La fijación de embriones tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el completo conocimiento de su constitución íntima.
Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agentes físicos que se utilizan para tal fin.
Cualidades que debe tener un fijador:
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los fenómenos agónicos o post – mortem (autolisis, desintegración, etc.)
2. Poseer ato poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, colorantes, etc.)
5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.
6. No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
Manera de actuar de los fijadores
Varia con la composición o naturaleza de los mismos: coagulando las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reducciones en contacto con las mismas y originando en su seno precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración ulterior de los tejidos (recuérdese que éstos, en su mayoría, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molécula de hidrógeno con su cromóforo)
Fijadores Químicos
Son los más utilizando; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia química, y fijadores compuestos o mezclas fijadores cuando varias sustancias intervienen en su constitución.
1. Fijadores Simples
a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios embriológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc)
d) Acido ósmico al 1 ó 2 %, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3 – 5%.
2. Fijadores Compuestos
En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno o atenuar sus defectos.
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo – osmio – acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato – sublimado – acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker – formol
d) Líquido de Bouin, mezcla picro – formos – acética.
e) Líquido de Duboscq – Brasil, o Bouin alcohólico.
Fijadores Físicos
1. Disecación
2. Calor Seco
3. Calor húmedo
4. Frío
5. Congelación y desecación.
2.3 HISTOQUÍMICA
La histoquímica es la técnica para localizar sustancias químicas específicas o sitios de actividad química en las estructuras morfológicas que se han perturbado lo mínimo posible. Por lo general se congela inmediatamente el tejido o embrión en nitrógeno líquido y se secciona con un micrótomo especial de baja temperatura que recibe el nombre de criostato. A se coloca el tejido en un portaobjetos de vidrio y se somete a una reacción química específica que conduce a la deposición de un producto coloreado en el sitio de la actividad enzimática o en el lugar en donde se concentran ciertas moléculas. En algunos casos es posible obtener una solución muy detallada de las reacciones histoquímicas en los microscopios electrónicos. Una desventaja de la histoquímica a nivel del microscopio de luz es que las técnicas de teñido no suelen mostrar con gran claridad los rasgos estructurales específicos del embrión u órgano.
Para llevar a cabo la observación histoquímica han de plantearse una serie de operaciones destinadas a la obtención de preparaciones de tejido, fijadas y susceptibles de ser apreciadas con nitidez al microscopio. En tal contexto se diferencian técnicas tales como la microdisección, la preparación de secciones aplicadas al análisis y al control de perdurabilidad del tejido con un instrumento específico de corte microscópico llamado microtomo, o la sedimentación fraccionada de preparados homogeneizados.
El hecho de que la experimentación histoquímica haya de realizarse necesariamente al microscopio, hace que sólo sean válidos en su ámbito aquellos métodos de análisis químico que induzcan en las sustancias objeto de estudio una serie de propiedades ópticas o que puedan registrarse fotográficamente. Tal es el caso de las técnicas colorimétricas, las de fluorescencia o las de medición de radiación. Por cuanto se refiere a la fijación de las preparaciones, entre las diversas modalidades a las que se recurre, cabe reseñar el uso de múltiples soluciones de fijación, la congelación de cortes histológicos o la liofilización o deshidratación al vacío.
2.4 AUTORRADIOGRAFÍA
Uno de los productos derivados de la era atómica ha sido la extensa disponibilidad de isótopos radiactivos como herramientas en las investigaciones bioquímicas. Los precursores de las macromoléculas que contienen átomos marcados radiactivamente pueden introducirse en un sistema biológico y después rastrearse a través de un ciclo metabólico por diversos medios analíticos, uno de los cuales es la llamada autorradiografía, técnica que permite localizar un isótopo radiactivo, al interior de las células o tejidos, mediante técnicas semejantes a los que se utilizan en fotografía.
