Sensibilidad a la insulina en ovejas prepúberes con alimentación normal y con restricción alimenticia (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Manejo general de los animales. Se utilizaron 10 borregas prepúberes Suffolk Down, nacidas en agosto, provenientes de la Unidad de Producción Ovina de la Facultad de Agronomía de la Universidad de Concepción. Las hembras se destetaron a los 3 meses de edad y se alimentaron con pradera natural y suplementadas con alimento peletizado (Novillina, Champion). A las 20 semanas de edad las borregas se separaron al azar en dos grupos: uno control y el otro experimental. Las borregas del grupo control (n = 5, 23,6 ± 1,1 kg peso vivo) se alimentaron ad libitum, mientras que a las borregas del grupo experimental (n = 5, 23,2 ± 0,5 kg peso vivo) se les limitó la ingesta del alimento, alimentándolas con una cantidad diaria de alimento peletizado equivalente aproximadamente al 2% del peso corporal. Este procedimiento se mantuvo por 6 semanas, hasta las 26 semanas de edad.

Cuarenta y ocho horas antes del inicio del TTGEV, las borregas se trasladaron a la sala de experimentación, para la cateterización de una vena yugular de acuerdo al método descrito por Recabarren y col (1995). El catéter (Arrow, 18 g), conectado a una llave de tres pasos, se utilizó para la infusión de glucosa y para la colección de las muestras de sangre. Los catéteres se mantuvieron con suero heparinizado (500 UI/mL) para evitar la formación de coágulos. Se procedió a muestreos sanguíneos de acostumbramiento durante el día previo para reducir los riesgos de estrés. El alimento sobrante se retiró a las 20 horas del día anterior al test, para permitir un ayuno de 12 horas previo a los experimentos.

Test de tolerancia a la glucosa endovenosa. El test de tolerancia a la glucosa endovenosa consistió en la infusión de una solución de glucosa estéril 50% a una dosis de 300 mg/kg de peso vivo en 2 minutos. Se colectaron muestras de sangre a los 15 y 10 minutos antes de la infusión y a los 0, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 20, 23, 25, 27 y 30 minutos después del inicio de la infusión para las mediciones de insulina y glucosa sanguínea. Las muestras obtenidas antes y al tiempo 0 se utilizaron para calcular las concentraciones de insulina y glucosa plasmática basal. Las muestras de sangre se recibieron en tubos de vidrio heparinizados para la medición de insulina y en tubos de vidrio heparinizados y fluorados para la medición de glucosa conservados en hielo. Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 1000 g por 15 min a 4º Celsius, y el plasma se conservó congelado a -20º Celsius hasta las determinaciones de insulina y glucosa plasmática.

Medición de glucosa e insulina. Las concentraciones plasmáticas de insulina se determinaron por RIA con kits comerciales (Insulin Cout-a-Count, DPC, USA) validado en el laboratorio para ovejas. La radiactividad se cuantificó en un gammaespectrómetro LKB RIA GAMMA 1271 (Wallac Oy, Finlandia). El nivel mínimo de detectabilidad definido como el 90% del buffer control fue de 3 µIU/mL, con un coeficiente de variación intraensayo e interensayo de 5 y 8% respectivamente en el rango de 5 a 300 µIU.

La glucosa se midió con kits comerciales (Wiener Lab, Chile) mediante el método de la glucosa oxidasa con medición de la absorvancia a 505 nm en espectrofótometro Spectronic 21D (Milton Roy, USA). El coeficiente intra e interensayo fue menor al 2 y 5% respectivamente.

Cálculo del índice de sensibilidad a la insulina. Para el cálculo del índice de sensibilidad a la insulina se utilizó la fórmula descrita por Matsuda y De Fronzo (1999), donde:

ISI-Composite=10000/ (Promedio concentración glucosa basal x Promedio concentración insulina basal) x (Promedio concentración glucosa 0-30 min x Promedio concentración de insulina 0-30 min).

Además, se determinó el área bajo la curva de respuesta de insulina (AUC, ng/ml/30min) como la diferencia entre el área bajo la curva de las concentraciones basales de insulina y el área bajo la curva de insulina estimulada durante el TTGEV, con la fórmula del trapezoide y la tasa de disponibilidad de la glucosa (kg, % por min) mediante la pendiente de la caída de glucosa entre los 10 y 20 minutos postadministración de glucosa.

Análisis estadístico. Los datos de glucosa e insulina basal, la sensibilidad a la insulina (ISI-Composite), el área bajo la curva y la constante de utilización de glucosa se analizaron, en primer lugar, por homogeneidad de varianza, con el test de Barttlet y luego con el test de "t" no pareado con el programa computacional GBStat v.6. Se consideró un P < 0,05 como una diferencia estadísticamente significativa. Los datos se muestran como promedio ± error estándard.

