El objetivo de este trabajo es mostrar los avances recientes en las investigaciones de la terapia génica para el tratamiento de la diabetes, planteando los avances obtenidos de acuerdo a los resultados de los diversos estudios realizados en condiciones experimentales controladas y presentando una perspectiva sobre el futuro de la aplicación de la terapia génica para la diabetes en pacientes humanos.
El texto abarca en primera medida las nociones básicas sobre la Diabetes Mellitus contrastando con datos de incidencia de la enfermedad a nivel mundial. En el transcurso del trabajo se presentan varios factores asociados a la enfermedad (como las condiciones hormonales y la regulación génica), encaminado hacia blancos para realizar tratamientos experimentales en ratones. La terapia génica en el tratamiento de la diabetes no se restringe a un solo modo, sino a varios, que a través de las investigaciones buscan la forma más efectiva de transferir genes terapéuticos a través de vectores más eficientes, que se expresen para obtener el resultado esperado.
Los resultados obtenidos experimentalmente en modelos biológicos como en los ratones se observa la disminución parcial o total en las patologías de la DM, no han sido aplicados en pacientes humanos. Con el apoyo a estas investigaciones se podrán desarrollar nuevos estudios para aplicar la terapia génica para el tratamiento de la diabetes como en otras enfermedades en pacientes humanos.
Palabras claves: Terapia génica, Diabetes Mellitus, Vector.
La Diabetes Mellitus (DM) comprende un grupo de trastornos metabólicos frecuentes que comparten el fenotipo de la hiperglucemia. Existen varios tipos diferentes de DM debidos a una compleja interacción genética y metabólica. Dependiendo de la causa de la DM, los factores que contribuyen a la hiperglicemia pueden ser por la deficiencia de la secreción de insulina, decremento del consumo de glucosa o aumento de la producción de ésta. El trastorno de la regulación metabólica que acompaña a la DM provoca alteraciones fisiopatológicas secundarias en muchos sistemas orgánicos, y supone una pesada carga para el individuo que padece la enfermedad y para el sistema sanitario.
De acuerdo a la Asociación Americana de Diabetes y la Organización Mundial de la Salud han formulado la clasificación de la diabetes en cuatro grupos; Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1), caracterizada por una destrucción de las células-ß pancreáticas, deficiencia absoluta de insulina, tendencia a la cetoacidosis y necesidad de tratamiento con insulina para vivir (insulino-dependientes); Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), caracterizada por una resistencia a la insulina o deficiencia de ésta. Comprende un grupo heterogéneo de pacientes, la mayoría obesos y/o con distribución de grasa predominantemente abdominal, con fuerte predisposición genética no bien definida. La DM2 implica niveles de insulina plasmática normal o elevada, sin tendencia a la cetoacidosis, responden a dieta de hipoglicemiantes orales, aunque con el tiempo requieren de insulina para su control, no es indispensable para preservar la vida del paciente (insulino-requirentes). En otros tipos de diabetes incluyen pacientes con defectos genéticos en las funciones de las células-ß que alteran la acción de la insulina y presentan patologías pancreáticas. También algunos fármacos o agentes tóxicos pueden producir diabetes secundaria. Por último se presenta la Diabetes Gestacional, que se caracteriza por hiperglucemia que aparece en el curso del embarazo. Se asocia a mayor riesgo presentar diabetes clínica en el embarazo y en el parto (60% después de 15 años). La diabetes gestacional puede desaparecer al término del embarazo o persistir como intolerancia a la glucosa o diabetes clínica (Diabetes mellitus: Definición y Etiopatogenia, 2011).
