Selección de microorganismos capaces de biodegradar fracciones pesadas del petróleo

2. Resumen
4. Materiales y métodos
5. Resultados y discusión
6. Conclusiones
7. Bibliografía

RESUMEN

En la industria del petróleo, la presencia de compuestos pesados constituye un problema tanto para la extracción, como para la transportación y refinación, siendo mayores los daños al medio ambiente, lo que implica disminución del beneficio económico reportado por los petróleos con estas características. En este caso se encuentran la mayoría de los petróleos cubanos.

Es por ello que el presente trabajo tiene como objetivo fundamental la selección, aislamiento e identificación de microorganismos con capacidades para biodegradar fracciones pesadas del petróleo (resinas y asfaltenos), como una alternativa para la solución de los problemas generados por estos compuestos en la industria petrolera cubana.

La selección se realizó a partir de dos fuentes: muestras de suelos contaminados tomadas en diferentes sitios del país y cepas conservadas con capacidades biodegradadoras ya conocidas. Las muestras se cultivaron en un medio salino con un petróleo crudo pesado como única fuente de carbono durante 14 días.

Al concluir se extrajo la fase orgánica de cada cultivo y se determinó su composición en fracciones del petróleo (hidrocarburos saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos) mediante cromatografía de elusión, calculando la tasa de biodegradación de cada fracción para seleccionar aquellos microorganismos que fueron capaces de oxidar las fracciones pesadas en más de un 20% sin afectar los hidrocarburos saturados y aromáticos. Las cepas seleccionadas fueron identificadas hasta especie según el Manual Bergeys, 1994.

Como resultado del estudio se seleccionaron dos cepas bacterianas capaces de biodegradar resinas y asfaltenos: Pseudomonas aeruginosa 8g-2 y Bacillus circulans 271/1.

INTRODUCCION

Existe un gran número de microorganismos heterotróficos capaces de utilizar los hidrocarburos del petróleo como fuente de carbono y energía para su crecimiento, produciendo dióxido de carbono, agua, biomasa y otros productos parcialmente oxidados menos tóxicos. (Davis, 1967).

Estos microorganismos presentan una especificidad biodegradadora hacia los diferentes componentes del petróleo. Los hidrocarburos saturados son los más propensos a la oxidación y le siguen los hidrocarburos aromáticos. (Whyte, Bourbonniére y Greer, 1997). Las resinas y asfaltenos se consideran como compuestos resistentes a la biodegradación. Esto se debe a que su estructura es muy compleja y deben intervenir diferentes tipos de enzimas que sean capaces de oxidar tanto alcanos lineales como cíclicos, hidrocarburos aromáticos, poliaromáticos y heteropoliaromáticos. (Pineda y Mesta, 2001)

En la industria del petróleo, la presencia de compuestos pesados constituye un problema tanto para la extracción, como para la transportación y refinación, siendo mayores los daños al medio ambiente, lo que implica disminución del beneficio económico reportado por los petróleos con estas características. (Pineda y Mesta, 2001). En este caso se encuentran la mayoría de los petróleos cubanos.

Es por ello que el presente trabajo tiene como objetivo fundamental la selección, aislamiento e identificación de microorganismos con capacidades para biodegradar fracciones pesadas del petróleo (resinas y asfaltenos) como una alternativa para la solución de los problemas generados por estos compuestos en la industria petrolera cubana.

MATERIALES Y METODOS

1. En todos los ensayos se utilizaron reactivos puros para análisis así como, medios de cultivos para microbiología producidos por la empresa BIOCEN. Para los ensayos de biodegradación se utilizó un crudo de petróleo extrapesado y altamente sulfuroso, con las siguientes características físico-químicas: densidad 0,9937 g/cm3, gravedad API 10,9o, viscosidad cinemática a 40oC 3566 mS/cm, azufre total 5.72 %, Asfaltenos en C7 completo 19.98 %.

