Caracterización e implicaciones del virus de la gripe aviar a nivel celular

Enviado por Diana Marcela Montoya Navarro

OBJETIVO GENERAL

Analizar el funcionamiento celular del virus de la gripe aviar, especialmente la variante H5N1 y su participación en el desarrollo de la enfermedad.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Caracterizar las estructuras presentes en el virus de la gripe aviar (cepa H5N1).

Observar la estructura celular de la cepa patógena y analizar las consecuencias que produce el virus al hacer contacto con la cepa, a través análisis de inmunofluoresencia.

Realizar extracción de las células afectadas por el virus e inocularlas en células sanas del mismo tipo y observar su desarrollo.

Palabras claves

Ortomixovirus, hemaglutina, neuraminidasa, cepa H5N1

INTRODUCCIÓN

La gripe aviar, más conocida como gripe del pollo fue identificada por primera vez en Italia hace más de 100 años. Se trata de una enfermedad viral muy contagiosa causada por las cepas tipo A del virus de la gripe que puede afectar a todas las especies de aves.

Los virus de la gripe aviar son miembros de la familia Orthomyxoviridae, género Influenzavirus tipo A

Estos virus están divididos en subtipos sobre la base de sus proteínas de membrana hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Hasta la fecha se reconocen 15 subtipos de hemaglutininas del virus de la gripe (H1-H15) y 9 subtipos de neuraminidasas (N1-N9). Hasta ahora, todos los brotes de las formas muy patogénicas han sido causados por los virus A de la gripe de los subtipos H5 y H7.

Los síntomas de la gripe aviar en humanos varían desde síntomas parecidos a la gripe típica (fiebre, tos, dolor de garganta y dolores musculares) hasta infecciones oculares, neumonía, dificultad respiratoria aguda y otras complicaciones graves que pueden suponer una amenaza para la vida.

Marco teórico

Se ha confirmado la afectación humana de la gripe aviar desde 1997:

1997: En Hong Kong, la gripe aviar A (H5N1) afectó tanto a pollos como a humanos. Fué la primera vez que se encontró la transmisión directa de aves a humanos. Durante este brote 18 personas fueron hospitalizadas y 6 de ellas fallecieron. Para controlar el brote y eliminar la fuente del virus las autoridades sanitarias mataron cerca de 1,5 millones de pollos. La investigación de este brote concluyó que el contacto estrecho con las aves infectadas vivas había sido el origen de la infección humana. Estudios genéticos posteriores evidenciaron que el virus había saltado directamente de las aves al hombre. Se produjo también una transmisión limitada al personal sanitario, sin llegar a causar síntomas de gravedad.

1999: En Hong Kong, se confirmaron dos casos de gripe aviar A H9N2 en niños. Ambos pacientes se recuperaron y no se confirmaron otros casos. Los hechos sugieren que las aves de corral fueron la fuente de infección y el principal modo de transmisión fué de aves a humanos. Sin embargo, la posibilidad de transmisión de persona a persona permaneció abierta. Se informó de infecciones humanas H9N2 en China en 1998-1999.

2003: Dos casos de gripe aviar A (H5N1) ocurrieron entre los miembros de una familia de Hong Kong que había viajado a China. Una persona se recuperó y otra murió. No se determinó donde habían sido infectadas estas personas. Otro miembro de la familia murió de una enfermedad respiratoria en China, pero no se tomaron muestras. No se informó de otros casos.

Se confirmaron en Holanda infecciones de gripe aviar A (H7N7) entre las personas que trabajan con aves de corral y sus familias durante un brote de gripe. Se informó de más de 80 casos de enfermedad H7N7 (los síntomas fueron confinados a infecciones oculares con algunos síntomas respiratorios) y un paciente murió (un veterinario que había visitado una granja afectada). Había evidencia de transmisión de humano a humano.

En un niño en Hong Kong se confirmó infección por H9N2. El niño fué hospitalizado pero se recuperó.

2003-2004: Un brote de gripe aviar está afectando a las poblaciones de aves en países asiáticos. El brote está causado por el virus de la gripe subtipo H5N1. Este brote ha causado también casos de infección en humanos en Vietnam y Tailandia, habiendose producido muertes.

Durante 2005 se han observado cambios importantes en la epidemiología de la enfermedad en los animales. Se siguen registrando casos humanos, y el virus se ha extendido a nuevos países, con el consiguiente aumento del tamaño de la población en riesgo. Cada caso humano nuevo brinda al virus otra ocasión para mutar y transformarse en una cepa pandémica plenamente transmisible.

Los datos disponibles muestran que el virus H5N1 es hoy endémico en algunas zonas de Asia, habiendo establecido su nicho ecológico en las aves de corral.