Típicamente se coloca un embrión o parte de él en una solución que contiene un aminoácido radiactivamente marcado o un precursor de DNA o RNA. Después de un lapso dado, se extrae el embrión de la solución radiactiva y se secciona para analizarse en el microscopio, pero además de los procedimientos histológicos normales, las secciones de tejidos se cubren con una emulsión fotográfica, conservándose en la oscuridad durante varias semanas. Las emisiones radiactivas del isótopo, las cuales se han incorporado a las proteínas o ácidos nucleicos del embrión, impiden la emulsión durante el periodo de exposición. A continuación la emulsión se revela, de manera muy semejante a las películas fotográficas. Después se depositan gránulos de plata en la emulsión sobre las células que contienen átomos marcados para utilizarlos como guía, con objeto de localizar las estructuras marcadas en el microscopio.
La autorradiografía en la actualidad se emplea de manera sistemática tanto con microscopios de luz y electrónicos. Con las técnicas de procesamiento común, la autorradiografía está limitada a ubicar macromoléculas marcadas que no se disuelven al exterior de los tejidos. Se han desarrollado técnicas autorradiográficas más novedosas y minuciosas para la localización de sustancias solubles como las hormonas esteroides, que requieren la congelación inmediata de los tejidos para a continuación secarse de forma tal que no se lleve a cabo el desalojamiento de los compuestos solubles marcados.
Las técnicas autorradiográficas son de gran utilidad para ubicar sitios de actividad sintética de ácidos nucleicos y proteínas en embriones, así como para rastrear el movimiento de las células, aunque no permiten el análisis directo de sus formas químicas en los tejidos. Por ello, es muy importante emplear moléculas precursoras correctamente marcadas y reconocer las trampas latentes que pueden conducir a la mala interpretación de los resultados.
Una técnica autorradiográfica que promete acortar la distancia entre la morfología y la biología molecular es la hibridación in situ. Ahora que ya es posible construir en el laboratorio DNA complementario (cDNA) para RNA específicos, los DNA radiactivos pueden añadirse a secciones de tejidos que se sospeche que contengan el mRNA en cuestión. En caso de que ese RNA esté presente, el DNA marcado se hibridiza con los nucleótidos correspondientes del RNA. Cuando el cDNA se enlaza estrechamente al RNA, la autorradiografía se prepara en la forma estándar, y la presencia de gránulos de plata indica la ubicación de las moléculas del RNA en la célula o el tejido.
2.5 RASTREO
Se han utilizado muchos tipos de marcadores para rastrear los movimientos de las células en el embrión en crecimiento. Algunos de los estudios clásicos de movimientos celulares implican la aplicación de marcadores no tóxicos a pequeños grupos de células. Los tipos de tintes que pueden aplicarse a las células vivientes sin dañarlas, como el sulfato azul de Nilo y el rojo neutro, reciben el nombre de colorantes vitales. Los cambios de posición de las células tratadas con estos colorantes pueden seguirse durante el transcurso de un periodo extenso de crecimiento, antes que el colorante se torne tan difuso que resulte imposible su identificación. Tendremos ocasión para considerar la aplicación de dichas técnicas con relación a los movimientos celulares en la gastrulación de anfibios. La marcación también puede llevarse a cabo al colocar en pequeños grupos de células partículas de carbón fisiológicamente inerte, finamente dividido, como las de carbón de sangre. Los resultados de experimentos en los que participan las marcaciones de carbón se utilizarán cuando se hable de los movimientos celulares en la vecindad de la línea primitiva del polluelo.
Una innovación reciente en las técnicas de rastreo consiste en inyectar a las células diminutas cantidades de peroxidasa de rábano picante (PRP), enzima distribuida por toda la célula y cuya presencia puede mostrarse por varias reacciones. Cuando se divide una célula que tiene PRP inyectada, la enzima se distribuye en las células hijas. Puesto que persiste en la progenie celular, la PRP se ha tornado en una importante herramienta para mapear linajes celulares. La peroxidasa de rábano picante pueden inyectarse en una de las células del embrión temprano, al cual se le permite desarrollarse por algún tiempo parea después seccionarse.
