La biología molecular ha desarrollado una serie tecnologías que busca verificar las funciones in vivo de determinadas proteínas, o los cambios en la expresión de distintos genes en respuesta a situaciones experimentales que imitan el desarrollo normal de los sistemas vivos.
"Las células troncales embrionarias son totipotentes y se encuentran en pequeño número en el blastocisto donde pueden expandirse en forma indiferenciada durante un corto tiempo y de acuerdo al sitio donde se alojan, ellas adquirirán determinados fenotipos de diferenciación. Las células hemopoyéticas troncales se caracterizan por poseer un gran potencial proliferativo, cuyo modelo de regulación es jerárquico. Ellas retienen, a lo largo de su existencia, un cierto grado de plasticidad, lo cual hace que se puedan diferenciar en distintos tipos de células o de tejidos no hemopoyéticos, de acuerdo al microambiente donde se encuentran o bien a la presencia de ciertos factores estimulantes.
En trabajos recientes se han podido aislar, por adherencia al plástico, en cultivo in vitro de médula ósea, células no hemopoyéticas que fueron llamadas mesenquimales por su semejanza con el tejido mesenquimal del embrión. Estas células, in vitro, pueden ser inducidas hacia nuevas líneas celulares, que se diferenciarán en nuevos tejidos. Las expectativas del beneficio terapéutico del transplante de médula ósea como el de células mesenquimales en enfermedades no hemopoyéticas son grandes, porque al utilizar tejidos o células autólogas, se evitan los graves problemas del rechazo inmunológico. En el caso del tejido nervioso la problemática de una fuente adecuada de donantes hace el tema especialmente interesante".
PROTOCOLOS
La revista Nature, en su número del 20 de junio de 2002, publicó el trabajo de un grupo de investigadores del National Institute of Neurological Disorders and Stroke, en Bethesda, Maryland, dirigido por Ron MacKay en el que anuncian que han conseguido que células madres embrionarias cultivadas, procedentes del cerebro medio de ratones, se diferencien en neuronas productoras de dopamina y, sobre todo, que proliferen en gran número.
Los investigadores, mediante sofisticadas técnicas de ingeniería genética, introdujeron el gen Nurr1 en las células madres embrionarias, con el cual se pone en marcha, con gran eficiencia, su diferenciación en neuronas productoras de dopamina.
Estas neuronas, cuando son trasplantadas en el cerebro de ratas con un modelo experimental de enfermedad de Parkinson (precisamente dentro del área cerebral donde fueron destruidas sus neuronas nativas productoras de dopamina) funcionan normalmente y no sólo producen dopamina, sino que establecen conexiones nerviosas (sinapsis) mediante la extensión de sus axones y modifican la conducta espontánea de dichas ratas.
Las ratas con el modelo experimental de enfermedad de Parkinson, tras el trasplante de las neuronas generadas a partir de células madres embrionarias, dejaron de moverse en círculos /asimetría motora característica de este modelo de Parkinson (y sobrevivieron entre 2 y 3 meses).
Ésta es una de las primeras demostraciones de que neuronas productoras de dopamina, generadas a partir de células madres embrionarias, pueden ser útiles en la recuperación de animales con un modelo experimental de enfermedad de Parkinson.
Uno de los problemas que ha de resolverse es que el nivel de dopamina producido por las neuronas trasplantadas sea el apropiado: desafortunadamente las neuronas trasplantadas producen demasiada dopamina y algunas ratas trasplantadas que se movían previamente en círculos contra-reloj, tras el trasplante lo hacían en el sentido de las agujas del reloj.
En definitiva, los autores concluyen que sus resultados apoyan la idea de que neuronas derivadas de células madres embrionarias sobreviven y funcionan después de ser trasplantadas en el cuerpo estriado cerebral que se ha sido lesionado.
Sus resultados justifican, para los autores, proseguir en las investigaciones sobre la utilización terapéutica de las células madres.
