Aspectos fundamentales de las fermentaciones en estado sólido (FES)

1. Resumen.

En el presente trabajo se realiza una revisión sobre las características principales de las fermentaciones en estado sólido, los parámetros fundamentales a tener en cuenta sobre el desarrollo exitoso de estos procesos fermentativos como la humedad, la actividad del agua, pH, temperatura, concentración y disponibilidad del sustrato, aireación, tamaño de partícula, inóculo, etc. Se aborda además algunas consideraciones sobre la optimización de los medios de cultivos de los medios de cultivo y las ventajas y desventajas de este proceso en comparación con las fermentaciones sumergidas.

Palabras clave: Fermentaciones sólidas, factores ambientales, cinética, optimización.

Desarrollo

1-. Fermentación en estado sólido (FES).

1.1-. Antecedentes.

Los procesos de FES existen de manera natural desde el comienzo de la vida en el planeta y fueron empleados de forma artesanal en los países del Sudeste Asiático, África y América Central desde hace siglos para la elaboración de alimentos a partir de cereales, yuca, entre otros. El objetivo fundamental con estas fermentaciones ha sido no solo aumentar el contenido proteico de estos alimentos, sino mejorar las posibilidades de conservación, cambiar las características físicas, el color, el olor o el sabor de los mismos. Ejemplos de estos productos lo constituyen el Koji, que se obtiene por el cultivo del hongo Aspergillus oryzae sobre cereales cocidos, el Shoyu, el Miso y el Ontjom (Hesseltine, 1972). La producción del queso Roquefort a partir de leche de oveja, data de alrededor de 1000 años; sin embargo, no es hasta aproximadamente 1930 que se conoce el papel de los hongos en la elaboración de ese alimento, cuando se demostró que todos los hongos desarrollados en este tipo de queso eran del mismo organismo Penicillium roqueforti.

No es hasta finales de la década de los 70 que se promueve con fuerza el estudio científico, con vistas a aprovechar las ventajas económicas de este tipo de fermentación (Doelle y col., 1992).

1.2- Definición.

Hesseltine (1972) empleó el término de fermentación en estado sólido a todas las fermentaciones donde el sustrato no es líquido. Posteriormente, Raimbault (1980) propuso un término más preciso: "Las fermentaciones en las cuales el sustrato no está ni disuelto ni en suspensión en un gran volumen de agua". No obstante, Moo-Young y col. (1983), propusieron un término a todos los procesos que utilizan materiales insolubles en agua para el crecimiento de microorganismos en ausencia de agua libre; autores como Mudgett (1986) y Durand. y col. (1988), han planteado una definición más general: "Es un método de cultivo de microorganismos sobre y/o dentro de partículas sólidas". El líquido ligado a las partículas sólidas debe estar en una cantidad que asegure la actividad del agua adecuada para el crecimiento y el metabolismo de los microorganismos, pero sin exceder el máximo poder de retención de este líquido en la matriz sólida.

La definición más general y reciente fue formulada por Viniegra-González (1997), donde se plantea que "es un proceso microbiológico que ocurre comúnmente en la superficie de materiales sólidos que tienen la propiedad de absorber y contener agua, con o sin nutrientes solubles". Esta definición abarca a procesos donde el soporte sólido es inerte y los sustratos que utiliza el microorganismo pueden ser sustancias solubles en agua, como el proceso de bioconversión de etanol y el crecimiento de Candida utilis sobre amberlita (Christen y col., 1993).

1.3- Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido comparada con el cultivo sumergido en líquido.

Doelle y col. (1992) consideran como ventajas los siguientes aspectos:

Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas que presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios.
La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las contaminaciones, especialmente de bacterias y levaduras.
La concentración natural del sustrato permite utilizar reactores más pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de fermentación. Tienen mayor productividad volumétrica.
La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que permite una alta transferencia de oxígeno al microorganismo.
Pueden emplearse, frecuentemente conidios como inóculo en los procesos de crecimiento de hongos, lo cual disminuye los costos y las manipulaciones en la preparación del inóculo.
Los conidios de los hongos que se producen son mucho más resistentes y tienen mejor adaptabilidad a las condiciones en las que se aplican como agente de biocontrol.
El proceso de recobrado es simplificado. Algunos productos son utilizados integralmente, como alimento animal, productos para el control biológico, etc.
Los procesos se consideran generalmente como tecnologías limpias.