Actualmente, con la alta incidencia de esta enfermedad en el mundo, más de 220 millones de personas que padecen de diabetes según reportes de la Organización Mundial de la Salud (OMS), en los cuales muchos de estos casos son diagnosticados en pacientes cuando las alteraciones fisiológicas son graves, dificultando el tratamiento de esta enfermedad por métodos convencionales, llegando en muchos casos a optar por el trasplante de páncreas o de células-ß de los islotes pancreáticos para la producción de insulina por el propio paciente. Sin embargo se han presentado una serie de complicaciones con este tipo de procedimiento como el rechazo del tejido trasplantado al paciente por una respuesta autoinmunológica. Actualmente se están adelantando diversas investigaciones para el tratamiento de la diabetes, centrados en el campo de la bioquímica, genética y la biología molecular. La investigación y posterior aplicación de estrategias de transferencia de genes para desarrollar terapias intervencionistas para varias enfermedades han ido en aumento para curar o disminuir la progresión de enfermedades crónicas debido por anomalías genéticas y desequilibrio metabólico, el cual se mostrarán los avances y desarrollos más significativos de la terapia génica en diabetes.
La DM está relacionada con varios trastornos metabólicos que generan una serie de patologías, por eso el punto de partida para comprender el comportamiento de esta enfermedad es necesario conocer algunos factores hormonales y la relación genética de la enfermedad.
La Leptina es una hormona que restringe la secreción de insulina en el páncreas y promueve el catabolismo de glucosa en los tejidos periféricos como el hígado, el músculo esquelético y el tejido adiposo. Pero uno de los efectos de la diabetes es la disminución de esta hormona, produciendo una restricción en el transporte a través de la barrera hematoencefálica, evitando la metabolización de la glucosa y causando la hiperglicemia. Se han realizado experimentos utilizando la terapia génica en células del hipotálamo (donde se produce la leptina principalmente) en ratones, donde han demostrado la reposición de la leptina in vivo, según la investigación por Kalra (2009), la restitución de la homeóstasis energética por el suministro de bioactivos de leptina superaron la insuficiencia de esta hormona por largos períodos de tiempo. Entre los diversos vectores virales utilizados para transferir genes se han utilizado el adenovirus recombinante (rADV) y el virus adeno-asociado recombinante (rAAV). Sin embargo, se han presentado algunas dificultades al momento de transferir el material genético, en este caso el rADV al transferir el gen va a tener poca integración con el genoma del hospedero, porque un alto nivel de expresión del transgen sólo se va ha dar de forma transitoria y rápida provocando una reacción inmune fuerte a la proteína viral. La replicación deficiente del rAAV no produce una reacción inmune, lo cual puede transferir genes de forma segura al hospedero, después de la integración en el genoma del huésped se da la expresión del transgen durante la vida útil de la célula. Todo esto expondría una ventaja ideal para el tratamiento de la diabetes para establecer el control de la glucemia, sin alterar o perturbar mínimamente las interacciones homeostáticas y fisiológicas con la transferencia del gen de la leptina.
En investigaciones recientes, la terapia génica de la leptina está destinada para sustituir el tratamiento médico de la inyección de insulina. Esta terapia con leptina ha demostrado la reducción de la hiperglicemia y la hiperfagia en ratones diabéticos con insuficiencia de insulina. En estos ratones se les indujo la deficiencia de insulina con un fármaco llamado estreptozotocina (STZ) y luego se utilizó el rAAV que introdujo el gen de la leptina (rAAV-lep). En los ratones inducidos con la deficiencia de insulina murieron a la semana 6. En cambio a los ratones que fueron tratados con el gen de la leptina (rAAV-lep), evitó la muerte prematura de los ratones tratados con STZ porque se elevaron los niveles de leptina en el hipotálamo. En general los buenos resultados en esta investigación fueron demostrados porque en los ratones hubo una marcada reducción de la hiperfagia, se normalizaron los niveles sanguíneos de glucosa y hubo en retorno parcial en la funcionalidad de las células-ß de los islotes según Kojima et al. (2009). Estos resultados sugieren una nueva alternativa en el tratamiento de la diabetes mellitus, en este caso la leptina sería un sustituto de la insulina para el tratamiento en pacientes diabéticos, ya que permitiría reducir los niveles glucosa en la sangre en ausencia de la insulina.