Fuente: http://www.saludlandia.com/celulas-madres-embrionarias-dopamina-parkinson-13502.html
A continuación se muestran algunos protocolos que ejemplifican la diferenciación al linaje dopaminérgico:
Especificación temprana del fenotipo dopaminérgico durante la diferenciación de célula del ES
Durante la formación embrionaria se toman las decisiones del linaje (ES) la diferenciación de las células es crítica porque se da la producción controlada de célula somáticas de tipo terapéutico. La generación in vitro de neuronas dopaminérgicas, que constituyen el tipo de células perdidas en pacientes que presentan la enfermedad de Parkinson; los cerebros, requieren moléculas inductivas por el FGF8, o una célula del estroma desconocida derivada induciendo la actividad del (SDIA). Sin embargo, la identidad exacta de las células de respuesta a la sincronización de la actividad inductiva que especifican las neuronas dopaminérgicas en progenitores todavía siguen siendo evasivas
Metodología
- Cultivo celular:
Las células de Sox1-GFP ES fueron mantenidas en el medio modificado Glasgow de Eagles (GMEM) complementadas con el mercaptoetanol 2, los aminoácidos no esenciales, el bicarbonato de sodio, el suero fetal y el factor inhibitorio de la leucemia (LIF) del becerro se mantuvieron en frascos al 10% gelatinizados.
Las células del ES fueron cultivadas en una capa de las células estromaticasl PA6 por 7 días en GMEM complementadas con suero al 10% (Gibco) en una densidad de 60 células/cm2s.
En el día 7 el medio fue substituido por N2B27 (StemCellSciences) para el resto del período de la diferenciación.
Las células del ES fueron tapados con plásticos gelatinizados del tejido en N2B27 en una densidad de 10 000 células/cm2s. Ambos tipos de cultivos diferenciación fueron procesados para FACS o en el día 3-4 o 7.
- Clasificación de FACS:
Las células fueron tripsinizadas y suspendidas de nuevo en el 1% BSA en un ambiente salino con fosfato (PBS) y filtradas usando un tamiz para asegurar la suspensión unicelular.
Las células vivas fueron bloqueadas basaron en la dispersión frontal y la dispersión lateral y/o por la exclusión del tinte 7AAD. En caso pertinente, excluyeron a la mayoría de las células PA6 basado en su aspecto diferenciado de el de los derivados de la célula del ES en diagrama del PE (autoflouresente) /FITC.
Las dos poblaciones de la célula fueron fijadas usando las células PA6 y se distinguieron las células parentales de E14TG2a ES. En algunos experimentos, las células PA6 que fueron excluidas se basaron en su inhabilidad de excluir 7-AAD. Recogieron a la población del progenitor de GFPpos y la fracción distinguida GFPneg de la célula del ES y la viabilidad de la célula al final del FACS que clasificaba el procedimiento usando el método de la exclusión del tinte del azul trypan. Las células clasificadas FACS fueron utilizadas para la diferenciación neuronal y procesada directamente por el cytospin.
- Diferenciación neuronal
Las células clasificadas FACS fueron vueltas a lavar en Polivinílico-D-lisina (PDL) /Laminin cubriendo los plásticos y las células del PA6, en una densidad de 100 000 células/cm2s en ambos casos. Donde SHH indicado (400 ng/ml, R& D), FGF8 (100 ng/ml, R& D), y FGF2 (10 ng/ml. R& D) fue agregada al medio N2B27. al final del período del cultivo, las células fueron fijadas en paraformaldehido al 4% (PFA) por 15 minutos a temperatura ambiente seguida por 3 aclaraciones en PBS.
- Cytospin
Las células clasificadas FACS fueron diluidas a una concentración de 1 × 105 cells/ml. el μl 100 de las suspensiones de la célula de cada muestra fue hecho girar en 1000 RPM por 4 minutos. Las células fueron fijadas inmediatamente al 4% de PFA por 15 minutos a una temperatura ambiente seguida por 3 aclaraciones en PBS.
- Inmunohistoquímica
Las células fijadas fueron suspendidas con el suero normal al 0.2% por 1 hora seguida por la incubación durante la noche con los anticuerpos primarios: anti-TH del conejo (1: 1000, helada del PEL), anti-TH del ratón (1: 1000, chemicon o 1:500, PelFreeze), ratón anti-β-III-TUBULIn (1: 500, Babco), conejo anti-Pitx3 (1: 500, regalo del Dr. M Smidt), ratón anti-En1 (1: 250, DSHB), conejo anti-Nurr1 (1: 500, Santa Cruz), cabra anti-FoxA2 (1: 200, Santa Cruz), conejo anti-Lmx1a (1: 2000, alemán de M), cabra el 4 de octubre anti- (1: 200, Santa Cruz), conejo anti-Sox2 (1: 200, chemicon). Las células fueron lavadas 3 veces en PBS seguido por la incubación por 1-2 horas con los anticuerpos secundarios flourescence-etiquetados (1: 200, laboratorio de Jackson) y DAPI (1: 1000).