Entre las principales desventajas se encuentran:

Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos de humedad.
La extracción del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo cuando se trabaja a gran escala y no se controla el proceso.
La naturaleza sólida del sustrato trae problemas al medir los parámetros de la fermentación tales como el pH, la temperatura, el contenido de humedad y la concentración de sustrato y productos.
Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión.
Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado están muy poco caracterizados.
El tiempo de fermentación es mayor debido a que generalmente se utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades específicas de crecimiento.

Es bueno recalcar que algunas de estas desventajas son relativas, por ejemplo, el tiempo de fermentación ya que actualmente se están empleando bacterias en los procesos de FES.

Se realizan grandes esfuerzos en la búsqueda de soluciones parciales a las dificultades antes mencionadas, algunos como Gervais y Bazelin (1986) experimentaron con un reactor que permitía la regulación de la humedad relativa del aire y su temperatura en circulación, ya que según Ballio y col. (1964) y Richard-Molard y col. (1985), demostraron que durante el desarrollo del hongo, la variación de la actividad del agua (aH2O) en el medio, puede influir en el crecimiento micelial o en la germinación de las esporas y esto puede ser útil para optimizar la producción de conidios en fermentadores con sustrato sólido, donde la suplementación de oxígeno y la cosecha de conidios, resulta más fácil que en fermentaciones líquidas.

Para el caso específico del control biológico, en la producción de hongos por fermentación sumergida, en determinados casos, se obtienen blastosporas, que si bien son estructuras infectivas, resultan poco resistentes a los cambios de las condiciones climáticas (temperatura, radiación, humedad, etc.), a diferencia de los conidios que se producen en las fermentaciones en fase sólida. Se caracterizan las primeras por presentar cubiertas delgadas y lisas, que influyen negativamente en cuanto a su eficiencia y persistencia después de las aplicaciones dificultando, además, la formación de epizootias.

1.4- Influencia de factores ambientales en la fermentación en estado sólido.

Las condiciones ambientales tales como la humedad, la actividad del agua, el pH, la temperatura, la concentración y disponibilidad del sustrato, la aireación, el tamaño de partículas y la forma de inoculación afectan significativamente tanto el crecimiento como la formación de productos. En el cultivo líquido agitado el control de las condiciones ambientales es relativamente simple, ya que estos sistemas son homogéneos desde el punto de vista de la concentración celular, nutrientes y productos. Sin embargo se presentan serios problemas en los sistemas sólidos con el mezclado, la transferencia de oxígeno, el intercambio de calor y el control de la humedad y el pH, debido, principalmente, a la heterogeneidad y la consistencia del sistema (Doelle y col., 1992).

1.4.1- La Humedad y la actividad del agua (aH2O).

El por ciento de humedad en la fermentación sólida puede variar entre 30 y 80% (Oriol y col., 1988), en dependencia del sólido utilizado, el microorganismo y el objetivo del proceso (formación de producto, crecimiento de la biomasa). Aunque el por ciento de humedad es una de las variables que comúnmente se optimiza en los sistemas de fermentación sólida, (Kim y col., 1985, Rodríguez y col., 1986), hoy se reconoce que no es solo la cantidad de agua presente en el sistema la que ejerce su influencia sobre la eficiencia del proceso, sino el carácter de las interacciones entre el agua y el medio sólido. Por eso no es contradictorio observar que un mismo microorganismo se desarrolle plenamente en dos sustratos diferentes con por cientos de humedad bastante disímiles. La actividad del agua (aH2O) es el parámetro que se ha utilizado para caracterizar cuantitativamente esas interacciones físicas y/o químicas del agua en el sistema.

La actividad del agua se define como la humedad relativa de la atmósfera gaseosa en equilibrio con el sustrato (Oriol E. y col., 1988). La humedad relativa de un sistema gas – vapor de agua se determina por %H. R. = (p H2O / p°H2O) 100, de manera que la actividad del agua es igual a la relación entre la presión parcial del vapor de agua en la solución gaseosa (p H2O ) en el estado de equilibrio con el agua adsorbida en el sólido y la presión de vapor del agua pura (p°H2O ) a esa misma temperatura .

Se demostró que la actividad del agua no sólo ejerce influencia sobre el crecimiento, sino también sobre la formación de productos y, en muchos casos, el valor mínimo requerido de aH2O para la formación del producto difiere del necesario para el crecimiento (Troller, 1980, Gervais y col., 1988).