2. Reactivos, materias primas y medios de cultivos

   Los muestreos de suelos contaminados con hidrocarburos se realizaron según la norma ISO 10381-6:1993, en diferentes sitios del país donde existían derrames antiguos, mayormente asfaltenizados.

3. Muestreo

   Para la selección de microorganismos a partir de muestras de suelo, se pesaron 10 g de muestra y se añadieron en 100 mL de solución salina fisiológica con unas gotas de Tween 80, agitando en zaranda durante 1 hora a 30 oC y 150 rmin-1. Se tomó 1,0 mL del sobrenadante y se inoculó en 30 mL de caldo nutriente, incubando en zaranda durante 24 horas a 30 oC y 150 rmin-1.

   Se probaron, además, tres cepas de la especie Pseudomonas aeruginosa: 6g-21, 3g-2 y 8g-2 pertenecientes al cepario del Centro de Investigaciones del Petróleo, las cuales fueron previamente adaptadas al consumo de asfaltenos como única fuente de carbono y energía durante un año (Mesa y col., 2003), así como las cepas aisladas de las muestras de suelo que dieron mejores resultados en el experimento anterior. Las cepas se sembraron en tubos de agar nutriente y se incubaron durante 24 horas a 30oC.

   Al concluir la incubación, se arrastró la biomasa obtenida sobre la estría y se suspendió en 30 mL de caldo nutriente, incubando en zaranda durante 24 horas a 30 oC y 150 rmin-1.

4. Preparación de inóculos microbianos

   Los cultivos obtenidos en el punto 3, fueron inoculados en erlenmeyers estríados de 500 mL que contenían 270 mL de medio salino de Solana (sulfato de sodio 2,0 g, fosfato dipotásico 0,5 g, cloruro de amonio 1,0 g, nitrato de potasio 2,0 g, sulfato de hierro (II) 0,01 g) y 1% de petróleo crudo (Solana, 1985). Los cultivos se incubaron en zaranda durante 14 días a 30 oC y 150 rmin-1.

5. Ensayo de biodegradación

   En el caso de las muestras de suelo, al finalizar la incubación, se tomó 1,0 mL de cada cultivo y se realizó el aislamiento de las bacterias aeróbicas presentes según lo indicado en la norma ISO 6222: 1988.

6. Aislamiento de microorganismos

   A todos los cultivos obtenidos del ensayo de biodegradación, se les realizó una extracción de la fase orgánica presente utilizando n-hexano como solvente y posterior evaporación, determinándose el contenido de hidrocarburos saturados y aromáticos por cromatografía de elusión según la norma ASTM D2549/2000 modificada así como el contenido de asfaltenos con n-pentano según la norma ASTM D 2007/2000.

7. Análisis químico

   De acuerdo a las concentraciones de cada uno de los componentes del petróleo (hidrocarburos saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos) determinados para cada muestra, se calculó la tasa de biodegradación de cada fracción según la siguiente expresión:

   Cb – Cm

   TB = ___________ * 100

   Cb

   Donde:

   TB: tasa de biodegradación de cada fracción expresada en %

   Cb: Concentración del blanco (%)

   Cm: Concentración de la muestra (%)

8. Determinación de la tasa de biodegradación
9. Selección de microorganismos

Se realizó teniendo en cuenta los siguientes parámetros:

1. Se prefirieron las muestras que crecieron en 24 horas o menos

2. Tiempo de crecimiento de cada cepa.

   Se prefirieron los microorganismos que produjeron concentraciones de 108 células/mL o superiores

3. Concentración celular obtenida (producción de biomasa)
4. Capacidad de biodegradación de fracciones pesadas del petróleo (resinas y asfaltenos).