Won et al. (2009) toma en cuenta la regulación génica de la glucosa, donde se han buscado alternativas de terapia génica. Se plantea que la expresión de los genes es modulada por la glucosa y por ende afecta la variación de la glicemia en el torrente sanguíneo. Cuando los niveles de glucosa son muy elevados y las células-ß están expuestas a estos incrementos de la glicemia, tendrá un efecto citotóxico, conocida particularmente como glucotoxicidad, comprometiendo la supervivencia celular y la expresión génica de estas células. El tratamiento convencional de la diabetes mellitus tipo 1 (DM1) se realiza por inyecciones de insulina a diferentes regímenes, pero el control glicémico no va hacer tan preciso como la proporcionada por la dinámica natural de la insulina por factores fisiológicos inherentes a esta hormona polipeptídica, por eso la terapia génica encaminada a solucionar estos problemas de desequilibrio de la glicemia es crear células-ß artificiales transgénicas para producir insulina por medio de la transferencia del gen de la proinsulina, gen transferido por un vector viral (adenovirus), cuando sean implantadas (solamente estudios realizados en ratones) estas células van a ser capaces de secretar insulina de células autólogas más potentes para revertir este desequilibrio metabólico no logrado por las células-ß originales. Sin embargo, aunque la expresión de la insulina transgénica es sensible a la glucosa, ninguno de los ensayos con terapia génica para inducir la producción de insulina hasta la fecha ha sido capaz de imitar completamente el funcionamiento normal de las células- ß con respecto a la estricta regulación de la insulina en las condiciones fisiológicas naturales.
Hasta el momento, las investigaciones de la terapia génica para el tratamiento de la diabetes se han utilizado vectores virales, dando la percepción que serían los únicos vectores utilizados en cualquier terapia génica. Cabe aclarar que los vectores virales son los que mejor transfieren el material genético a la célula huésped, pero en la siguiente investigación realizada por Hou et al. (2011) se construyó un plásmido no viral liberado por vía intramuscular, que transfieren el gen que codifica la proinsulina (PI), la regeneración pancreática (Reg) y la proteína III (pReg/PI). Esta investigación fue probada en ratones inducidos con STZ para inducir la deficiencia de insulina. Los resultados en esta investigación mostraron que la liberación intramuscular de pReg/PI reduce significativamente los niveles de hiperglucemia, aumentando el contenido de insulina sanguínea en los ratones tratados, también mostró una restauración en el balance de citoquinas TH1/TH2 y linfocitos T, recordemos que la DM1 se caracteriza por presentar autoinmunidad en las células-ß, con cuadros de inflamación en el tejido pancreático y por ende destrucción celular aminorando la producción de insulina, al restaurar el balance de las citocinas y los linfocitos T habrá una tolerancia a la autoinmunidad, regenerando estas células y la secreción de insulina. El tratamiento retrasó la aparición de DM1.
Sin duda uno de los problemas más significativos en los tratamientos médicos de la diabetes es la respuesta autoinmune del paciente cuando se implantan células-ß, que acarrean una destrucción de estas células, agravando los cuadros clínicos de la enfermedad. La terapia génica también se esta encaminado hacia las células-ß para inducir la tolerancia inmune a través de la modificación genética de células autólogas (Obtenido de los propios tejidos del paciente) por medio de vectores retrovirales, según en estudios realizados por Zhang et al. (2010) la terapia génica en células-ß aminoran la fusión del antígeno-Ig con las proteínas de las células-ß transducidas, mostrando una tolerancia a las citoquinas TH1 y TH2, por de cortes histológicos con tinción de la columna, en la parte lumbar, mostraron una disminución en la infiltración de células mononucleares del sistema nervioso central y de anticuerpos en general. Esto sugiere que al utilizar un pretratamiento en las células-ß autólogas no se presentarán reacciones autoinmunes en el paciente después del trasplante de dichas células, restituyendo las funciones pancreáticas en cuanto al suministro de insulina para controlar los niveles de glicemia en la sangre.