Las células que descienden de una célula marcada originalmente con PRP retienen la marca, en tanto que estará ausente en las demás células del embrión. Debido a que tiende a distribuirse por toda la célula la PRP también se inyecta en células neurales en desarrollo, donde se difunde a través de sus procesos largos, permitiendo al investigador valorar la dirección que toman los procesos y con qué otras células se conectan.
Las células en que se ha marcado el DNA sustancialmente con isótopos radiactivos se utilizan para la localización en extremo precisa de células emigrantes. Este tipo de marcación isotópica tiene la desventaja de que cada división celular diluye a la marca, lo cual hace una técnica adecuada para rastreos a largo plazo de células que se dividen con rapidez.
Una categoría importante de marcación, en especial para el rastreo de células a largo plazo, es la de los marcadores "naturales". Al introducir células en un embrión que difieren de las del huésped por su tamaño, pigmentación, tipos isoenzimáticos, complementos cromosómicos o número de nucléolos, se produce un marcador estable. La cromatina sexual se ha empleado con cierto éxito, aunque los principales avances más recientes en cuanto a las técnicas de rastreo implican la utilización de células de codorniz japonesa como injertos marcadores en embriones de pollos. Las diferencias en el tamaño nuclear y la morfología, así como la facilidad para injertar los segmentos de tejido de codorniz en los sitios homólogos de los embriones de pollo, han permitido a los investigadores solucionar una serie de antiguos problemas relativos al origen celular y a la composición de ciertos tejidos y órganos.
2.6 INMUNOLOGÍA
Las células de diferentes tipos, o aun las distintas etapas de desarrollo de un mismo tipo de célula, contienen diferentes proteínas y polisacáridos en el citoplasma o en sus membranas de superficie. Estas macromoléculas son antigénicas; es decir, cuando se inyectan en otro animal, como el ratón o conejo, ocasionan que sus células inmunes formen anticuerpos en contra de ellas. Al prepararse los anticuerpos adecuadamente en contra de antígenos específicos, pueden ser de gran valor en los estudios de desarrollo en tanto es posible emplearlos para descubrir en un tejido u órgano la presencia o ausencia específica de la molécula antigénica en cuestión. En la investigación embriológica es común tomar una sección de tejido que se sospecha contiene un antígeno, para cubrirlo con un líquido que contiene un anticuerpo en contra de ese antígeno. Si el antígeno está presente en el tejido, el anticuerpo se combina con él. Este complejo antígeno-anticuerpo no puede investigar estáticamente, por lo que a continuación suele añadirse un segundo anticuerpo dirigido al primero. Sin embargo, el segundo forma un complejo con la molécula marcadora, por lo general una que posee propiedades fluorescentes, de modo que el marcador podrá descubrirse con un microscopio de fluorescencia, y así su localización en el tejido indicará la presencia del antígeno en cuestión. Inmunocitoquímica es el nombre que suele recibir el proceso de ubicación de moléculas específicas en tejidos mediante anticuerpos.
Existe una nueva y poderosa técnica inmunológica que implica la producción de anticuerpos monoclonales, diseñada para producir anticuerpos excepcionalmente puros y específicos. Aunque Milstein ha compendiado bien los detalles de esta técnica, en pocas palabras consiste en inyectar primero un antígeno a un ratón.
Después se extraen las células productoras de anticuerpos del bazo del ratón y se fusionan con una célula del tipo de tumor conocido como mieloma. Las células fusionadas (que ahora se llaman hibridomas) pueden conservarse en cultivo. Cuando un hibridoma produce un anticuerpo de interés, se cultiva como un solo clono y se permite su multiplicación. Así, todos sus descendientes celulares producirán la misma variedad, altamente específica, del anticuerpo monoclona, y mediante una técnica de cultivo adecuada, podrán preservarse casi indefinidamente como fábricas de ese anticuerpo específico.
Las técnicas inmunocitoquímicas que se dirigen tanto a las células como a los componentes de la matriz extracelular han proporcionado valiosa información con respecto a la localización de cantidades diminutas de antígenos importantes en el desarrollo, así como del momento de su aparición a medida que avanza el desarrollo.
