El teocintle (Zea mays mexicana L) es una gramínea silvestre a partir del cual por domesticación se obtuvo el maíz actual, y aunque ello está bien documentado, no así el tipo de microorganismos fijadores de N2 asociados a su raíces.
Los objetivos de esta investigación fueron analizar y comparar las bacterias fijadoras de nitrógeno (BFN) asociadas a las raíces de teocintle y maíz, en el municipio de Morelia, estado de Michoacán en el suroeste de México. Para lo cual se colectaron: raíces, suelo de rizósfera y suelo sin raíces de plantas crecidas en invernadero y en el campo.
En base al análisis de la densidad total de las poblaciones cultivables: a) heterotrófica aerobia, b) fijadora de nitrógeno y c) Burkholderia spp.
A cada aislado se le midió su actividad de reducción de acetileno (fijación biológica del N2). Las características bioquímicas usadas para su identificación fueron: morfología macro y microscópica, así como su capacidad de oxidación/fermentación de carbohidratos.
Los resultados indican una ligera diferencia en la densidad, de la población aerobia heterotrófica cultivable de BFN, mayor en el maíz que en el teocintle aunque en general ambas plantas comparten aparentemente el mismo tipo de poblaciones bacterianas en los tres niveles analizados, excepto en las raíces de las plantas crecidas en invernadero, en donde las poblaciones bacterianas totales fueron inferiores.
La actividad de reducción de acetileno en las bacterias aisladas de teocintle y maíz fue variable dependiente de su origen. Mientras que el comportamiento bioquímico de los aislados de ambas plantas, fue similar. En donde el grupo bacteriano predominante fue un bacilo Gram Negativo (-): Azotobacter spp, además de otros bacilos Gram(-) no identificados.
Los géneros en menor proporción Burkholderia spp y Klebsiella spp, ambos con capacidad de fijar N2. Estos resultados apoyan la teoría de que el teocintle tiene una estrecha relación con el maíz, investigación en progreso intenta fortalecerla.
Palabras clave: Teocintle, domesticación, maíz, raíces, bacterias libres fijadoras de N2.
El teocintle (Zea mays mexicana L) es considerado como el ancestro del maíz actual (9,30) en general los argumentos que se han postulado para ello son genéticos (8), botánicos (10) y evolutivos (29). Con escasa información en relación a su interacción a nivel radical con bacterias fijadoras de N2 (SFN), y al parentesco de esta población con la conocida en el maíz moderno (11, 23).
En general las BFN, comúnmente en las raíces del maíz son: Azotobacter chroccocum, Clostridium spp, Azospirillum spp, A. brasilense, y A. lipoferum, aunque también se han reportado, miembros de la familia Enterobacteriaceae (15,16) como los dominantes en esa zona de la planta, así se ha demostrado que: Enterobacter spp, Klebsiella spp, Pantoea spp y principalmente Rahnella aquatilis, colonizan las raíces de maíz (4,18).
Con la aplicación de la técnica del modelo espermósfera (33), se ha detectado una mayor variedad de BFN en las raíces de maíz (18), en función de la variedad, de planta, clase de suelo y región geográfica donde se cultiva; de los géneros más reportados, se señalan: Azospirillum sp, (32) Herbaspirillum, (2) Azotobacter chroococcum, (23) Klebsiella terrigena, (4) Rhanella aquatilis, (4) Bacillus circulans, (4,31) Paenibacillus polymyxa, (37) y Burkholderia sp, (14). En México, se han aislado géneros similares como: Azospirillum spp, (25) mientras que en el Noreste de México se reportó como microflora dominante a Azotobacter beijerinckii, asociada a las raíces de la variedad del maíz híbrido H-417 (27).
En la actualidad, atención especial ha recibido el género Burkholderia spp (antes Pseudomonas), por fijar N2, su actividad promotora del crecimiento vegetal, su capacidad antagonista a fitopatógenos de rizósfera (13,36), así como por metabolizar pesticidas, compuestos recalcitrantes y por su multirresistencia a antibióticos. (17,35). En contraste con la mínima investigación, referente a Burkholderia fijador N2, en raíces del teocintle. Aunque investigaciones exploratorias señalan que existen grupos bacterianos similares a los reportados en el maíz (28).
Los objetivos de esta investigación fueron analizar y comparar la microflora fijadora de nitrógeno asociada a las raíces de teocintle y maíz, en el municipio de Morelia, Mich. México.
Materiales y métodos.
1. Origen de las gramíneas.
Las poblaciones bacterianas se aislaron de raíces de teocintle y maíz cultivados en macetas en invernadero, y en suelos agrícolas del municipio de Morelia, estado de Michoacán, México.
