Insecticidas biológicos en el control de insectos plaga: agrícolas, forestales, de almacén y urbanas en México (página 2)

Centros Regionales de Reproducción de Organismos Benéficos (CREROB)

Taxonomía de Bacillus thuringiensis (B.th)

Según el manual de Bergey (2001) B.th es una bacteria Gram positiva aerobia estricta, heterotrófica, que forma una espora por célula vegetativa y simultáneamente un cuerpo llamado paraesporal o cristal de proteína, de morfología variada: cubos, rombos, amorfos, como se muestran en la figura 2, también conocida como d-endotoxina que intoxica a los diferentes ordenes de IP, de acuerdo con su estructura molecular (10-12).

III.1 Distribucción de B.th en el ambiente.

Las esporas B.th se recuperan de: suelo agrícola, virgen, de hojas de plantas, de insectos, de granos y de fabricas de alimentos para animales a base de productos vegetales, pueden ser reservorios de las esporas de B.th, su identificación se inicia con la detección del cristal al microscopio de luz, como se muestra en la figura 1, cuando crece en caldo nutritivo, además de su perfil bioquímico y el antígeno flagelar, aspecto clave para la taxonomía de las variedades reconocidas hasta la actualidad, también existe la dependiente del origen genético sus característicos cristales (13-15).

Figura 1. Microfotografía al microscopio de luz 100 X de Bacillus thuringiensis var kurstaki con su cuerpo paraesporal en caldo nutritivo a 40 h de incubación.

.

Figura 2. Microfotografia al microscopio electrónico de cristales de d-endotoxina de Bacillus thuringiensis var kurstakii en caldo nutritivo.

Tipos de toxinas producidas por B.th.

En las diferentes estadios de su ciclo biológico Bth sintetiza 3 tipos de toxinas: en el vegetativo Iy II genera 2: una a-exotoxina o fosfolipasa C y la ÃY-exotoxina, durante III al VI de la esporogénesis produce la d-endotoxina codificada por genes plasmídicos (1,9,11).

La a-exotoxina, ha sido poco investigada perose reporta con actividad toxica contra Galleria mellonella, aunque también lo es para mamíferos. Químicamente la ÃY-exotoxina o thuringiensin, es toxica, porque causa la inhibición de la RNA polimerasa por competición con el ATP, la ÃY-exotoxina se supone, que es una señal molecular en B.th en el control de la transcripción de genes relacionados con la esporulación, es un derivado de nucleótido de adenina unido a glucosa y con un ácido fosfoalárido, tóxico para la mosca domestica, aunque teratogénica para animales de laboratorio (12,14,17).

La d-endotoxina es la más estudiada de las producidas por B.th tiene naturaleza proteica, con un peso molecular de 1.34X105 Daltons, constituida por 18 de los 20 aminoácidos, en su estructura tridimensional tiene un 20% de a-hélice, 35% de lamina ÃY-plegada y el 45% es desconocido (16-18).

IV.1 Mecanismo de acción del cristal de B.th en IP.

Cuando un cristal o protoxina es ingerido se activa en su intestino el pH alcalino entre 7.5 a 8.0 y por las proteasas digestivas específicas, que lo convierten en una toxina activa, con una masa molecular de 68Kda. La proteína tóxica se inserta en la membrana de las células epiteliales del intestino medio del IP y causa un canal iónico con pérdida de ATP, 15 min después el metabolismo celular se detiene e inicia la deshidratación que ocaciona su muerte (19-21).

Medios de cultivo para el crecimiento y producción de B.th.

En la producción del complejo espora/cristal es necesario cultivar B.th en medio de crecimiento a base de subproductos del maíz hidrolizado como el almidón y dextrinas, al igual que jugo de agave y melaza de caña que contiene fructosa, se obtienen excelentes resultados para la esporulación y de calidad tóxica del cristal (6,17,22).

La melaza de caña contiene diferentes azucares de bajo peso molecular, que B.th utiliza como fuente de C de bajo costo, que tienen un efecto positivo sobre la toxicidad de la d-endotoxina, mientras que la harina de pescado (combinación de azucares, proteínas, vitaminas y minerales), como lo es la semilla de algodón, de soya, de garbanzo, de haba, de cacahuate y de lenteja, también es posible con el líquido de remojo de maíz; los residuos de levadura, la sangre de res, de suero de leche, son materiales nutricionales que estimulan la síntesis de la d-endotoxina con alta actividad insecticida (3,6,13). Mientras que se usan factores de crecimiento para mejorar la calidad tóxica del cristal de B.th como: el extracto de levadura: una fuente de vitaminas del complejo B, ya que su carencia retrasa la esporulación y la formación de cristales en consecuencia la toxicidad del complejo espora/cristal se reduce considerablemente (7,14, 20).