2.7 TéCNICAS MICROQUIRÚRGICAS
Mucha de la información fundamental sobre los mecanismos causales en el desarrollo embrionario, sobre todo los que implican interacciones de tejidos, se ha obtenido a través del uso de técnicas microquirúrgicas. El trabajar con embriones que a menudo no miden más de algunos milímetros ha requerido el desarrollo de herramientas especiales, como las agujas de vidrio o tungsteno y las asas de cabello de lactante, en vez de los bisturís y fórceps que comúnmente se relacionan con la cirugía usual. Para el trabajo con embriones en extremo pequeños o con grupos de células se utilizan micromanipuladores en lugar de manos para tomar los instrumentos.
Las técnicas microquirúrgicas se utilizan en muchos tipos de experimentos, y una de las más sencillas es la ablación o extirpación de la parte de un embrión para valorar el efecto que tendrá la ausencia de esa estructura en el embrión restante. El trasplante y explante son técnicas quirúrgicas muy comunes y tienen amplias aplicaciones en la investigación embriológica.
El explante consiste en extraer una pequeña muestra de tejido embrionario y desarrollarlo en un medio artificial, si bien esta técnica puede manejarse de diferentes formas. Uno de los métodos estriba en injertar el tejido extirpado en un organismo huésped al interior de un sitio específico bien abastecido de nutrimentos, pero que deberá crecer y diferenciarse sin influencia de los otros tejidos de su propio cuerpo que normalmente lo rodean. Al trabajar con embriones de aves es común explantar un grupo pequeño de células de un individuo joven en la membrana corioalantonica de un huésped de mayor edad.
Entre los embriones de mamífero, los sitios favorables son las cámaras anteriores del ojo la región vascular del peritoneo. Los experimentos con explantes han proporcionado mucha información acerca de la forma en que el tejido se adapta y diferencia en un sitio nuevo. Por otra parte, algunos primordios embrionarios exhiben una asombrosa capacidad de autodiferenciación, indicando que hay suficiente información al interior de los tejidos trasplantados para dirigir el desarrollo del órgano.
En los estudios embriológicos los tejidos algunas veces se trasplantas a otros del mismo embrión (autoinjerto), aunque los tejidos u órganos de un embrión donante con frecuencias se injertan en huéspedes de especies diferentes (heteroinjerto) o incluso de distinto orden (xenoinjerto). Algunos tipos de experimentos con trasplantes implican cambios o rotaciones menores en los tejidos, si bien en otros tipos, la estructura embrionaria se desplaza en gran medida de su ubicación normal. Se ha encontrado que los tejidos embrionarios trasplantados y los tejidos del huésped no permanecen pasivamente lado a lado, ya que antes bien ejercen profundas influencias en el curso de desarrollo de sus nuevos vecinos. Como se verá, los ejemplos de este tipo de influencia han sido particularmente asombrosos en el campo de la inducción embrionaria.
En una aplicación reciente de trasplantes, no se implicaron tejidos u órganos sino componentes de células individuales. Mediante la técnica de trasplante nuclear desarrollada por Brigss y King (1952), Gurdon (1962) trasplantó el núcleo del epitelio intestinal de una rana (xenopus) posmetamórfica, a un huevo cuyo núcleo se había inactivado con radiación ultravioleta (UV), dando como resultado el desarrollo de una rana adulta. Este experimento demostró que hasta el núcleo de una célula epitelial intestinal contiene suficiente dotación de información genética para guiar el desarrollo de un animal maduro completo desde el huevo.
Por lo menos en un caso se ha empleado la técnica de trasplante con fines comerciales. Un grupo de criadores sudafricanos de ganado lanar deseaba criar una cepa especial de ovejas originarias de Escocia. El transporte de una cantidad suficiente de borregos maduros a Sudáfrica requería un largo y costoso viaje. El problema se resolvió extrayendo óvulos recién fecundados de las ovejas escocesas para trasplantar los embriones tempranos en úteros de conejas, las cuales a a continuación se enviaron por avión a Sudáfrica, donde se les extrajeron los embriones de borrego y de nuevo se trasplantaron en los úteros de las ovejas hembras locales. A su debido tiempo, las ovejas sudafricanas parieron borregos normales de la cepa escocesa, para así completar la transferencia a larga distancia del rebaño de ovejas.