Los medios de cultivo usados fueron agar nutritivo (AN) para cuantificar la población heterotrófica cultivable (22), medio mineral sin nitrógeno (Watanabe) para el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno (9) con la siguiente composición: Solución A: (g/L): ZnSO4.7H2O, 0.43; MnSO4.H2O, 1.30; NaMnO4.2H2O, 0.75; H3BO3, 2.8; CuSO4.5H2O, 0.026; CoSO4.7H2O, 0.07. Solución B: (g/L): MgCO4.7H2O, 2.0; CaCl2.2H20, 2.0; FeSO4.7H2O, 0.44; EDTA, 0.40. Solución C: (g/L): K2HPO4, 60; KHPO4, 40. Mezclar: solución B, 50 mL; solución C, 15 mL; solución A, 20 mL/L.
Se adicionan (g/L): glucosa, 5; manitol, 5; almidón, 4.5; ácido málico, 3.5; agar bacteriológico 18.0 Agar. Pseudomonas cepacia ácido azalaíco. tryptamine (PCAT) semiselectivo para el género Burkholderia. (g/L). MgSO4 0.1; Ácido azalaíco 2.0; Tryptamine 0.4; K2HPO4, 4.0; KH2PO4, 4.0; extracto de levadura, 0.02. el pH se ajustó a 5.7 (11).
2. Aislamiento de las poblaciones bacterianas seleccionadas.
El análisis microbiológico de las plantas se realizó a los 60 días después de la siembra en invernadero y en el campo, con el cuidado necesario para evitar dañarla, según el método de Tjepkema y Van Serkum (34).
La raíz se sacudió suavemente, para desprender el suelo adherido, se cortó la raíz desde el cuello de la planta, se pesaron 5 g de suelo sin raíces, por separado 5 g suelo adherido a la raíz y además la misma cantidad de raíces, en todos los casos se suspendieron en 45 mL de solución salina estéril, cada muestra se agitó á 200 rpm durante 30 minutos y se diluyó (10-2 a 10-6).
De cada nivel de la planta se sembraron 0.2 mL en agar Watanabe, en agar PCAT y en AN. El período de incubación fue de 24 h para las muestras en AN y de 72 h para Watanabe y PCAT. Por resiembra en Watanabe se aislaron y seleccionaron las BFN sospechosas, en base a: su forma, tamaño, color, elevación y borde. Procedimiento similar se empleó para el aislamiento y selección Burkholderia spp en PCAT.
3. Actividad reductora de acetileno (fijación biológica de N2) o ARA.
Para demostrar en forma indirecta la fijación biológica de nitrógeno se realizó la prueba de ARA (20,21). Las bacterias, fueron suspendidas en tubos de 18 x 150 mm, con 3.0 mL de medio sólido sin N Watanabe, la población se ajustado a 1×103 bacterias/mL con el tubo No.1 de Mac Farland.
Los tubos se sellaron con tapones de hule. Se incubaron á 35°C por 48 h, y con una jeringa Hamilton de 5.0 mL, a cada tubo se le extrajo e1 10% de la fase gaseosa y se le inyectó el mismo volumen de acetileno.
El etileno producido en cada tubo, se determinó después de 1 á 4 días de incubación a temperatura ambiente, por cromatografía de gases (Beckman modelo GC- 72-5) empacado con una columna Porapack Q.
4. Identificación presuntiva de las BFN.
Se realizó la identificación bioquímica parcial, por esquema de pruebas para medir su actividad oxidativa/fermentativa sobre carbohidratos: glucosa, sacarosa, lactosa, almidón. Su actividad proteolítica en: gelatina, en triptofano (indol) y la producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados, así como la utilización de citratos como única fuente de carbono, y el tipo de respiración: catalasa y oxidasa (20,21).
La figura 1 muestra la población heterotrófica viable (PHC), de los suelos donde se cultivó teocintle y maíz sin diferencia numérica debido al tipo de técnica de cuenta viable empleada, la que no proporcionó información de la condición de la población en su hábitat natural en términos de latencia y/o actividad.
A la PHC se le consideró como el 100% y se usó de referencia para la población de BFN, en este caso el porcentaje de la densidad se atribuyó al pobre contenido de N en los suelos (29) en los cuales ambas se cultivaron, los valores porcentuales de 19.3 y 16.3 se encuentran en el intervalo reportado, para otras gramíneas bajo condiciones semejantes (6,25), en tanto que el porcentaje de Burkholderia spp, sugiere que este género no está adaptado a la pobreza nutricional del suelo, pues en general las investigaciones realizadas la ubican como una bacteria de la rizósfera, básicamente por su exigencia nutricional. (7).