- Cuantificación y análisis estadístico
El número de células positivamente marcadas fue cuantificado contando 18 campos aleatoriamente seleccionados que correspondía a más de 1000 neuronas en total.
DIFERENCIACIÓN NEURONAL EXTENSIVA DE CÉLULAS MADRE NEURONALES DE HUMANO INSERTAS EN LA COLUMNA VERTEBRAL DE RATAS ADULTAS
Derivación de Células Madre Neuronales (NSCs) humanas.
Las NSCs humanas fueron preparadas de la médula espinal torácica cervical y superior de un solo feto humano de ocho semanas después de un aborto electivo. El tejido fue donado por la madre de una forma completamente unánime, teniendo en cuenta las pautas de los institutos nacionales de la salud (NIH) y de la Agencia de Medicamentos y Alimentos (FDA) y aprobado por un comité examinador exterior independiente. El tejido de la médula espinal fue despejado de meninges y de ganglios de raíz dorsal y disociado en una suspensión unicelular por trituración mecánica en medio sin suero, medio N2 modificado, compuesto de 100 mg/l de plasma humano apo_transferrina, 25 mg/l de insulina humana recombinante, 1.56 g/l de glucosa, 20 nM de progesteronas, 100 μM putrescina, y 30 nM de selenito de sodio en DMEM/F12, al cual se le agregσ el factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF) (10 ng/ml). El cultivo inicial fue ampliado en serie como capas monomoleculares en frascos o placas cubiertos primero según lo descrito [13]. Aproximadamente 6.1 × 106 células fueron obtenidas sobre la disociación inicial del tejido de la médula espinal. Todas las células fueron puestas sobre una placa de 150 milímetros en 20 ml de medio de crecimiento. El medio de crecimiento fue cambiado cada día y, en días alternos, se agregaron 10 ng/ml de bFGF.
El primer paso fue conducido en 16 días de revestimiento posterior. En este punto de tiempo, el cultivo fue compuesto principalmente de células NSCs divididas y neuronas post mitóticas. Las células divididas fueron cosechadas por el tratamiento transitorio con tripsina (0.05% + 0.53 mM de EDTA) seguido de disociación mecánica. Así se derivó una suspensión unicelular que fue centrifugada a 1.400 rpm por cinco minutos. El pellet de la célula fue suspendido de nuevo en medio de crecimiento, y las células se volvieron a colocar en nuevas placas pre cubiertas a 1.2 x 106 células en 20 ml de medio por 150 milímetros de placa. Las células fueron cosechadas a una confluencia de aproximadamente 75%, que ocurrió en el plazo de cinco o seis días.
Este proceso fue repetido para 20 pasos. Las células de varios pasos fueron congeladas en medio de crecimiento plus 10% DMSO y almacenadas en nitrógeno líquido. Sobre el deshielo, el índice total de recuperación fue del 80%-95%. La línea celular resultante, producida solamente por medios epigenéticos y usando el bFGF como el único mitógeno, fue codificado "566RSC."
En este estudio fueron utilizadas las células de los pasos 10-12. Fue deshelado un frasco criopreservado del paso apropiado, lavado, y cultivado de nuevo como se describió anteriormente, 5-7 d antes de la cirugía. Para múltiples días de cirugías, los cultivos fueron sembrados en diferentes densidades, de modo que cada frasco alcanzara confluencia en el día de cirugía señalado. Las células fueron cosechadas posteriormente por el tratamiento transitorio enzimático como se describe anteriormente, lavado en una solución salina protegida, dirigido al sitio de la cirugía en hielo mojado, y usado dentro de 24 horas. La viabilidad de las células en hielo fue característicamente mayor del 80% dentro de éste periodo de 24 horas.
