el desarrollo de las yemas axilares, y su eliminación hace que la dominancia desaparezca. Si es apice del vástago contiene varias ramas axilares o nuevos vástagos axilares. Cuando se produce un numero suficiente de vástagos, pueden ser enraizados, y la plántulas obtenidas transplantadas al suelo.
En la práctica el método de explantos nodales se usa generalmente en combinación con el método de las yemas axilares; se permite a una yema que se desarrolle y posteriormente se añade citokinina para inducir la formación de vástagos axilares.
Este método de propagación in vitro mas importante, por las siguientes razones:
a.- El método resulta generalmente mas simple que otros métodos de multiplicación.
b.- La velocidad de multiplicación es relativamente alta.
c.- Generalmente se mantiene la estabilidad genética.
d.- El crecimiento de las plantas obtenidas es muy bueno, quiza debido a la juvenilización y/o a la falta de infecciones.
El método de los vástagos axilares, para la propagación vitro, ha sido utilizado para tantas especies vegetales diferentes, es aplicado en la industria de producción de fruta, para la multiplicación de patrones y cultivares sobre su propio patrón.
3.- REGENERACIÓN DE EXPLANTOS La regeneración de órganos ( por formación adventicia o por nueva formación) que no estuvieran presentes en el momento del aislamiento , es un proceso complejo, por las siguientes razones:
1.- La correlaciones existentes deben ser rotas, antes de establecer otras nuevas que conduzcan a la regeneración de órganos.
2.- En este proceso se pueden distinguir siguientes etapas:
a.- Des – difenciación de la célula diferenciada ( que conduce probablemente a una redefinición y rejuvenecimiento de las células).
b.- División celular, generalmente seguida por formación de callo; cuando se dirige la división celular , puede comenzar la iniciación de órganos.
c.- Iniciación de órganos d.- Desarrollo de órganos 3.- Existen limitaciones tanto cualitativas como cuantitativas debidas aun gran número de factores.
3.1.- FORMACIÓN DE RAÍCES ADVENTICIAS Los factores que intervienen en la formación de raíces adventicias, en el método de segmentos nodales y en vástagos axilares y explantos. Son :
Edad y estado de desarrollo de la planta.- En la mayoría de los casos, la formación de raíces se induce mucho mas fácilmente en plantas juveniles que en plantas adultas. Los vástagos regeneran mas fácilmente cuando se toman de la parte basal de un árbol, debido a que esta zona es la que posee el carácter juvenil. La capacidad regenerativa de los cotiledones es generalmente mucho mas elevada que la de las hojas que se pueden formar mas tarde. El primer par de hojas de un vástago rejuvenecido es capaz de regenerar mas rápidamente que las hojas subsiguientes.
Posición del explanto sobre la planta .- En algunas planta cualquier segmento de un órgano cualquiera tienen aproximadamente la misma capacidad regenerativa. Si existen diferencias, pueden ser explicadas generalmente por el hecho de que en la hoja ( o tallo), hay tejidos de diferentes edades. Por otro lado, también se han encontrado grandes diferencias, según las zonas , en capacidad de regeneración de algunos órganos.
Especies vegetales y cultivares.- La capacidad de regeneración de las plantas varia entre las distintas especies. Las plantas herbáceas en general mucho mas fácilmente que los arboles y arbustos.
También se ha demostrado que en algunas especies vegetales, la regeneración testa en función al sexo, es decir que las plantas femeninas tienen una mayor capacidad regenerativa que las plantas masculinas.
Tamaño del explante.- Los explantos mayores son a veces mas difíciles de regenerar que los pequeños., quiza debido a la presencia de una mayor cantidad de reservas alimenticia. Por otro lado los explantos pequeños presentan una superficie lesionada relativamente mayor, cosa que se ha demostrado que promueve la regeneración en el caso de los catáfilos de azucena.
Factores físicos:
a.- Suministro de oxigeno.- Es importante, ya que por esta razón los vástagos enraizan mejor in vivo que en vitro. La airación suele promover la formación de raíces y el enraizamiento es mejor en medio liquido que sólido.
b.- Luz.- Generalmente tiene un efecto negativo sobre la formación de raíces. Las plantas que han sido cultivadas en la oscuridad, enraizan con más facilidad que las crecidas en luz c.- Temperatura.- La formación de raíces adventicias es estimulada generalmente por elevadas temperaturas.
Hormonas de crecimiento
a.- Auxinas.- La mayor parte de las plantas necesitan auxinas para conseguir una regeneración radical eficaz. Esta necesidad no es constante , ya que después de la iniciación de la raíz ( para la que se necesita elevadas concentraciones), el desarrollo de los primordios radicales requiere una baja concentración.
El IAA se utiliza para el enraizamiento de herbáceas.