Gervais y Bazelin (1986) diseñaron un fermentador para controlar el valor de la actividad del agua durante el desarrollo del proceso a través de la humedad relativa del aire que circula por el equipo. No obstante, el tiempo necesario para alcanzar el estado de equilibrio deseado era como mínimo 4 horas, y aunque los autores comparan ese tiempo como pequeño para procesos de fermentación con hongos que duran hasta 60 horas, el sistema de control estaría limitado solo a estas aplicaciones. Por otra parte, los ensayos realizados fueron sin la presencia de microorganismos, lo cual ejerce también influencia en los resultados experimentales.

1.4.2- El pH.

El pH es otra variable que afecta el desarrollo de los procesos de fermentación en estado sólido, al igual que lo hace en los cultivos sumergidos. Sin embargo, en el caso de la fermentación sólida, su control es prácticamente imposible, debido a la ausencia de instrumentos capaces de medir el pH en la capa de líquido que rodea el sólido (Mitchell y col., 2002). Por otra parte, el mezclado de sólidos es un proceso complejo por lo cual se dificulta también el control de esta variable durante el desarrollo de la fermentación.

El pH cambia por diferentes razones; normalmente disminuye por la secreción de ácidos orgánicos como acético y láctico durante el proceso. No obstante, la fuente de nitrógeno utilizada influye mucho en la tendencia que sigue el pH (Domenech, 2000).

Estos conocimientos han sido utilizados por algunos investigadores para formular un medio de cultivo que permita mantener, de manera natural, el pH en un intervalo deseado durante el proceso. Así por ejemplo, Raimbault y Alazard (1980a) propusieron para el crecimiento de Aspergillus niger en harina de yuca una mezcla de sulfato de amonio – urea de 3 a 2 (calculado en base al nitrógeno) y se logró mantener el pH durante el proceso en el intervalo de 5 a 6.2 favorable para el crecimiento del microorganismo.

1.4.3- La temperatura.

El crecimiento y la formación de productos son resultados de complejas reacciones químicas, y al igual que cualquier otra reacción, están afectados por la temperatura, la que ejerce una acción determinante en el conjunto de actividades celulares.

La temperatura es la variable cuyo control, en una fermentación sólida, se considera el más crítico debido a la alta concentración de sustrato por unidad de volumen y a la baja conductividad térmica del sistema heterogéneo sólido – líquido – gas, lo que favorece la acumulación del calor metabólico en el sistema y un aumento de la temperatura del cultivo. En la fermentación de Tempeh, por ejemplo, se midieron gradientes de temperatura de 30C por cm (Bernard y col., 1992).

El aumento de la temperatura favorece tres aspectos negativos:

La actividad microbiana se desacelera o se detiene.
Se deshidrata el medio sólido.
El metabolismo se desvía como un mecanismo de defensa ante el calor o ante la deshidratación (Gutiérrez y col., 1995).

El control de la temperatura se ha tratado a través de métodos convencionales de extracción de calor y de métodos no convencionales. Los métodos convencionales incluyen el intercambio de calor por los mecanismos de conducción y convección forzada. Se demostró que los primeros no son tan efectivos como los segundos (Saucedo – Castañeda y col., 1990). Los métodos de extracción de calor por convección, para ser efectivos, requieren de elevadas tasas de aireación que con frecuencia deshidratan al medio. Los métodos no convencionales se refieren a la utilización del calor latente de vaporización del agua para eliminar el calor metabólico de manera rápida y efectiva (Sargantanis y col., 1993).

Sobre esto se han pronunciado diferentes autores, pues plantean que el control de temperatura es uno de los problemas que se ha detectado desde siempre en las FES y que, a la fecha, no tiene una solución clara. En función de las condiciones de cultivo, se han reportado diversos gradientes de temperatura dentro del lecho de fermentación: 30C cm-1 (Rathbun y Schuler, 1983); 2.50C cm-1 (Raimbault, 1980); 4-50C cm-1 (Saucedo-Catañeda y col., 1990; González-Blanco y col., 1990). Poco se conoce sobre la magnitud del calor metabólico generado en las FES. En la mayoría de los casos se concretan a un valor constante. Rathbun y Schuler (1983) proponen que se producen hasta 15.9 J kg-1 de materia seca, mientras que la velocidad de generación de calor es del orden de 3.3 x 105J h-1 kg-1 de materia seca (Raimbault, 1980). Esto puede provocar un sobrecalentamiento en la masa del cultivo, que influye negativamente sobre la actividad microbiana.