La aplicación clínica de la técnica de transferencia embrionaria tuvo como consecuencia el nacimiento del primer ser humano concebido al exterior del útero en el caso de una mujer inglesa que no podía embarazarse debido a un bloqueo en las Trompas de Falopio que prevenía que los huevos ovulados llegaron al útero. Dos biólogos de reproducción, Robert Edwards y Patrick Steptoe, obtuvieron un óvulo de los ovarios de esta mujer y lo fecundaron in vitro con el espermatozoide del esposo. Se permitió que el embrión se desarrollara hasta la etapa de ocho células y a continuación lo trasplantaron al útero de la mujer. El embrión se implantó en el revestimiento uterino, dando como resultado un embarazo sin problemas y el nacimiento de una niña normal.
2.8 TéCNICAS DE CULTIVO
Una de las formas más interesantes de estudiar el desarrollo embrionario estriba en cultivar componentes de embriones, y hasta embriones completos, en un medio artificial. Según la naturaleza del material explantado, las técnicas se conocen como cultivo de células, tejidos, órganos e incluso de embriones completos. Cada tipo de cultivo requiere métodos ligeramente distintos, pero el principio es el mismo.
El material embrionario se coloca en platos o tubos de vidrio o plástico y se rodea con un medio de cultivo artificial, diseñado para semejarse en la mayor medida posible al medio que circunda al material en su sitio normal embrionario. El medio de cultivo ideal se define químicamente en su totalidad; sin embargo, con frecuencia es necesario añadir factores biológicos indefinidos como suero, y hasta extractos de embriones completos, para proveer los factores de crecimiento necesarios. Existe cada vez mayor conocimiento que la naturaleza del sustrato que se coloca en las células, sea el plástico del plato o el material adicional de matriz extracelular, es una determinante considerable para el éxito del cultivo.
El método de cultivo se desarrolló en un experimento revolucionario realizado por Ross G. Harrison (1907) en su interno por encontrar un método que demostrará el crecimiento nervioso. A partir del tiempo transcurrido desde sus investigaciones pioneras, los métodos de cultivo han contribuido enormemente a nuestra comprensión de los procesos de desarrollo. En la actualidad, el cultivo de tejidos o de rudimentos de órganos es con frecuencia sistemático, y en algunos tipos de células como el corazón es posible producir clonos diferenciados de células precursoras individuales. En años recientes ha crecido el interés por los cultivos de órganos complejos y de embriones de mamíferos completos: si embargo, los avances en el refinamiento de las técnicas de este tipo suelen ser lentas, y el trabajo, por ende, frustrante.
Una ventaja importante de las técnicas de cultivo radica en que el medio circundante o el tejido mismo puede alterarse a menudo en ciertas formas que serían imposibles in vivo. Una desventaja, sobre todo en los cultivos de células y tejidos, es que en ocasiones es difícil distinguir entre los procesos que sólo operan en condiciones de cultivo y los que suceden naturalmente en el embrión.
2.9 TéCNICAS BIOQUÍMICAS Y MOLECULARES
El análisis bioquímico de los tejidos embrionarios, en particular con el uso de las técnicas más recientes de la biología molecular, constituye una de las formas de más rápido crecimiento para estudiar el desarrollo. Las técnicas bioquímicas que se utilizan para investigar los sistemas embrionarios incluyen casi todas las que hoy día se usan en la bioquímica, motivo por el cual tan sólo se mencionarán categorías generales en el espacio que se asigna a esta sección. Entre los métodos más antiguos están las técnicas puramente químicas diseñadas para investigar la presencia o ausencia de compuestos específicos y sus cantidades. El tratado de Neddham (1931) resume mucho de este material. El análisis de la actividad enzimática con frecuencia se emplea en los estudios sobre las propiedades metabólicas del embrión.