En este caso se seleccionaron los microorganismos que fueron capaces de biodegradar las resinas y los asfaltenos por encima del 20%. Estas tasas de biodegradación se fijaron empíricamente, de acuerdo a los resultados obtenidos, ya que en la literatura consultada no se encontraron reportes sobre la oxidación microbiana de este tipo de estructuras.

d) Tasa de biodegradación de los hidrocarburos saturados y aromáticos menor del 10%. Se consideró este valor como no significativo ya que se reporta la transformación mayoritaria de estos compuestos en tiempos menores de 14 días. (Kanaly y Harayama, 2000; Pineda y Mesta, 2001)

1. Identificación de microorganismos

La identificación de las bacterias aeróbicas aisladas de las muestras de suelos se realizó según el Manual Bergeys, 1994

RESULTADOS Y DISCUSION

Selección de microorganismos a partir de muestras de suelos e identificación de la cepa seleccionada

En la tabla 1 se observan los resultados correspondientes al estudio de las muestras de suelos contaminados con hidrocarburos.

Tabla 1. Estudio de biodegradación de muestras de suelos

Como puede apreciarse, la mayoría de las muestras estudiadas no fueron capaces de biodegradar asfaltenos y resinas en mas de un 20%, por lo que fueron eliminadas del estudio Este resultado es lógico si tenemos en cuenta la complejidad de estas estructuras y su resistencia a la biodegradación. (Pineda y Mesta, 2001). Solamente las muestras 269, 270 y 271 cumplieron con este requisito, entre ellas, la 270, degradó la fracción de hidrocarburos saturados en más de un 10%, por lo que también fue eliminada.

Las muestras de mejores resultados fueron 269 y 271, de acuerdo a todos los parámetros evaluados, ya que son las de crecimiento más rápido (24 horas), mayor concentración celular (108-1010 células/mL) y capacidad para biodegradar asfaltenos mayor del 20%, sin afectaciones para los fracciones de hidrocarburos saturados y aromáticos.

Ambas muestras presentaron un comportamiento similar ya que degradan asfaltenos pero no resinas. Por tanto, entre las dos se decidió escoger la muestra 271, compuesta por una sola cepa (271/1), la cual exhibió mayor producción de biomasa (1010 células/mL), teniendo en cuenta que este constituye un parámetro muy importante si se quiere desarrollar el proceso biodegradativo a mayor escala.

Después de realizar las pruebas de identificación, la cepa seleccionada fue identificada como perteneciente a la especie Bacillus circulans, la cual es típica de la microflora del suelo (Manual Bergeys, 1994). Al género Bacillus pertenecen un gran número de microorganismos degradadores de petróleo (Davis, 1967) y esta especie en específico ha sido reportada anteriormente en suelo costero impactado con hidrocarburos de la Bahía de La Habana, lugar cercano al sitio de muestreo.

En dicho trabajo, se comprobó que los microorganismos pertenecientes a esta especie fueron capaces de crecer en petróleo crudo, queroseno y naftaleno (Ríos, 2001), lo que nos da una medida de su versatilidad nutricional con respecto a los compuestos hidrocarbonados. Esta cepa, además, es capaz de formar esporas, lo que la hace más resistente a ambientes agresivos.

2. Estudio de biodegradación de cepas pertenecientes al cepario CEINPET

En la tabla 2 se observan los resultados del estudio de biodegradación realizado a las cepas escogidas del cepario CEINPET.

Tabla 2. Estudio de biodegradación de las cepas pertenecientes al cepario CEINPET

Según nos muestra la tabla, entre las cepas pertenecientes al cepario CEINPET, la 8g-2 es la de mejores resultados, ya que es capaz de biodegradar tanto resinas como asfaltenos a una concentración superior al 20 %, sin afectar los hidrocarburos saturados y aromáticos.

Al igual que el resto de las cepas estudiadas, presenta un crecimiento rápido (24 horas) y buena producción de biomasa (1010 células/mL). Los otros dos microorganismos provenientes del cepario solo degradan resinas y en una proporción mucho menor. Por tanto, entre las tres, se seleccionó la 8g-2 como mejor biodegradadora de fracciones pesadas del petróleo.