El riesgo de aparición de nuevos casos humanos persistirá, al igual que las oportunidades de aparición de un virus pandémico. Los brotes se han reproducido pese a las enérgicas medidas de control adoptadas, entre ellas el sacrificio de más de 140 millones de aves. Un gran número de aves migratorias salvajes, el reservorio tradicional de los virus A de la gripe, están muriendo actualmente como consecuencia de una cepa hiperpatógena de H5N1. Los patos domésticos pueden excretar grandes cantidades de virus hiperpatógeno sin acusar signos de la enfermedad. La intervención silente de estos animales en el mantenimiento de la transmisión complica aún más el control de las aves y es un problema añadido para evitar los comportamientos de riesgo en las poblaciones humanas.

Debido a las continuas transformaciones de los virus de la gripe, no es posible prever ni el momento ni la gravedad de la próxima pandemia. El paso final – una mayor transmisibilidad entre personas – puede tener lugar por dos mecanismos principales: un fenómeno de redistribución, consistente en un intercambio de material genético entre el virus humano y el virus aviar durante la coinfección de un hombre o un cerdo, y un proceso más gradual de mutación adaptativa que conferiría al virus aviar una creciente capacidad para unirse a las células humanas en las sucesivas infecciones de personas. La redistribución puede desembacar en un virus pandémico plenamente transmisible, presagiado por un súbito incremento de los casos y una propagación explosiva del virus. Las mutaciones adaptativas, que se manifestarán al comienzo en forma de pequeños conglomerados de casos humanos con indicios de una transmisión limitada, nos concederán probablemente algún tiempo para tomar medidas defensivas.

Virus.

Los virus son parásitos intracelulares submicroscópicos, compuestos por ARN o por ácido desoxirribonucleico (ADN) —nunca ambos— y una capa protectora de proteína o de proteína combinada con componentes lipídicos o glúcidos. En general, el ácido nucleico es una molécula única de hélice simple o doble; sin embargo, ciertos virus tienen el material genético segmentado en dos o más partes. La cubierta externa de proteína se llama cápsida, y las subunidades que la componen, capsómeros. Se denomina nucleocápsida al conjunto de todos los elementos anteriores. Algunos virus poseen una envuelta adicional que suelen adquirir cuando la nucleocápsida sale de la célula huésped. La partícula viral completa se llama virión. Los virus son parásitos intracelulares obligados, es decir: sólo se replican en células con metabolismo activo, y fuera de ellas se reducen a macromoléculas inertes.

Replicacion viral es un proceso que incluye varias síntesis separadas y el ensamblaje posterior de todos los componentes, para dar origen a nuevas partículas infecciosas. La replicación se inicia cuando el virus entra en la célula: las enzimas celulares eliminan la cubierta y el ADN o ARN viral se pone en contacto con los ribosomas, dirigiendo la síntesis de proteínas. El ácido nucleico del virus se autoduplica y, una vez que se sintetizan las subunidades proteicas que constituyen la cápsida, los componentes se ensamblan dando lugar a nuevos virus. Una única partícula viral puede originar una progenie de miles. Determinados virus se liberan destruyendo la célula infectada, y otros, sin embargo, salen de la célula sin destruirla por un proceso de exocitosis que aprovecha las propias membranas celulares. En algunos casos las infecciones son "silenciosas", es decir, los virus se replican en el interior de la célula sin causar daño evidente.

Descripción del virus

Ortomixovirus, grupo de virus que constituye la familia Orthomyxoviridae, cuyo genoma está formado por ácido ribonucleico (ARN) monocatenario lineal. Antes se les conocía como mixovirus, virus de mucosas, y se incluía tanto a los ortomixovirus como a los paramixovirus en una sola familia. Sin embargo, al conocerse mejor sus características se han clasificado en dos familias distintas.

El virus de la gripe (influenza) es el más representativo de los ortomixovirus. La familia incluye los influenzavirus tipos A, B y C. Los A y B constituyen el género Influenzavirus.

El ARN de la partícula viral está segmentado en 8 fragmentos que codifican las proteínas presentes en ella. La nucleocápsida es helicoidal y su diámetro oscila, al ser pleomórfico, entre 80 y 100 nanómetros. En la parte externa de la envoltura lipídica aparecen por separado dos tipos de espículas (glicoproteínas con carácter antigénico): una hemaglutinina (H) y una neuraminidasa (N). La primera es responsable de la aglutinación de hematíes en presencia del virus y la segunda es una enzima que interviene en la fase final de la liberación del virus.

El hecho de poseer un ARN fragmentado hace que las combinaciones antigénicas sean más numerosas (como consecuencia de cambios genéticos ocurridos en la formación de H y N), dando lugar a cepas distintas para las que la población no presenta anticuerpos. Por esta razón, la inmunidad específica adquirida para una cepa en concreto no sirve para las nuevas que se originan.