En estos experimentos se permite que se lleve a cabo una reacción química que implique la mediación de una enzima (como sucede en la mayor parte de las reacciones biológicas) y a continuación a menudo se mide el producto (por lo general por medios espectrofotométricos) y se compara con una curva de referencia.
Los métodos de separación se utilizan ampliamente en los estudios de embriones. Las primeras técnicas de este tipo fueron la cromatografía del papel y la electroforesis, las cuales hacen uso de las propiedades físicas de compuestos, como los aminoácidos o proteínas, que les proporcionan diferentes propiedades migratorias en soluciones o campos eléctricos Entre las moléculas que pueden separarse mediante la electroforesis se encuentran las isoenzimas o isozimas, que son formas diferentes de moléculas con la misma actividad enzimática, pero con estructuras ligeramente distintas que les permiten separarse entre sí. Como las diferentes formas de la isozima de una enzima dada con frecuencia se constituyen n por poblaciones individuales de tipos de células en diversos momentos, suelen ser buenos marcadores del desarrollo.
Otra familia de las técnicas de separación es la que implica la centrifugación de soluciones u homogenados de tejidos que contienen macromoléculas. Después de centrifugarse prolongadamente a altas velocidades, las fracciones subcelulares o diferentes clases de macromoléculas se estratifican según su tamaño o densidad.
Los métodos de columnas cromatográficas se desarrollaron para separar muchas clases de compuestos, según sus diversas características físicas. En las técnicas de columna típicas, se carga una columna con cuentas u otros materiales diseñados para permitir la migración diferencial de las moléculas y se añade al tubo una solución que contenga una familia de macromoléculas, por lo general, ácidos nucleicos. Se permite que el líquido de la columna gotee en la parte inferior hacia un colector de fracciones, un recipiente de algún tipo lleno de tubos. Los tubos se mueven en intervalos periódicos y su contenido de material molecular refleja la velocidad del paso de las moléculas a través de la columna. A continuación es posible examinar el líquido para observar el contenido de las moléculas en cuestión. Si se ha empleado también marcación isotópica, como sucede por lo regular, se analiza cada tubo para medir la radiactividad.
Se ha diseñado asimismo una serie de técnicas altamente especializadas para demostrar especies particulares de ácidos nucleicos contenedores de información. Estas técnicas aprovechan la secuencia única de las bases que constituyen la cadena del DNA o RNA e implican la hibridación de una cadena sencilla de DNA con una de DNA o RNA, de forma tal que hay un emparejamiento de conjuntos complementarios de bases. Las técnicas de hibridación han resultado ser muy valiosas para demostrar la presencia o ausencia de secuencias específicas de bases en los ácidos nucleicos de las células embrionarias.
Algunos de los avances recientes más impresionantes en nuestro conocimiento del desarrollo incluyen la aplicación de nuevas tecnologías genéticas, entre las que se incluyen la preparación del DNA recombinante, la construcción de genes sintéticos y la capacidad de preparar sondas moleculares específicas. La tecnología de recombinación del DNA perite la producción de grandes cantidades de una secuencia dad de DNA, lo cual se logra mediante la ayuda de plásmido, pequeñas moléculas circulares de DNA que se reproducen de forma independiente en las bacterias. Tanto el DNA de eucariote como el DNA del plásmido se someten a un tratamiento simultáneo de una familia de enzimas de restricción que segmentan las cadenas del DNA en combinaciones específicas de pares de bases. Ambos fragmentos que se desprenden del DNA del eucariote se adhieren nuevamente al DNA del plásmido y reconstituyen un nuevo círculo que incluye un segmento del DNA eucariótico. Cuando se introducen estos plásmidos recombinantes en bacterias como Escherichia coli, el DNA plasmático se replica y el DNA eucariótico también se transcribe. Dado que las bacterias poseen un proceso casi ilimitado de multiplicación, la enzima de DNA eucariótico puede producirse en grandes cantidades, y la información genética en el DNA puede entonces utilizarse para originar productos genéticos, como las hormonas de proteína. Una de las primeras aplicaciones de la tecnología de DNA recombinante fue la producción de insulina humana.