La especie Pseudomonas aeruginosa, a la que pertenece esta cepa, también se encuentra entre las de mayor resistencia a ambientes agresivos y capacidad nutricional para mineralizar gran variedad de hidrocarburos del petróleo. Se reporta con capacidades para degradar tanto compuestos alifáticos como aromáticos y poliaromáticos en condiciones aeróbicas, microaerófilas y desnitrificantes. (Whyte, Bourbouniere y Greer, 1997; Chayabatra y Ju, 2000).

CONCLUSIONES

De los estudios realizados se seleccionaron las cepas Pseudomonas Aeruginosa 8g-2 perteneciente al cepario del CEINPET y Bacillus circulans 271/1 aislada de suelo contaminado con hidrocarburos de la Refinería Ñico López, las cuales fueron capaces de biodegradar más del 20% de las fracciones de resinas y asfaltenos en 14 días de cultivo, sin afectar los hidrocarburos saturados y aromáticos.

Estas cepas presentaron, además, las mayores velocidades de crecimiento y producción de biomasa.

BIBLIOGRAFIA

• "Bergeys Manual of Determinative Bacteriology", 9th. Ed., Williams and Wilkins, USA, 1994
• Chayabatra, Ch. and Ju L. K. " Degradation of n- hexadecane and its metabolites by Pseudomonas aeruginosa under microaerobic and anaerobic denitrifying conditions" Appl. Env. Microb. Vol. 66, No.2, p. 493- 498, (2000)
• Davis, J.B. "Petroleum microbiology". Ed. Elsevier. Inglaterra., 1967.
• Kanaly, R. A and Harayama Sh. "Biodegradation of High-Molecular-Weight Polyciclic Aromatic Hydrocarbons by bacteria". Journal of Bacteriology, Vol. 182, No. 8, p. 2059-2067, April 2000
• Mesa, D, Musacchio A., Martínez A. L., Ibarra E. "Desarrollo de un proceso biológico para degradación de hidrocarburos en aguas residuales del proceso de extracción de petróleo" II Jornada Científica y de Calidad. CEINPET, Cuba, 2003
• Norma ASTM D 2007/2000. "Standard test method for determination of asphaltenes by elution cromatography"
• Norma ASTM D 2549/2000. "Standard test method for separation of representative aromatics and nonaromatics fractions of high-boiling oils by elution cromatography"
• Norma ISO 10381-6: 1993 (E). " Guía para la colección, manejo y conservación del suelo para procesos microbianos aeróbicos en el laboratorio"
• Norma ISO 6222: 1988 (E) " Calidad del agua – Enumeración de microorganismos viables– Conteo de colonias mediante inoculación en agar nutriente"
• Pineda-Flores, G.; Mesta-Howard, A.M. "Petroleum asphaltenes: generated problematic and posible biodegradation mechanisms" Rev. Latinoamericana de Microbiología. Vol. 43. No. 3, p. 143-150, 2001
• Ríos, Y. "Identificación y caracterización de bacterias pertenecientes a la microbiota de un suelo impactado de la Bahía de la Habana" Tesis de Diploma. Facultad Biología. Universidad de La Habana. Cuba, 2001
• Solana, A.M. "Biodegradación marina en la contaminación por hidrocarburos". Mundo Científico. 1(8): 913-920, 1985.
• Whyte, L.G., Bourbonniére, L y Greer, C.W. "Biodegradation of petroleum hydrocarbons by psychrotropic Pseudomonas strain possessing both alkane (alk) and naphtalene (nah) caabolic pathways". App. Env. Microbiol. 63(9): 3719-3723, 1997.

Autor:

Diana Mesa Penín

Regla M. García Laurreiro

Xiomara Grillo Barreira

Ricardo Campos Rodríguez

Dolores Ruiz Martínez

Danae Dorta López

Yaíma Barrios San Martín

Centro de Investigaciones del Petróleo. Washington # 169 esq. Churruca.

Cerro. C. Habana. Cuba 12 000