Cuadro 3. Sustratos naturales usados como medios de cultivo para la producción de complejo espora/cristal de Bacillus thuringiensis.

Referencias3,7,10.

Condiciones de crecimiento de B. th para la formación del complejo espora/cristal

En la producción del complejo espora-cristal de B.th se emplea una fermentación sumergida o superficial. El medio de cultivo se siembra con un 10% de B.th como inóculo: condiciones de ambos proceso:

temperatura entre 28 y 32 ºC, un pH inicial de 6,8-7,2; es importante el suministro de oxígeno por la elevada demanda de B.th en la fase de crecimiento exponencial, pues su carencia o limitación disminuye el número de células vegetativas, en consecuencia habrá pocas espora y menos d-endotoxina (22,23). Mientras que cuando se eleva el suministro de oxígeno en medios de cultivo ricos para B.th, se genera un exceso de espuma que disminuye las células vegetativas potenciales productoras de cristales tóxicos para IP, por lo que es necesario agregar un antiespumante (8,19).

a) En la fermentación sumergida: el inóculo se usa en un medio de cultivo enriquecido para suplir la demanda nutricional de B.th (5,10,13) como el siguiente (en %):

melaza de remolacha (1); residuos de maíz (0.85); carbonato cálcico (0.1); harina de maiz (1.0); con base a lo anterior la esporulación y cristal de la bacteria, alcanzan un valor aproximado de de 5 x 109 esporas /ml, después de 32 h de incubación.

Otro medio de cultivo para obtener 5 veces más la cantidad de esporas y cristales de B.th (4,17,18,20)contiene lo siguiente (en %):

almidón de maíz (6.8); caseína (1.94); sacarosa (0.64); extracto de levadura (0.6).

b) En la fermentación superficial

Se emplea un medio de cultivo que contiene lo siguiente (en %): dextrosa (1.5); maiz (0.45) fosfato de potasio (0.35); cloruro de calcio (0.01)

VI.1 Recuperación del complejo espora/cristal de B.th.

El resultado de la fermentación o formación de los principios activos tóxicos para a IP, se obtienen por técnicas que aplican: la centrifugación, la filtración, la precipitación o bien una combinación de los anteriores (12,20,23).

VI.2 Bioensayos para medir la calidad tóxica del complejo espora/cristal de B.th.

Se prepara un gradiente de concentración con el complejo espora/cristal, lo que se mezcla con una la dieta artificial para IP con larvas de diferentes estadios o etapas de crecimiento del gusano cogollero (Spodoptera frugiperda L) un problema fitosanitario que reduce considerablemente la producción de maíz, las larvas se depositan en recipientes con la dieta, se incuba durante por lo menos 2 semanas 4, posteriormente se determina la concentración letal media en µg. de proteína/volumen de la dieta artificial, donde sabremos la cantidad de toxico en la espora que sea letal para el insecto (1,3,13,15).

Conclusión

El control de IP agrícolas, forestales, de almacén y urbanas es una opción ecológica para eliminar o reducir el impacto negativo de esta clase de insectos, con la ventaja de que no causa la contaminación ambiental. Sin embargo la aplicación de agentes biológicos, requiere de un conocimiento suficiente de su forma de acción para obtener buenos resultados, en la regulación de poblaciones de insectos que son un problema, para la salud de humanos y plantas, en especial cuando se pretende minimizar el empleo de PQ y mejorar la calidad de vida humana.

Se dedica este trabajo a los promotores del control biológico en el mundo.

Agradecimientos por el apoyo a: Proyecto 2.7 (2009) CIC-UMSNH, y BIONATURA, SA DE CV, MÉXICO.

Literatura citada

1. Aronson, A.I. Beckman, W and Dunn P. 1986 Bacillus thuringiensis and related insect pathogens. Microbial Rev. 50:1-24.

2. Biotecnología de Bioinsecticidas

3. Buchanan, R.E, and Gibson, N.E. 2001. Bergey´s Manual Determinative Systematic Bacteriology, William W, and Walkins W. ed. Baltimore. USA.