El IBA y NAA o una mezcla de las dos para enraizar plantas leñosas.
b.- Otros reguladores.- Las citokininas, giberilinas y el ácido abscísico inhiben generalmente la formación de raíces adventicias.
3.2.- FORMACIÓN DE VÁSTAGOS ADVENTICIOS La formación de vástagos adventicios se utiliza en la horticultura practica para algunas especies.
El hecho de que la formación de vástagos adventicios no sea tan popular como el método de los vástagos axilares se debe :
1.- El numero de plantas que pueden formar vástagos adventicios in vivo y/o in vitro es mucho mas pequeño que el de aquellas capaces de formar raíces adventicias.
2.- Las posibilidades de que surjan mutantes por este método son mucho mas elevadas que utilizando los métodos de segmentos nodales o vástagos axilares.
Los factores físicos que necesita para la formación de vástagos es la presencia de luz y las altas temperaturas.
Las necesidades de auxina y citokininas son variados.
4.- CULTIVO DE CALLOS Un callo es básicamente un tejido tumoral, mas o menos organizado, que generalmente surge sobre heridas de órganos y tejidos diferenciados. Se llama inducción del callo al inicio de su formación.
Una vez conseguida la indución del callo, este se cultiva sobre un medio nuevo. El primer repicado suele llevarse a cabo sobre un medio sólido, aunque en algunos casos es posible empezar directamente sobre un medio liquido. Si el callo presenta un crecimiento pobre en el primer repicado, puede ser necesario repicar también una porción del explanto. Las condiciones de crecimiento ( medio nutritivo, factores físicos de crecimiento) son generalmente semejantes a las que se utilizan para la indución de callo, solo las concentraciones de auxinas y citokininas son normalmente bajas. Si el crecimiento del callo se detiene después del repicado, nos indica que el medio de repicado no resulta adecuado. En algunas ocasiones el crecimiento del callo no es viable sobre medios sintéticos, añadiendose en estos casos mezclas complejas de sustancias, como leche de coco, hidrolizado de caseína, extracto de malta,, extracto de levadura, etc.
El tejido calloso procedente de diferentes especies vegetales, puede presentar diferencias en estructura y habito de crecimiento; puede ser: blanco o coloreado, libre ( que se separa fácilmente ) o fijo, blando ( acuoso) o duro, fácil o de un callo dentro de una misma especie vegetal puede depender también de factores como la posición original del explanto sobre la planta, y las condiciones de crecimiento. Por otro lado, a veces se pueden ver diferencias en color estructura en un callo, que no pueden ser atribuidas a los factores anteriores, debiéndose considerar en estos casos la posibilidad de que se hayan producido algunas mutaciones.
Se considera que un callo es un tejido de crecimiento rápido y fácil de cultivar.
5.- REGENERACIÓN DE ÓRGANOS Y EMBRIONES Dependiendo de la especie vegetal y de donde se ha originado el callo, se puede producir la formación de órganos adventicios y/o la formación de embriones que reciben el nombre de somáticos. El tejido calloso que se origina de material juvenil y/o herbáceo, se regeneran mucho mejor que el que procede de material adulto y/o leñoso.
5.1.- REGENERACIÓN DE ÓRGANOS Los callos son generalmente mas capaces de regenerar raíces, que los vástagos adventicios. La formación de raíces generalmente tiene lugar en medios concentraciones de auxina relativamente altas, pero concentraciones de citokininas bajas. Esto concuerda con las condiciones de regeneración de explantos. La iniciación de los primordios radicales generalmente requiere una concentración de auxinas mas alta que la que se necesita para el posterior crecimiento de los mismos primordios. Las raíces y los vástagos se forman por lo general de la forma completamente independiente unos con respecto a los otros, es decir, no existe coexión entre ellos, aunque se originen a partir de un callo, al mismo tiempo.
La formación de vástagos adventicios puede producirse sobre el callo, si existe un baja concentración de auxinas y una alta de citokininas.
La citokinina BA es la mas eficaz a la hora de inducir la formación de vástagos adventicios. En algunas ocasiones se producen raíces adventicias en la base de los vástagos adventicios.
La formación de vástagos adventicios sobre el callo, posiblemente esta influida por factores mucho mas complejos que los que hasta ahora se conocen.
5.2.- REGENERACIÓN DE EMBRIONES Cuando los embriones se regeneran a partir de células o tejidos somáticos ( haploides, diploides, etc), se habla de una embriogénesis somática; esta puede considerarse como opuesta a la embriogenesis cigotica, que es el resultado de la fertilización de la célula gamética. En la literatura, los embriones somáticos son denominados de diferentes formas: estructuras de tipo embrionario, embriones vegetativos o adventicios, embríoides; y al proceso de se formación se le denomina embriogénesis adventicia, asexual o somática.