El influenzavirus tipo A es el causante más común de pandemias (epidemias de amplia extensión), el tipo B causa mayoritariamente epidemias locales y el de tipo C, de origen animal, rara vez es patógeno.

Hemaglutinina y neuraminidasa

Papel patogénico de la hemaglutinina

La HA es una glicoproteína formada por tres subunidades codificadas por el gen viral 4, que tiene la capacidad de aglutinar hematíes de diferentes especies animales mediante su unión específica a los receptores celulares que contienen ácido siálico22 .

Sus funciones son:

– Fijación y unión al receptor de la célula huésped.

– Penetración de las partículas virales a través de la membrana celular.

– Actuación como antígeno mayor del virus que se expresa en la superficie de las células infectadas. La HA está presente en la partícula viral en una forma precursora (HA0) y precisa de una activación enzimática para producir la forma activa (cleavage activation). Procesos similares son necesarios para la entrada en la célula huésped de una gran variedad de virus como el VIH y parainfluenza. La hidrólisis enzimática de la HA0 determina un cambio conformacional de la proteína, dando lugar a dos subunidades HA1 y HA2 que permanecen unidas por un puente disulfuro. Esta hidrólisis es un requisito esencial previo para que la glicoproteína pueda fijarse al receptor celular y participar el en proceso patogénico e infectivo del virus. Según el subtipo, el proceso hidrolítico determina la pérdida de 1-6 aminoácidos.

El tropismo celular y la capacidad de diseminación sistémica del virus influenza dependen de los receptores funcionales del huésped, de la distribución de las proteasas capaces de realizar la hidrólisis y de la permisividad de la replicación viral por parte de las células huésped 20.

Las enzimas proteolíticas capaces de hidrolizar la HA y activarla se clasifican en 2 grupos:

– Enzimas de tipo tripsina: capaces de hidrolizar la HA perteneciente a cepas avirulentas y virulentas.

– Enzimas dependientes del Calcio: capaces de activar cepas virulentas con numerosos residuos básicos en el entorno y punto de corte de la HA. Están localizadas en el aparato de Golgi de las células eucariotas. La más estudiadas han sido la Furina (codificada por el gen Fur) que reconoce la secuencia B-X-B-R. La proteína PC6 sólo activa cepas virulentas con múltiples residuos básicos en la zona de corte hidrolítico. Existen 2 características estructurales que determinan la capacidad para ser hidrolizada la secuencia aminoácido de la HA:

– Secuencia aminoácido específica del punto de corte.

– Secuencia aminoácido existente en la vecindad del anterior.

Activación proteolítica de HA.

Papel patogénico de la Neuraminidasa

La NA es un homotetrámero codificado por el gen 6 del virus. Es una enzima que cataliza e hidroliza las uniones á-cetósido entre un ácido siálico terminal y una D-galactosa o D-galactosamina adyacente.

Sus principales funciones son la eliminación de los residuos de ácido siálico de la HA y de la superficie celular, favoreciendo la liberación de las partículas virales y diseminación a otras células (difusión-infección). Participa en el transporte del virus a través de la mucina presente en el tracto respiratorio, permitiendo la llegada del virus a otras células epiteliales (expansión-infección).

Además puede unirse al plasminógeno, lo que originaría el aumento de la concentración local de proteasa15,19,22. Esto se ha visto en algunas cepas aviares y en las humanas. Papel del plasminógeno

Otras proteínas

La envoltura está compuesta por una doble capa lipídica, en cuya superficie interna hay una proteína de matriz M, la cual proporciona estabilidad al virión y crea un medio ambiente selectivo para la inclusión de proteínas codificadas por el virus que resulta importante en el estadio temprano de la replicación viral. La proteína M también sirve como antígeno específico de tipo (2, 5, 6). Dentro de la envoltura existe la nucleocápside, la cual está fragmentada en 8 segmentos.

Los datos disponibles sugieren que los segmentos del genoma son incorporados al azar a viriones maduros, un proceso que sólo rara vez podría dar como resultado un virión que contenga todos los segmentos del genoma necesarios para la infección, pero que podría explicar una mayor capacidad de infección determinada por la agregación de viriones de la influenza.

Al estar agregados, se complementan dos o más partículas virales, mientras que, si se presentaran aislados y cada uno careciera de uno o más segmentos de ARN, podría no producirse infección. Este proceso al azar explicaría también la gran frecuencia de reordenamiento de segmentos de ARN entre dos virus de influenza que ocurre cuando las células son infectadas en forma simultánea con dos virus de influenza diferentes (2, 5, 6).