Existe un compromiso entre las soluciones drásticas y efectivas (métodos no convencionales) versus las menos efectivas (métodos convencionales) pero que respeten la integridad del sistema biológico en su conjunto. Resulta también claro que los sistemas de control de las FES deberán tomar en cuenta, simultáneamente, la humedad del medio, la humedad relativa del aire y la temperatura. También el tipo de reactor utilizado (con o sin agitación) juega un papel fundamental en la eficiencia del control de la temperatura.

1.4.4- La concentración y disponibilidad del sustrato.

El medio de cultivo debe tener todos los nutrientes necesarios de forma balanceada para favorecer el crecimiento del microorganismo. Las relaciones entre algunos de sus elementos son de particular importancia, por ejemplo, carbono-nitrógeno y fósforo-oxígeno, esta última de manera relevante en lo referido a la eficiencia de conversión energética y a la respiración (Cannel y Moo Young, 1980).

La formulación tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir, debe establecer las concentraciones a ser utilizada de cada componente. Una primera aproximación con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la composición de la biomasa del microorganismo empleado (Ertola y col., 1994).

Mediante el conocimiento de los coeficientes de rendimiento para la formación de biomasa y producto, y los valores de la energía de mantenimiento será posible establecer también los requerimientos de las fuentes de carbono necesarios para formular un medio (Ertola y col., 1994).

Al igual que en los cultivos sumergidos, la concentración de sustrato ejerce una influencia sobre el desarrollo del microorganismo. Hasta el momento, tal influencia no está caracterizada en términos de limitación o inhibición como en los cultivos sumergidos; pero se piensa que los efectos de limitación sean mayores en las fermentaciones sólidas, debido a la baja velocidad de difusión de los nutrientes en la fase líquida (Moo-Young y col., 1983). Si se ha encontrado que la relación carbono a nitrógeno tiene una gran importancia y su valor óptimo puede variar en el intervalo de 10 a 100 en dependencia del proceso de fermentación.

1.4.5- La aireación.

En la mayoría de los procesos de fermentación en estado sólido participan microorganismos aerobios, y resulta la aireación un factor fundamental para el desarrollo del proceso. La aireación se utiliza para suministrar el oxígeno necesario, para extraer el CO2 formado, así como para extraer el calor metabólico evolucionado, de manera que el flujo óptimo de aire debe tomar en consideración la naturaleza del microorganismo utilizado, los requerimientos de oxígeno para el crecimiento y/o la formación del producto deseado, la velocidad de generación de calor metabólico, la concentración crítica del dióxido de carbono y otros metabolitos volátiles, el espesor de la masa de sólido, entre otros. La aireación en las FES es más fácil que las fermentaciones sumergidas, porque la superficie de contacto es mayor entre el aire y el líquido que está absorbido en las partículas (Viniegra y col., 2003).

1.4.6- El tamaño de partícula.

El tamaño de partícula está muy ligado a la transferencia de masa en el sistema de fermentación en estado sólido, y para considerar este fenómeno se ha propuesto dividir el análisis en la transferencia de masa intrapartícula y la interpartícula (Moo-Young y col., 1983). En el primer caso, influye más el tamaño y la forma del poro de la partícula, así como la porosidad, aunque también influye el tamaño de la partícula (Huerta, S., 1984). En el segundo caso, el espacio interpartícula es lo más importante y es afectado por el tamaño de la partícula, su forma y la humedad (Bernard y col., 1992).

Otro aspecto que influye en la transferencia de masa durante el proceso, es el cambio de estructura de las partículas de sustrato resultado de la acción de los microorganismos (Moo-Young y col., 1983).

1.4.7- El inóculo.

Otro factor que influye en los procesos de FES lo representa el tipo de inóculo y la forma de inoculación. En la literatura se reconoce el uso de dos tipos fundamentales de inóculo en la producción de hongos, tanto a nivel de laboratorio como industrial: micelio o esporas (Domenech, 2000). El uso de micelio está reportado por Moore y Prior (1993) y Jenkins y col. (1998), entre otros. Las principales ventajas del uso de micelio como inóculo son: una mejor competitividad del hongo, una reducción de la posible colonización del sustrato por microorganismos contaminantes y la colonización más rápida debido a que se reducen los tiempos de incubación (la fase de latencia o de adaptación principalmente). Sin embargo, en diferentes trabajos se reporta el uso de suspensiones de esporas (Bosch y col., 1995, Dorta y col., 1996 y Booth y Shanks, 1998), destacándose su principal ventaja en la reducción de los costos en la etapa de propagación del microorganismo.

1.5.- Cinética y actividad metabólica del cultivo batch.