RESULTADOS

En el cuadro 1 se muestran los pesos corporales promedio, la glucosa plasmática y la insulina plasmática basal de cada grupo a las 26 semanas de edad (después de seis semanas de restricción alimenticia en el grupo experimental). El peso de las borregas del grupo control fue mayor que el de las borregas del grupo experimental (P < 0,05). La glucosa plasmática fue menor (P < 0,05) en las ovejas con restricción alimenticia que en las controles, mientras que la concentración de insulina plasmática fue menor en las ovejas controles que en las experimentales.

En la figura 1 se muestran las concentraciones plasmáticas promedio de glucosa e insulina durante el TTGEV en ambos grupos. Se puede observar el aumento en las concentraciones de glucosa como resultado de la infusión de glucosa con un nivel máximo a los 3 minutos. Posteriormente la glucosa plasmática descendió hasta los 30 minutos con una pendiente similar en ambos grupos: 1,56 ± 0,47 y 1,98 ± 0,27% por min respectivamente. El grupo restringido exhibió una mayor secreción de insulina en respuesta a la glucosa que en el grupo control. Este tipo de comportamiento determinó que el ISI-C de las borregas experimentales fue de 636,43 ± 125,66 después de seis semanas de restricción alimenticia, mientras que en las borregas controles fue de 1528,18 ± 297,61 (P < 0,05) (figura 2). La mayor secreción de insulina en respuesta a la glucosa se puede reconocer como área bajo la curva de respuesta. El AUC de las borregas experimentales fue de 642,16 ± 140,04 y mayor (P < 0,05) que el de las ovejas controles: 290,54 ± 79,45.

DISCUSIÓN

La restricción alimenticia de ovejas prepúberes por seis semanas conduce a una menor sensibilidad a la insulina con respecto a ovejas controles de la misma edad, lo que sugiere el desarrollo de una resistencia insulínica en ellas. Lo anterior se asocia al aumento en las concentraciones plasmáticas basales de insulina en las borregas con restricción alimenticia que en las borregas controles, indicando que la resistencia insulínica se asocia a una hiperinsulinemia compensatoria.

La presencia de resistencia insulínica también se ha observado durante el ayuno en ovejas prepúberes (Recabarren y col 2000). El objetivo biológico de la RI, tanto durante la restricción alimenticia como durante el ayuno, sería favorecer la disponibilidad de glucosa para los tejidos no insulino-dependientes, en particular, el cerebro. Una situación parecida se produce durante la preñez, en la cual los tejidos maternos insulino-dependientes, como el músculo esquelético y tejido adiposo, se encuentran en competencia con el feto (Petterson y col 1993), o durante la lactancia a favor de la glándula mamaria (Vernon y col 1990).

El mecanismo exacto y cuáles son las sustancias involucradas en el desarrollo de la RI en estos estados fisiológicos aún no están claros. Es posible que la borrega, a consecuencia de la falta de energía disponible en cantidad suficiente para el gasto energético derivado del crecimiento, comience a movilizar parte de la grasa almacenada anteriormente, liberándose ácidos grasos libres desde los triglicéridos del tejido adiposo. Estos ácidos grasos libres son los que podrían desencadenar la RI, fundamentalmente en el tejido muscular e hígado, actuando de manera similar a como lo hacen en la obesidad, ejerciendo su efecto sobre la actividad tirosina-kinasa del receptor de insulina, contribuyendo así a un estado de RI post-receptor (Boden 1996, Boden 2003). Como consecuencia de este estado de RI se produce un aumento compensatorio de insulina, lo que llevaría a una hiperinsulinemia. Es también posible que el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), una citoquina proinflamatoria que se sintetiza y se secreta desde los adipositos (Kern y col 1995), tenga un rol ya sea paracrino o autocrino en el control de la función del adiposito. Por un lado, se ha establecido que promueve la lipólisis y que, por otro, disminuye la actividad de la lipoproteinlipasa (LPL) (Hauner y col 1995, Kern y col 1995) y reduce la expresión de los transportadores de ácidos grasos libres en el tejido adiposo (Memon y col 1998), con lo cual disminuye la lipogénesis. El TNFa puede entonces actuar en el adiposito desviando el metabolismo lipídico desde la acumulación hacia la reducción en el pool de triglicéridos, lo cual representaría uno de los mecanismos por los cuales se reduce la masa de tejido adiposo total. Por otro lado, no se puede descartar que en el proceso de generación de la resistencia insulínica de la restricción alimenticia participen otros péptidos derivados del adiposito como la adiponectina. La adiponectina es una citokina que se ha relacionado con la resistencia insulínica, pero más bien con el aumento de adiposidad (Ravussin 2002).