Uno de los tratamientos más utilizados para aminorar las patologías producidas en la DM1 es el implante de células-ß en pacientes que padecen esta enfermedad, para inducir la secreción de novo de insulina a largo plazo. Sin embargo, las complicaciones de este procedimiento están enmarcadas por respuestas inmunológicas, citotoxicidad y apoptosis en las células-ß. En respuesta se está desarrollando la modificación genética de las células-ß por medio de la terapia génica como estrategia para mejorar el trasplante de estas células secretoras. Los vectores virales y liposomas han sido los más utilizados para la transfección del material genético deseado a estas células-ß, pero representan una serie de problemas de bioseguridad y dificultades técnicas. Según Kang y Bae (2007) el uso de vectores virales con frecuencia ha planteado problemas de toxicidad, mutagénesis, carcinogénesis y respuestas antivirales; con las limitaciones técnicas contamos con una capacidad de carga limitada de genes y la producción de vectores de difícil purificación. El transporte liposomal de genes a menudo da como resultado ineficaces expresiones génicas. En respuesta a esta serie de dificultades se están desarrollando los vectores funcionales poliméricos (vectores no víricos) para transferir genes en las células-ß para inducir la secreción de la insulina, el transporte polimérico de genes tienen un perfil favorable de seguridad, como bajas respuestas inmunes y no inducen a la oncogénesis. Las buenas características de estos vectores poliméricos radican en la facilidad en la producción, control de calidad fiable, buen almacenamiento y la capacidad casi ilimitada de carga de plásmidos de DNA, realizando la transfección en las células-ß antes de la implantación en los pacientes, garantizando la prolongación del período de expresión génica para la producción de insulina. Debido a que el DNA es una molécula con carga negativa neta y de alto peso molecular, no puede penetrar en las células por sí misma. Además es susceptible al ataque de enzimas, requiriendo un vector para su liberación. El estado actual en el desarrollo de vectores no virales para terapia génica está dirigido hacia la preparación y evaluación de materiales alternativos que puedan dar lugar a altos valores de transfección y proporcionando apropiadas respuestas celulares. Los derivados acrílicos de la pirrolidina y de la morfolina forman complejos electrostáticos con ADN dando lugar a la formación de nano partículas entre 50-200 nm, que poseen una buena biocompatibilidad (Polímeros sensibles a estímulos. Nuevos vectores poliméricos para terapia génica, 2011), en la investigación anterior se utilizó derivados de sulfonilurea como medio de transfección de plásmidos de DNA, formando un complejo de transfección de PLLSU/pDNA.
El silenciamiento de receptores de membrana en células-ß como el Fas (CD95), y su ligando FasL han sido considerados un elemento clave en la patogénesis de la diabetes, porque sería un factor de apoptosis en estas células. Según Jeong et al. (2010) el silenciamiento del Fas con siRNA (RNA pequeño de interferencia, en inglés) transportada por un vector polimérico (PEI) e inyectada por vía intravenosa en ratones que fueron inducidos a la diabetes. Estos ratones tratados mostraron una reducción de la diabetes por 40 días, lo que sugiere que la deficiencia en la secreción de insulina en el páncreas se atenúa. Se concluye que el silenciamiento en los receptores de membrana Fas (CD95) y el ligando FasL son blancos terapéuticos viables para el tratamiento de la DM1.
Según Samuel et al. (2010) las complicaciones en la diabetes que sufren los pacientes están acompañadas de enfermedades coronarias, enfermedad arterial periférica y accidentes cerebrovasculares, todas ellas relacionadas con la alteración de la angiogénesis. Recordemos que la angiogénesis es el proceso fisiológico que consiste en la formación de vasos sanguíneos nuevos a partir de los vasos preexistentes. Varios estudios han vinculado la diabetes con la angiogénesis, impidiendo la mediación en la degradación de la membrana basal en los vasos sanguíneos, alterando el delicado equilibrio de factores de crecimiento angiogénicos y citoquinas que regulan la estabilidad vascular, problemas en la transducción de señal y en gran medida a la diabetes mediada por el estrés oxidativo. La evidencia sugiere que las especies reactivas al oxígeno (ROS) y el estrés oxidativo es el principal contribuyente de la disfunción vascular en el miocardio que compromete negativamente la recuperación de estas condiciones. La reversión de la diabetes y por ende de las demás complicaciones fisiológicas fue evaluada en ratones diabéticos por la administración intramiocárdica de un vector viral del adenovirus thioredoxin-1 (Ad.Trx1) para codificar la tiorredoxina. La tiorredoxina (TRX) es una proteína antioxidante que redujo el estrés oxidativo en células del miocardio, demostrado por una sobre expresión de TRX en este tejido a través de análisis de Western Blot y pruebas inmunohistoquímicas. Esta investigación demostró que el miocardio infartado puede ser rescatado del deterioro de la angiogénesis relacionada con la diabetes y reducir el trastorno funcional del miocardio con terapia génica de TRX1.