El desarrollo de embriones somáticos y plántulas, a partir de un explanto se puede resumir como sigue. En primer lugar se deben desdiferenciar las células ya diferenciadas, y posteriormente iniciar la división. De esta forma se origina una masa no diferenciada de células parenquimáticas vacuolas. Estas se transforman en células ricas en citoplasma que se hacen embriogénicas por la influencia de la auxina. Las células, embriogénicas, a partir de las cuales se originan los embriones, muestran una serie de características comunes, típicas de las células en proceso de división rápida. La producción de embriones somáticos en suspensión celulares y callos pueden tener lugar endógena ( en el interior), o de forma exógena ( en la periferia); también se ha descrito la embriogénesis a partir de tejido nucelar, hipócotilos de plantas en germinación y embriones somáticos.
Los materiales que a continuación se indican constituían un buen material inicial para la embriogénesis somática: porciones de flores, embriones cigóticos, anteras, granos de polen y tejido del endospermo. Partiendo de la base de que los embriones se originan de masa de tejidos nodulares o con aspecto de yemas, se llego a la conclusión de que la embriogénesis somática no era unicelular en su origen. Sin embrago, estudios posteriores han demostrado que la embriogénesis somática tiene lugar partiendo de una célula única, que se divide para originar un complejo celular de tipo pro – embriónico. De esta forma, tanto los embriones de cigóticos como los somáticos quedan incluidos en la definición de Haccius ( 1978): un embrión vegetal es un individuo nuevo, que se origina a partir de una única célula y que no tiene conexiones celulares con el tejido materno.
De acuerdo con Ammirato (1983), en el año de 1979 ya era posible inducir la embriogénesis somática en 132 especies vegetales, procedentes de 81 géneros y 32 familias.
La embriogénesis somática puede ser de dos tipos:
1.- Directa.- En este caso el embrión se origina directamente, a partir de una célula o tejido, sin que se produzca una formación previa de callo.
Ej: Zanahoria silvetre, Ranunculus sceleratus, Linum usitatissimum, Brassica napus.
2.- Indirecta.- En este tipo de embriogénesis, primero se forma un callo, a partir del cual se forman después los embriones.
Ej: Coffea arabica, Petunia hybrida y Asparagus officinalis.
6.- REGENERACIÓN DE PLANTAS A PARTIR DE CÉLULAS AISLADAS Inicialmente resultaba muy difícil inducir a la división celular en células aisladas en vitro. Muir et al 1954, 1958) fueron aisladas sobre papel de filtro, que a su vez se situa sobre un callo madre. A este método se le denomina en la literatura cultivo nodriza, ya que el callo madre suministra a la célula aislada las hormonas y nutrientes necesarios, a tráves del papel filtro, facilitando el crecimiento y división celulares. La regeneración de una planta a partir de una célula aislada se realiza de la forma que se indica a continuación. En primer lugar se debe originar una colonia de callos, a partir de la célula. A partir del callo se forman embriones o vástagos adventicios. A continuación se indican algunas plantas importantes , a partir de las cuales, se han regenerado plantas completas, partiendo de una célula aislada: Nicotiana tabacum, Daucus carota, Cichorium endivia, Asparagus officinales, Brasica napus, entre otras.
Cuando falla la regeneración de una planta, a partir de una célula aislada , se debe generalmente a alguna de las causas siguientes:
1.- Las células no se desdiferencian y rejuvenecen en suficiente medida.
2.- Las células no son totipotentes, cosa que esta por lo general genéticamente determinada.
3.- Se desconocen los factores que inducen la embriognesis y la formación de órganos.
1.- La propagación de plantas madres, ya sea en el sistema tradicional o in vitro es importante, ya que de ella depende nuestra nueva población de plantas.
2.- Es importante hacer un manejo adecuado a la planta madre, tomando en encuenta todas los factores bióticos y abióticos que le puedan afectar.
3.- Propagación en forma tradicional, se realiza en seleccionar las planta mas vigorosas, libres de enfermedad y aquellas que tengan un alto rendimiento las cuales conformaran el lote de plantas madres. Dependiendo de la especie, estas pueden ser utilizadas como plantas madres por período de tiempo determinado.
4.- El cultivo in vitro es una tecnología que nos brinda muchas oportunidades en la propagación de plantas, en especial en producir plantas madres optimas para su propagación, ya que cuenta con un control estricto para su propagación.
5.- Para realizar un buen cultivo in vitro se debe tener en cuenta las siguientes consideraciones, la especie a propagar, el problema a eliminar y el tipo método a realizar.
6.- En la actualidad, la manipulación de plantas madres en forma tradicional, es utilizada por la mayoría de los agricultores de nuestro país, ya que un factor limitante es el de no contar con el capital adecuado.
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Autor:
Biotec. Emilio Alfredo Lucas Carrillo.
elucas42[arroba]hotmail.com
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