BFN: Bacterias Fijadoras de Nitrógeno
La figura 2 muestra el efecto de la rizósfera del teocintle y maíz sobre las poblaciones de BFN, y Burkholderia spp, en donde, fue evidente que la condición nutricional más conveniente para el maíz, favoreció una mayor estimulación de estas poblaciones, que para las asociadas a las raíces de teocintle, sujeto al stress nutricional del suelo, pobre en materia orgánica, nitrógeno y otros minerales necesarios para desarrollo normal.
Efecto rizósfera positivo semejante se observó en el por ciento de Burkholderia spp (5) su densidad, así como el de otros grupos de rizósfera similares, es dependiente del estado de salud de la planta hospedera, lo que significa que bajo stress nutricional, las poblaciones microbianas asociadas a las raíces, disminuyen su número, en comparación con la densidad de los microorganismos de las raíz, reportadas en plantas cultivadas en suelos fértiles (36) de referencia de Burkholderia vietnamiensis TVV-75, aislada de la rizósfera de arroz y la detectada en el aislado SM-3c3 recuperado de un maíz híbrido, y en el aislado ST -5c obtenido de las raíces de teocintle.
La segunda tendencia con valores elevados, representada por los aislados ST -5c5 y ST-5b10 recuperados del suelo adherido a raíces y rizósfera de teocintle y por el aislado SM-
3C4 proveniente de raíces de maíz. Estos valores son relativos, ya que las diferencias entre grupos bacterianos, e incluso entre especies son el resultado de sus necesidades nutricionales específicas, (3, 18,19) en las que la ARA se realizó.
En general, para esta prueba se emplean, como referencia las condiciones óptimas de géneros conocidos como: Azotobacter sp, Clostridium sp o Azospirillum sp, las que no necesariamente son las adecuadas para BFN aisladas de plantas silvestres, como el teocintle (23,24), lo anterior sugiere que aún aquellas que mostraron menos ARA, no deben considerarse menos capaces para esta actividad, pues no se sabe con precisión, cuales son las condiciones óptimas para inducir una mayor ARA.
No obstante los valores cualitativos mostrados en esta tabla, confirman que en las raíces de teocintle, como en las de maíz híbrido, existe una población de Burkholderia sp capaz de fijar N2 (29), lo anterior se apoya en la detección de los genes Nif en este grupo.
Este es uno de los primeros reportes que señala a Burkholderia (con genes Nif), de un origen diferente al arroz, como fijador de N2, pues Burkholderia vietnamiensis es hasta la actualidad, el único miembro del grupo reconocido con esta propiedad (35), diferente a las cepas de Burkholderia spp recuperadas de las raíces de maíces cultivados en suelos franceses y australianos, en donde aunque el grupo fue dominante, no mostraron la capacidad de fijar N2 (37).
Tabla 1. Actividad reductora de acetileno por Burkholderia spp aisladas de suelo adherido a rizósfera y de raíces de teocintle y maíz, en el Municipio de Morelia, Mich.
Cepa / aislado | Repeticióna | AMEb |
TVV75* | 6 | 94 |
SM-3C3 | 6 | 190 |
ST-5C2 | 6 | 3800 |
ST-5C5 | 6 | 1500 |
SM-3C4 | 6 | 6300 |
ST-5b10 | 6 | 2600 |
a Número de repeticiones.
b Promedio de la actividad máxima de producción de C2H4/día/tubo
* Burkholderia ST Burkholderia sp aislada de teocintle. SM Burkholderia sp aislada de maíz.
Estos resultados sugieren que cuando el maíz fue exportado de América al mundo, hubo cambios en la interacción planta/bacteria que causaron la segregación y/o selección de las bacterias con capacidad de fijar N2. Sin embargo, es necesaria investigación más fina para dar solidez a este argumento.
En la tabla 2 se muestra el comportamiento bioquímico de las BFN identificadas parcialmente como Burkholderia sp, independiente de su origen de aislamiento (teocintle o maíz), o de la parte de la planta de donde se recuperó (suelo adherido y/o raíces), lo que muestra homogeneidad en los exudados radicales de ambas gramíneas, al menos para la selección de las BFN y apoya el argumento de la cercana relación entre teocintle y maíz. (12,36).
El comportamiento bioquímico de las otras BFN diferentes a Burkholderia, presenta un patrón semejante al de las enterobacterias, del género Klebsiella spp, de amplia distribución en raíces de diversas plantas (6,20,21).