Una variedad muy útil de sondas moleculares es la de la molécula cDNA, que puede producirse al incubar una mezcla de mRNA definido, nucleótidos y la enzima transcriptasa inversa, que permite la síntesis de una sola cadena de DNA, a partir del mRNA. Como se mencionó anteriormente, las cDNA con marcación radiactiva pueden añadirse a secciones de tejidos prueba (hibridación in situ) para descubrir la presencia del mRNA correspondiente en el tejido. Cuando está presente bel RNA, el cDNA marcado se hibridiza con el mRNA, y el complejo se puede descubrir de manera autorradiográfica.
2.10 TéCNICA DE RADIACIÓN
Se han utilizado varias formas de radiación en los estudios embriológicos, principalmente para causar algún daño en partes del embrión. Para realizar ciertos experimentos, se enfocan rayos X en pequeñas regiones del embrión con objeto de obtener un área circunscrita de lesión al tejido, así como para inactivar un grupo de células. En ocasiones se utilizan rayos ultravioleta para el mismo fin, pese a que carezcan del poder de penetración profunda de los rayos X. Los rayos láser han resultado ser una valiosa herramienta para producir lesiones localizadas agudas en el embrión. Es tal su precisión que pueden destruir pequeñas regiones de cromosomas individuales.
2.11 USO DE MARCADORES GENéTICOS
Son útiles en los estudios de desarrollo, generalmente como rastreadores. De particular valor han sido las cepas de ratones que han desarrollado diferencias isoenzimáticas en la forma de ciertas enzimas. La identificación mediante técnicas electroforéticas de isoenzimas específicas ha mostrado ser de utilidad como un método rastreador.
2.12 USO DE INHIBIDORES Y TERATÓGENOS
En el proceso de análisis del desarrollo embrionario se han utilizado muchos tipos de sustancias químicas para inhibir los procesos embrionarios normales. En algunos casos, el mecanismo de activación de un inhibidor químico está bien definido, y una alteración en el desarrollo puede atribuirse a alteraciones específicas en la vía metabólica. Por ejemplo, se sabe que el antibiótico actinomicina D inhibe la síntesis del RNA, de modo que si se administra a aun embrión muy temprano, el desarrollo procederá por lo general durante un lapso breve, pero al poco tiempo se inhibirá notoriamente. Puede inferirse por consiguiente que la etapa en que se inhibió el desarrollo requería la síntesis de moléculas nuevas de RNA.
En la mayor parte de los casos aún se desconoce el mecanismo exacto de la activación perturbadora que ocasiona una sustancia química o una radiación (de rayos X o ultravioleta). Por ello, los efectos de estos agentes sólo pueden interpretarse a un nivel menos específico, en ocasiones implicando el efecto intermediario de un tejido sobre otro en vez de un trastorno en el proceso químico.
Se ha mostrado en años recientes que ciertos medicamentos ocasionan muchos tipos de desarrollo anormal. Se dice que dichos medicamentos tienen un efecto teratógeno y se les conoce comúnmente como teratógenos. A inicios de la década de 1960 se presentó un ejemplo impresionante de la actuación de un teratógeno en el desarrollo humano en Alemania Occidental y varios otros países, donde un gran número de niños nació con un tipo insólito de defecto en las extremidades. En sus manifestaciones graves, faltaban los segmentos proximales de los brazos y las piernas; las manos y pies parecían crecer directamente del cuerpo. Dado que los miembros se asemejaban a las aletas de una foca, ese trastorno se categorizó como focomelia (apéndice de foca). Pronto se descubrió que estas deformaciones eran ocasionadas por un sedante supuestamente llamado talidomida, de uso común entre las embarazadas de estos países. El medicamento se ha retirado del mercado, pero por sus ocasionales efectos trágicos, los procedimientos de aprobación de cualquier medicamento nuevo ahora incluyen rigurosos exámenes para saber si ejercerán daños en los embriones.
Autora:
Lidia Benites Puelles
Universidad Nacional de Trujillo
Facultad de Ciencias Médicas
Escuela de Medicina Humana
Deparatamento de Morfología Humana – Área embriología
Perú
2008
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