La cinética de un proceso; representa la variación de una o más variables de dicho proceso en el tiempo. En los procesos fermentativos las variables de mayor importancia y que más se han estudiado son: contenido de biomasa en el sistema, la naturaleza del sustrato, la síntesis de uno o varios metabolitos, el consumo de oxígeno y la producción de dióxido de carbono. Dentro de estas variables, la síntesis de biomasa en el proceso y el consumo de sustrato han permitido establecer una serie de criterios y parámetros que caracterizan cualquier proceso fermentativo (Domenech, 2000).

Los estudios cinéticos permiten determinar aspectos tan importantes como:

La velocidad específica de crecimiento (m ).
El rendimiento del proceso.
La productividad del sistema.
El calor generado en el sistema.
La estrategia a seguir en cuanto a la producción de un metabolito específico.

Una de las principales dificultades encontradas en el estudio y desarrollo de los procesos de fermentación en estado sólido viene dada por las características intrínsecas de estos sistemas heterogéneos, la imposibilidad del muestreo durante la fermentación para determinar las concentraciones correspondientes de biomasa, sustrato y productos. Este hecho se refleja de manera particularmente aguda cuando se tiene la necesidad de realizar estudios cinéticos del proceso. No obstante, existen diferentes alternativas que permiten desarrollar estos estudios de manera objetiva y satisfactoria.

La determinación de la biomasa por métodos indirectos se ha empleado por diferentes investigadores. Entre ellos, Sato y col. (1983), Rodríguez y col. (1988), Desgranges y col. (1991) han basado su metodología en el metabolismo respiratorio. El O2 consumido y el CO2 producido son el resultado de los procesos metabólicos a través de los cuales los microorganismos aeróbicos obtienen la energía necesaria para su crecimiento. Por tanto, estas actividades metabólicas están asociadas al crecimiento del microorganismo y pueden usarse para estimar la biomasa sintetizada. Entonces es posible relacionar en términos diferenciales el O2 consumido (dO2/dt) y el CO2 producido (dCO2/dt) tanto al crecimiento celular como al mantenimiento según se expresa en las ecuaciones 4 y 5 (Sato y col.,1983):

(1)

(2)

Estos modelos de correlación son resueltos con el uso de técnicas numéricas para la solución de ecuaciones diferenciales. Con el empleo de computadoras y software adecuados y cromatógrafos o analizadores de gases (CO2 y O2) acoplados a la salida de los gases del fermentador, es posible estimar de forma continua la biomasa sintetizada y, de esta manera, estimar el calor metabólico generado. Esta metodología pudiera aplicarse en el control de parámetros de la fermentación como, por ejemplo, para la temperatura.

1.6-. Consideraciones acerca de optimización de medios de cultivo.

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativa la optimización de los medios de cultivo (Ertola y col., 1994). Entre ellas podemos mencionar las siguientes:

La no existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado.
La existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento.
El uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.
El ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.
El empleo de fuentes nutricionales no convencionales.

Acerca de esto existen en la literatura diferentes ejemplos sobre técnicas que hacen posible la optimización de los medios de cultivo. La mayoría de estas, basan la formulación de los mismos en la composición elemental del microorganismo a estudiar o de otros similares que puedan servir de referencia para realizar un balance de materia apropiado. (Dreyer y col., 2000).

La optimización de los medios de cultivo con fines industriales, en la mayoría de los casos ha sido efectuada mediante procedimientos empíricos de ensayo y error, no solo en la formulación del medio de cultivo, sino también en las condiciones de operación. De cualquier manera es probable que el medio de cultivo original pueda ser optimizado, modificando el porcentaje de los componentes del mismo y las materias primas utilizadas, siendo factible en muchos casos optimizar un medio de tal manera que no sea solamente más productivo, sino de menor o igual costo que el original, para lo cual se requiere del uso de varios métodos de optimización (Dreyer y col., 2000).

Un aspecto relevante en la optimización de un medio de cultivo de interés industrial no es sólo el logro de una formulación racional del mismo, sino también la posible inclusión de materias primas de bajo costo que hagan rentable el proceso. Ello ha llevado a la búsqueda de subproductos de bajo valor comercial que puedan sustituir componentes costosos y que puedan ser utilizados como fuentes de carbono o nitrógeno (Dreyer y col., 2000).

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Ing. Hector Correa Rivero MSc.

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) Autopista Nacional y Carretera de Tapaste Apartado 10. San José de las Lajas La Habana. Cuba

Categoría: Ingeniería