Variación antigénica

Las mutaciones puntuales en los genes que codifican estos antígenos ocasionan cambios en las proteínas virales, que permiten evadir la respuesta inmune y llevan a la aparición de enfermedad, aun existiendo anticuerpos previos; esta situación se denomina cambio antigénico menor (antigenic drift). Si llega a producirse un intercambio genético entre diferentes especies de virus de la influenza, con reordenamiento del genoma y generación de un nuevo subtipo viral, se produce el fenómeno conocido como cambio antigénico mayor (antigenic shift). La variación antigénica involucra sobre todo a la hemaglutinina y la neuraminidasa. La hemaglutinina es la más importante, ya que está involucrada con mayor frecuencia y porque los anticuerpos contra esta proteína neutralizan la infección (2, 6, 7).

PRINCIPALES VIRUS DE LA GRIPE AVIAR

1. Influenza A H5

• 9 subtipos diferentes

• Puede ser LPAI o HPAI.

• Se han descrito infecciones por H5 en humanos y en ocasiones han causado enfermedad severa y muerte.

• No se ha demostrado claramente la transmisión persona-persona, pero sí la transmisión animal-persona y la transmisión animal-interespecie

2. Influenza A H7

• 9 subtipos distintos

• Puede ser LPAI o HPAI.

• La infección por H7 en humanos es rara, pero puede ocurrir entre personas que tienen contacto estrecho con pájaros infectados. Los síntomas pueden ser desde conjuntivitis hasta graves síntomas respiratorios.

• Igualmente sólo se ha demostrado la transmisión animal-persona e

interespecie animal.

3. Influenza A H9

• 9 subtipos diferentes

• Sólo se han descrito en la forma LPAI

• Han sido confirmadas 3 infecciones en humanos, por ahora24.

• Solamente se ha demostrado la transmisión animal-persona y animalanimal de la misma o de otra especie.

Ciclo biológico

Pruebas de laboratorio para detectar el virus de la gripe aviar

Análisis de inmunofluorescencia

El análisis de inmunofluorescencia puede utilizarse para la detección de virus en muestras clínicas o en cultivos celulares. Son preferibles las muestras clínicas, obtenidas lo antes posible tras la aparición de los síntomas, ya que el número de células infectadas presentes disminuye durante el curso de la infección. Es mejor realizar este análisis en cultivos celulares inoculados, pues permite la amplificación de los virus que puedan estar presentes.

Material necesario:

• Juego de reactivos de la OMS para la identificación del virus de la gripe A/H5 (versiones 1997-98, 2003 ó 2004). Los reactivos de este juego para el análisis de inmunofluorescencia comprenden los siguientes:

– mezcla de anticuerpos monoclonales específicos de la gripe A/H5

– mezclas de anticuerpos monoclonales específicos de la gripe A y específicos de la gripe B

– anticuerpos monoclonales específicos de la gripe A/H1 y de un subtipo A/H3.

• conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anti-IgG de ratón

• Portaobjetos para microscopio

• Cubreobjetos, 24 x 60 mm

• Líquido de montaje

• Acetona

• Microscopio de inmunofluorescencia.

Procedimiento

Esta prueba se realizará siguiendo las instrucciones incluidas en el Juego de reactivos de la OMS para la gripe. Las células epiteliales se lavan por centrifugación para eliminar toda la mucosidad contaminante; a continuación se fijan y se tiñen con anticuerpos monoclonales específicos. Las células del epitelio respiratorio contenidas en una muestra clínica son sumamente lábiles y se deterioran con facilidad, por lo que habrán de mantenerse refrigeradas con hielo durante la manipulación y no centrifugarse a más de 500 g. Habrá que incluir portaobjetos de control con células infectadas por la gripe A/H3 y H1 (y, si se dispone de ellas, células infectadas por el H5) y células no infectadas para controlar debidamente los anticuerpos monoclonales y el conjugado y para facilitar la interpretación de la tinción específica.

Interpretación de resultados

La tinción específica debe dar una intensa fluorescencia intracelular de color verde manzana.

Puede observarse fluorescencia nuclear o citoplásmica. Es importante velar por que la densidad celular sea suficiente. Puede aceptarse como resultado positivo la presencia de una o más células intactas que muestren fluorescencia intracelular específica. Como se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales disponibles en el comercio para la caracterización de subtipos de gripe A/H1 reaccionan de forma cruzada con los subtipos de gripe A/H5, incluidas las cepas actualmente circulantes (2004), deben realizarse pruebas confirmatorias utilizando el anticuerpo monoclonal incluido en el juego de reactivos de la OMS.

BIBLIOGRAFÍA

http://www.infectio.org/upload/eve24.pdf

www.who.int/entity/csr/disease/ avian_influenza/guidelines/labtests.pdf

www.tecnociencia.es/especiales/ gripe_aviar/gripe_aviar.htm –

http://remi.uninet.edu/2005/11/REMIA032.htm

Diana Cristina Hurtado Solano

Estudiante de Biologia

Sandra Milena Lozano Triana

Ana Silvia de las Rosas Diaz Rodriquez

Diana Marcela Montoya Navarro

Paola Andrea Arevalo