UN MODELO IN VITRO DE NEURONAS DOPAMINÉRGICAS HUMANAS DERIVADAS DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS: TOXICIDAD MPP (POSITIVAS) Y NEUROPROTECCIÓN GDNF
Diferenciación dopaminérgica:
Lineas de hESC (células madre embrionarias humanas) BG01 y I6 pueden ser mantenidas en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) alimentadas en Dulbecco´s Modified Eagle"s Medium/Ham"s F12 (DMEM/F12, 1:1) suplementadas con 20% de knockout serum replacement (KSR), 2mM de amimnoácidos no esenciales, 2mM L-glutamine, 5 microgramos/ml Penn – strep (todas de Invitrogen; Carlsbad, CA), 0.1mM beta – mercaptoethanol (Specially Media; phillpsburg, NJ), y 4ng/ml de factor de crecimiento de fibroblasto básico (BFGF, sigma; St Louis, MO), ó en platos revestidos de fibronectina en un medio condicionado con MEF por 24h.
Las células son pasadas manual o enzimáticamente cada 5 días
El medio es cambiado cada día
La diferenciación dopaminérgica de hESCs es inducida por la línea celular estromal PA6 del ratón.
hESCs es sembrado a una densidad de 1000 grupos de células aproximadamente por 3cm de plato sobre una capa confluente de células alimentadoras PA6 en Glasgow Minimum Essntial Media (GMEM, Invitrogen) suplementado con 10% Knockout serum replacement (KSR, Invitrogen), 1mM de piruvato (Sigma), 0.1mM de aminoácidos no esenciales y 0.1mM beta – mercaptoethanol.
Las hESCs permitieron la diferenciación a neuronas dopaminérgicas por 3 semanas sobre células prioritarias PA6 a tratamientos de droga.
El gen foxa2 controla el nacimiento y la degeneración espontánea de las neuronas de la dopamina en edad avanzada
Los modelos dominantes para la enfermedad de Parkinson se basan en el uso de toxinas químicas que matan las neuronas de la dopamina, pero no tratan los factores de riesgo que aumentan normalmente con edad. Los factores de la trascripción son reguladores críticos de la supervivencia y de la longevidad. El factor de la trascripción del gen foxa2, se expresa específicamente en neuronas adultas de la dopamina y sus precursores en la placa intermedia.
Los experimentos del aumento y de la pérdida de función de este gen, foxa2, se requieren para generar las neuronas de la dopamina durante el desarrollo fetal y de las células de vástago embrionarias. Ratones que llevan solamente una copia de las anormalidades del gen foxa2 en edad avanzada presentan una pérdida progresiva de neuronas de la dopamina. La función de manipulación del gen puede regular el nacimiento de las neuronas de la dopamina y su muerte espontánea.
Materiales y métodos
- Immunohistoqumica e histología:
Se toman ratones embarazados CD-1 y los embriones se disecan y se fijan manualmente en paraformaldehido al 4% (PFA) en PBS.
Son transferidos a sacarosa al 20% durante la noche, y son embebidos en compuesto de O.C.T (tissue Tek, Sakra).
Se cortan 12 secciones μm en un criostαtico de 500 OM y se procesan para estudios immunohistoquimicos.
Las secciones marcadas con el anticuerpo anti-SHH son tratadas con 50 milímetros NH4Cl por 20 minutos a una temperatura ambiente y lavadas dos veces con PBS antes de la incubación con el anticuerpo primario.
Los ratones adultos son anestesiados con sodio de pentobarbital (nembutal) y sumergidos en 20 ml de PBS seguido por 40 ml de el 4% PFA.
Los cerebros son disecados hacia fuera, y transferidos a sacarosa al 20% durante la noche, se cortan 40 secciones μm en un criostαtico y se mantienen secciones flotantes en PBS. y se visualiza en un microscopio focal.
Todo el trabajo fue realizado de acuerdo con el instituto nacional de los protocolos de los desordenes neurológicos y de los estudios animales del movimiento (NINDS) 1204-05, 1205-05, y 1247-05, según lo aprobado por el comité del cuidado animal y del uso de NINDS. El conteo de las células fueron realizadas en cada sexta sección dentro del cerebro-medio, directamente en el microscopio.