4. Burges, H.D., and Hurts, J.A. 1977. Ecology of Bacillus thuringiensis in storage moths. J. Invertebr. Pathol. 30:134-139

5. Baum, J, and Dean, D.H. 1998. Revision of the nomenclatura for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol. Biol. Rev. 62:807-813.

6. Carmona A. 2002. Aislamiento y caracterización parcial de una cepa de Bacillus thuringiensis tóxica al gusano cogollero (Spodoptera frugiperda L). Bioagro 14: 3-10

7. Chiang, A.S., D.F. Yen, and Peng, W.K. 1986. Germination and proliferation of Bacillus thuringiensis, in the gut of rice month larva Corcyca cephalica. J. Investebr. Pathol. 48:96-99.

8. Dulmage, H.T. 1970. Production of d-endotoxin complex by variants of Bacillus thuringiensis in two fermentation media. J. Invertebr. Pathol. 16:385-389.

9. Dulmage, H.T., and Aizawa, K. 1982 Distribution of Bacillus thuringiensis in nature in Microbial and Viral Pesticide. Ed B. Kurstaki M.D. New York. USA pp 209-237

10. Fernández O y L Vega. 2002. Tecnologías de producción de Bacillus thuringiensis, Manejo Integrado de Plagas y Agroecología. 64:110 -115.

11. Gómez S., , Díaz G y Núñez V, M. 2006. Evaluación de la toxicidad de proteínas de Bacillus thuringiensis, Berliner sobre el picudo de algodonero (Anthonomus grandi L) Agronomía Colombiana, 24:296-301.

12. Guerra T, P, et al., 2001. Bioinsecticidas: su empleo, producción y comercialización en México, Ciencia UANL. IV: 143-152.

13. Sánchez-Yáñez J.M. 2005 Producción de bioinsecticida a base de Bacillus thuringiensis: Minirevisión. http:www.monografias.com

14. Johnson, D.E., Oppert, B., and McGaughey, W.H. 1998. Spore coat synergizes Bacillus thuringiensis crystal toxicity for Indianmeal moth. Curr. Microbiol. 36:278-282.

15. Li, J., Carroll, and Ellar, D.J. 1991. Crystal structures of insecticidal endotoxina from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution. Nature. 353:815-821.

16. Núñez-Ramos C. 1980. Patógenos naturales del gusano collero (Spodoptera fugiperda L) en maíz (Zea mays L) en el estado de Nuevo León. Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, N.L, México (Tesis profesional inédita).

17. Rampersad J, et al., 2005. A Bacillus thuringiensis isolation method utilizing a novel strain, low selection and high throughput produced atypical results, BMC Microbiology 5:52.

18. Rincón M C, et al., 2006. Caracterización de cepas nativas de Bacillus thuringiensis con actividad insecticida hacia el gusano cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda L), Folia Entomol. Méx. 45: 157-164.

19. Reardon, R.C. & K, Hassig 1984. Efficacy and field persistence of Bacillus thuringiensis afthe ground application to balsam fire and white spruce in Wisconsin. Can. Etomol. 116:153-158.

20. Schenepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J.D., Lereclus, J., Baum, J., Feitelson, D., Zeigler, R., and Dean, D.H. 1998 Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

21. Sthaly, D.p., D.W. Dingman., L.A. Bulla, Jr., and Aronsosn, A. I. 1978. Possible origin and function of the parasporal crystal in Bacillus thuringiensis Biochem. Biophys. Res. Común. 84:581-588.

22. Valadares, G., Whittome, B., Shore, B., and David, B. 2001. Identification of Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki strain HD-1 like bacteria from environmental and human samples after aerial spraying of Victoria British Columbia, Canada, with foray 48B. Appl. Environ Micribol. 67:1035-1043.

23. Wirth, M.C., Delecluse, A., and Walton, W.E. 2000. Lack of cross-resistence to cry 19A from Bacillus thuringiensis subsp. Jegathesan in culex quinquefasciatus (Diptera:Culicidae) resistant to cry toxins from Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis Appl. Environ. Microbiol. 67:1956-1958.

Autor:

Morales R. V.*

Garay R. B.*

Romero H, A.*

Juan Manuel Sánchez-Yáñez**

*Ingeniería Bioquímica, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, Carpio y Plan de Ayala, México, D.F. **Microbiología Ambiental. Instituto de Investigaciones Químico Biológicas, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Morelia, Mich, México.