La tabla 3 presenta el patrón bioquímico de las BFN de teocintle y de maíz que no tuvieron relación con Burkholderia sp y/o el grupo entérico. Según el método de aislamiento utilizado fue en realidad, la población dominante y por tanto, representativa en ambas plantas: Este grupo mostró una actividad sacarolítica (oxidación/fermentación: glucosa, manitol, sacarosa), como se reporta para cierta clase de BFN, sin embargo por su pobre actividad proteolítica, su morfología microscópica y colonial se concluye parcialmente que se trata de un miembro del género Azotobacter, común en las raíces de gramíneas (1,14, 25).
En este análisis exploratorio de las BFN asociadas al teocintle y maíz no se logró detectar diferencia en términos numéricos y de la diversidad de FBN, aunque no se usaron herramientas de biología molecular. Sin embargo, será necesario para confirmar estos resultados, el empleo de huellas genéticas que permitan con exactitud definir el posible efecto de la domesticación del teocintle sobre la diversidad de las BFN heterotróficas que habitan el sistema radical del maíz.
Tabla 2. Comportamiento bioquímico de Burkholderia spp recuperadas de raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L) y maíz (Zea mays L), del Municipio de Morelia, Mich.
Pseudomonas* | ST-5C5 | ST-5b10 | ST-5C13 | ST-5a7 | SM-3b14 | SM-3c7 | |
CATALASA | + | + | + | + | + | + | + |
OXIDASA+ | + | + | + | + | + | + | |
TSI | + | + | + | + | + | + | + |
LIA | + | + | + | + | + | + | + |
CITRATO | + | + | + | + | + | + | + |
SIM | + | + | + | + | + | + | + |
UREA | – | – | – | – | – | – | – |
ESPORULACIÓN | – | – | – | – | – | – | – |
MANITOL | + | + | + | + | + | + | + |
MALTOSA | – | – | – | – | – | – | – |
MALATO | + | + | + | + | + | + | + |
*Cepa de referencia. Reacción (+) positiva, (-) negativa. TSI=Agar Triple Azúcar. LIA= Agar Hierro Lisina. SIM=H25, Indol Movilidad. ST= aislado de Teocintle. SM= aislado de maíz. a= Suelo alejado de raíz. b= Suelo Adherido a raíz. c=Raíz.
Tabla 3. Comportamiento bioquímico de bacterias fijadoras de nitrógeno dominantes, aisladas de suelo con raíces suelo adherido a raíz y raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L) y maíz (Zea mays L) en el Municipio de Morelia, Mich.
Prueba /aislado | Pseudomonas* | T5b1** | T5a3** | T5b2** | T5b11** | T5C14** | M3C9** | M3b10** |
TINCION DE GRAM | – | – | – | – | – | – | – | – |
ESPORULACIÓN | – | – | – | – | – | – | – | – |
OXIDASA | + | – | – | – | – | – | – | – |
CATALASA | + | – | + | – | – | – | – | – |
TSI | + | + | – | + | + | + | + | + |
LIA | + | + | – | + | + | + | + | + |
CITRATO | + | – | – | – | – | – | – | – |
SIM | + | + | – | + | + | + | + | – |
UREA | – | – | – | – | – | – | – | – |
ACETOÍNA | – | – | + | – | – | – | – | + |
MANITOL | + | + | + | + | + | + | + | + |
MALTOSA | – | – | – | – | – | – | – | – |
ALMIDÓN | + | + | + | + | + | + | + | + |
QUISTES | – | – | + | – | – | – | – | + |
PIGMENTO | + | – | – | – | – | – | – | – |
FLUORESCENTE |
*Cepa de referencia. Reacción (+) positiva, (-) negativa TSI=Agar Triple Azúcar LIA=Agar Hierro Lisina SIM=H2S, Indol Movilidad T=aislado de Teocintle. M=aislado de maíz, a= suelo alejado de raíz, b= Suelo adherido a raíz c=Raíces. **Aislados de comportamiento similar de diferente parte de la planta.
Dedicatoria: a Rosario y Esthela Sánchez Yánez, un ejemplo de responsabilidad y superación personal.
Agradecimientos.
Al apoyo económico de la CIC/UMSNH por el proyecto 2.7 (2005-2006). Estudio de la microbiota fijadora de N2 asociada a las raíces de teocintle (Zea mays sp mexicana L) y maíz (Zea mays L) y al programa con título similar, en cooperación con el CONACYT/CNRS Universidad Claude Bernard, Lyon, Francia. clave E130.642/México .
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Juan Manuel Sánchez-Yáñez*,
Tran Van Van**
Rodolfo Farias R***
Laboratorio de Microbiología Ambiental, Ecología Microbiana*** Instituto de Investigaciones Químico-Biológicas. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.,
Ed B-1, C.U. Morelia, Michoacán, . México
*autor correspondiente
**Centro Nacional para la Investigación Científica (CNRS)
Universidad Claude Bernard, Lyon, Francia.