En los casos en los cuales la densidad de célula hizo difícil discernir fácilmente las células individuales, los cuerpos de célula mancharon para el TH, RALDH1, y GFAP fueron emparejados a sus núcleos DAPI-etiquetados.
Para estimar el número absoluto de neuronas de la dopamina del cerebro medio, multiplicamos el número total de células por seis (frecuencia de muestreo).
Medimos los núcleos de 50 neuronas de la dopamina del cerebro-medio, en el SN y el VTA, y determinamos el diámetro nuclear.
Para Nissl que marcaba, 40 secciones del cerebro del fueron lavadas en agua destilada y montadas en diapositivas.
Las secciones fueron tratadas con un reactivo violeta por 5 mínimos y después lavadas otra vez en agua destilada. Las diapositivas entonces fueron tratadas con una serie del etanol (el 50%, el 70%, el 90%, el 95%, y 100%) y finalmente sumergidas en xileno por 2 minutos.
- Anticuerpos:
Para estudios immunohistoquimicos las secciones del embrión del ratón y de las células fijas in vitro, se utilizan los siguientes anticuerpos: β-galactosidasa (1: 500, conejo monoclonal; Biogénesis); BrdU (1: 200, rata monoclonal; Axyll); FOXA2, Islet1, LIM1/2, NKX2.2, PAX7, y SHH (1: 10, ratón monoclonal; Banco de desarrollo del hibridoma de los estudios, universidad de Iowa); FOXA2 (1: 4.000, conejo policlonal; regalo de Ariel Ruiz I Altaba); FOXA2 (1: 50, cabra policlonal; Biotecnología de Santa Cruz); GATA3 (1: 200, ratón monoclonal; Biotecnología de Santa Cruz); GFAP (1: 500, conejo policlonal; DAKO); LMX1b (1: 4.000, conejillo de Indias policlonal; regalo de T. Jessell); LMX1b (1: 500, conejo policlonal; regalo de la moleta del T.); nestin (1: 500, conejo policlonal; Laboratorio de McKay); NKX2.2 (1: 400, conejillo de Indias policlonal; regalo de B. Sosa Pineda); NKX6.1 (1: 1.000, conejo policlonal; regalo del alemán del M.); PTX3 (1: 400, conejo policlonal; Upstate); RALDH1 (1: 100, conejo policlonal; regalo de Greg Duester); Phox2a (1: 800, conejo policlonal; regalo del Brunet de J. – F.); SOX1 y SOX2 (1: 500, conejo policlonal. regalo de la Lovell-Divisa del R.); e hidroxilasa de la tirosina (1: polyclonals de 500, del conejo y de las ovejas; PEL-freez).
- Cultivo celular:
Los embriones E8.5 (9-13 somaticos) fueron obtenidos de los ratones embarazados sincronizados CD-1.
Los embriones fueron incubados en el medio del N2 que contenía la amilasa del 1% (sigma) durante 1 h a 37°C, para facilitar la disección manual.
Después de retiro del tejido mesenquimatico ectodermo, los cerebros medios embrionarios fueron movidos al medio amilasa-libre del N2. El tejido reunido era lavado 3 veces en PBS y después digerido en el medio del N2 que contenía 0.005% Tripsina-EDTAS (Gibco) para el minuto 5 en la temperatura ambiente.
Las células mesencefalicas disociadas fueron agregadas al medio inhibidor de la tripsina del N2 que contenía (sigma), a 100 ng/ml FGF2, a 100 ng/ml (FGF8), y a 500 ng/ml Shh (R& Sistemas de D).
El medio fue cambiado al medio del N2 (sin el inhibidor de la tripsina) que contenía 100 ng/ml FGF8 y shh.
Las células fueron fijadas con el 4% PFA después de 4h de extensión. Para probar la proliferación de célula, las células fueron tratadas con 10 el μM BrdU (Roche) 1 h antes de la fijaciσn.
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Colombia, Ibagué, 11 de junio de 2008
Autor:
Henao Muñoz Liliana Marcela*
Leiva Sandoval Ana Maria*
Mayorga Beltrán Erika Lucia*
Mosquera Cicero Yudy Alexandra*
* Facultad de Ciencias. Programa de Biología. Universidad del Tolima. Ibagué (Tolima). Colombia.
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