Sin embargo, la resistencia insulínica que se presenta durante la restricción alimenticia sería diferente a la que se desarrolla en la obesidad. En la obesidad, hay un aumento de los triglicéridos plasmáticos como consecuencia del aumento de la lipólisis en el adipocito distendido, el cual se hace resistente a la insulina. El aumento de los ácidos grasos libres conduce a una resistencia insulínica, con hiperinsulinemia y euglicemia. Por el contrario, en la resistencia insulínica de la restricción alimentica de nuestro modelo se presenta hiperinsulinemia con euglicemia o hipoglicemia. Este aumento en las concentraciones plasmáticas de insulina como compensación por la RI produce una disminución en la actividad kinasa del receptor de insulina, probablemente por fosforilación de la serina/treonina del receptor en contraste con la fosforilación de la tirosina (Hotamisligil y col 1994). La estimulación de serinakinasas con la fosforilación de la serina y treonina produce disminución de la actividad del receptor, por lo que, disminuyendo la actividad del receptor, disminuye la sensibilidad de los tejidos a la acción de la insulina (Kahn 1997). La implicación clínica de esto es que cualquier desbalance en un estado de restricción alimentaria se debería a la resistencia per se o los efectos crónicos de la hiperinsulinemia compensatoria.

Se ha propuesto que la insulina (Steiner y col 1983) así como otros metabolitos u hormonas serían señales metabólicas que informan al hipotálamo mediante un complejo mecanismo neuroendocrino sobre el estado metabólico de la hembra en crecimiento para modificar la secreción de GnRH (Recabarren 1999, Tanaka y col 2000). Si la insulina fuese una señal interpretativa del estado metabólico, la hiperinsulinemia derivada de la RI sería un medio por el cual las neuronas GnRH podrían interpretar la capacidad metabólica y reproductiva de la hembra y consecuentemente disminuir la secreción de GnRH. Es probable que esta información deba ir acompañada por otras, como ser la leptina. Estudios de nuestro laboratorio muestran que la restricción alimenticia por seis semanas en ovejas prepúberes disminuye significativamente la leptina circulante (Recabarren y col 2004). De tal forma que una hiperinsulinemia asociada a una hipoleptinemia podría ser reconocida por las neuronas GnRH como un estado metabólico no competente con la reproducción. Esto, a su vez, mantendría reprimida la secreción de GnRH y, por ende, el inicio de la pubertad se retrasaría. Por el contrario, una hiperinsulinemia asociada a un aumento de leptina u otros metabolitos y hormonas podría ser desencadenante del inicio de la pubertad (Porte Jr. y col 2002, Foster y Nagatani 1999).

En el hipotálamo de varias especies se ha demostrado la presencia de receptores de insulina (Van Houten y col 1980, Havrankova y col 1981, Landau y col 1983, Schuleter y col 1984, Hopkins y Williams, 1997), y en particular en neuronas próximas a las neuronas GnRH (Van Houten y col 1980). Complementando estas observaciones se ha demostrado la presencia de receptores de insulina en neuronas GnRH cultivadas in vitro (Olson y col 1995). La administración de insulina directamente en el liquido cefalorraquídeo cerebral de corderos diabéticos restauró la secreción pulsátil de LH, sugiriendo un efecto central sobre la secreción de GnRH (Tanaka y col 2000), aunque no se puede descartar que los efectos de la insulina hayan sido indirectos a través de la modificación en la actividad de otras neuronas relacionadas con la secreción de GnRH (Sahu y col 1995, Porte Jr y col 2002, Kyriaki 2003). Reafirmando lo anterior, se ha demostrado una menor secreción de LH en ratones machos y hembras knockout para el receptor de insulina en el hipotálamo, y un menor conteo de espermios al presentado por el ratón salvaje (Wild-type) (Brünning y col 2000), lo que sugiere un importante rol directo de la insulina a nivel hipotalámico en el control de la secreción de GnRH.

En resumen, el test de tolerancia a la glucosa endovenosa es un método que permite dilucidar la sensiblidad a la insulina en animales experimentales, y reconocer que la restricción alimenticia en ovejas prepúberes está acompañada de resistencia insulínica como un mecanismo homeostático para permitir el uso de la glucosa en tejidos no insulino-dependientes.

AGRADECIMIENTOS

A los alumnos de medicina veterinaria: Francisca Arrate y Juan Pablo Muñoz por su ayuda con los experimentos. Al Dr. Mario Briones por su asesoría estadística.

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