La DM genera baja cicatrización de heridas en los pacientes de edad avanzada. Según las investigaciones realizadas por Lu et al. 2009 en ratones, relacionan los factores que causan la baja cicatrización con la expresión reducida del factor 1a de transcripción inducible por hipoxia (HIF-1a). La terapia génica con fue desarrollada con el plásmido gWIZ-CA5, siendo transferidas por medio de electroporación en células HEK-293T, luego inyectadas por vía intradérmica. Los resultados mostraron que el mRNA del HIF-1a, o sea la transcripción del gen que codifica para el HIF-1a fueron inhibidos, las heridas en los tejidos evaluados en los ratones se redujeron significativamente, con una rápida cicatrización. La expresión de mRNA que codifica para el HIF-1a, producen las citoquinas angiogénicas, el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), la angiopoyetina 1 y 2 (ANGPT1, ANGPT2), factor de crecimiento derivado de plaquetas B (PDGF-B) y el factor de crecimiento placentario (PlGF) que también están relacionadas con la alteración de las heridas en los ratones. Estos factores contribuyen a respuestas inflamatorias anormales. En general estos resultados ponen en manifiesto la utilización de la terapia génica en el tratamiento indirecto de la diabetes, como la actividad sinérgica de múltiples factores angiogénicos juega un papel crítico en la respuesta vascular en una herida.
Un punto de partida importante es el estudio genético de la enfermedad, permitiendo establecer unas bases sólidas para comprender la patogenia de la enfermedad, sus diferentes formas en que pueden afectar al paciente que padece de diabetes. Otro punto que cabe resaltar es el estudio de distintas metodologías para realizar una terapia génica, en este caso la utilización de los vectores virales son los mas difundidos, hay que tener en cuenta que en diversas investigaciones se utilizan controles positivos para medir la eficiencia de transfección del gen por vectores virales. De acuerdo a investigaciones realizadas por Han et al. (2008) comparan la transducción de dos vectores virales adeno-asociados, AAV-1 y AAV-2 en ratones, los cuales el AAV-1 se reportaron mayores incrementos de expresión génica que en el AAV-2 en la regulación de las citoquinas TH1 y TH2.
Los avances más significativos en la terapia génica en diabetes encontramos la inducción en la regulación de factores hormonales como en la leptina que estimula la metabolización de la glucosa en pacientes con insuficiencia de insulina, la regulación génica de la glucosa, la transgénesis de las células-ß autólogas para la producción de insulina de novo, o el tratamiento de problemas autoinmunes asociadas a la enfermedad en especial a la diabetes mellitus tipo 1 cuando se trasplantan células de los islotes pancreáticos.
Los desarrollos más relevantes incluyen la utilización de los vectores virales como el adenovirus y los adeno-asociados, sin embargo pueden presentar reacciones inmunes a causa de los mecanismos de replicación viral. En respuesta a esto se están desarrollando vectores poliméricos los cuales tienen la capacidad de transportar y transducir material génico suficiente para generar en las células diana los efectos deseados para la reparación de cualquier complicación fisiológica.
Los resultados obtenidos experimentalmente en modelos biológicos como en los ratones han sido efectivos, observándose la disminución parcial o total en las patologías producidas por la diabetes, no han sido aplicados en pacientes humanos. En perspectiva con el apoyo de estas investigaciones se podrán desarrollar nuevos estudios para aplicar la terapia génica como tratamiento de la diabetes en pacientes humanos.
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Autor:
Cristhian D. Gaitán García,
Laura B. Alzate Troncoso,
Milton D. Rincón González
Estudiantes de Pregrado
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
Ibagué, Tolima, Colombia
2011