Tratamiento de los Productos de las Bioreacciones. Concentración Y Purificación (página 2)

La ultrafiltración en particular, puede ser empleada tanto para la separación de sólidos como para la concentración del producto y cuando se utiliza para la concentración, el producto permeado tiene posibilidades de ser enviado a una ósmosis reversa para obtener una mayor concentración, lo que da una idea de las múltiples posibilidades de combinación que existen entre los distintos procesos.

En este punto es importante señalar que ha existido una tendencia a considerar juntos los procesos de membrana, tanto los que se usan como alternativa a los filtros convencionales en la separación sólido-líquido como los utilizados para las separaciones moleculares, lo cual no es correcto ya que en ambos casos, aunque existen aspectos comunes como los fenómenos de ensuciamiento de las membranas, los mecanismos que influyen son diferentes. En las separaciones sólido-líquido el mecanismo predominante es de esencialmente mecánico, mientras que en las separaciones mecánicas predomina la difusión.

También se pueden emplear para la concentración la adsorción en desecadores como la alúmina activada. Y existen otras posibilidades de interés, como son el uso de la extracción con membranas preselectivas

Purificación de los productos

Las etapas de purificación finales de los procesos de bioseparación conllevan la separación de las micromoléculas de las macromoléculas, seguidas de la separación entre las macromoléculas. Estas etapas pueden clasificarse como una etapa de purificación primaria, seguida de una etapa final de aislamiento. En las etapas primarias de purificación se incluyen el uso de diálisis, electrodiálisis, extracción, ultrafiltración, tratamiento iónico, cromatrografía de permeación por gel y cromatografía de alto rendimiento. Las etapas de aislamiento final, incluyen la precipitación, extracción, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad.

Estas dos etapas no son mutuamente excluyentes y los límites entre las mismas están definidos de manera arbitraria y no muy precisa, los métodos primarios tienen diversos grados de aplicación en las industrias de bioprocesamiento. Por ejemplo, la diálisis y la electrodiálisis se han usadas durante muchos años en las aplicaciones bioquímicas y biomédicas y en las mismas, las tasas de flujo por unidad de área tienden a ser bajas debido a que el transporte a través de la membrana es forzado por una diferencia de concentración. En el caso de la electrodiálisis se utiliza un campo eléctrico para mejorar el movimiento de los iones a través de una serie de membranas.

La extracción con fluidos supercríticos es un método de separación que promete mucho en los bioprocesos. El solvente más empleado en este tipo de procesos es el dióxido de carbono supercrítico, el cual permite la necesaria limpieza y con el cual se logra incrementar las tasas de extracción normales. Además, el uso de pequeñas cantidades de un solvente puede mejorar considerablemente la solubilidad de las biomoléculas y por ejemplo se ha obtenido una mejora de varias veces en la solubilización de colesterol, estimasterol y ergosterol mediante la adición de 3.5 % molar de etanol o metanol, al solvente dióxido de carbono (Wong y Johnston, 1986).

En los últimos años, un proceso que ha recibido mucha atención es la extracción de biomoléculas utilizando dos fases acuosas inmiscibles, las que se obtienen, por ejemplo, añadiendo al agua materiales como dextrana y polietileno, con lo cual pueden surgir dos fases inmiscibles en determinadas condiciones.

Precipitación de proteínas

Las operaciones de precipitación se utilizan ampliamente para la recuperación de biomoléculas y especialmente de proteínas. La precipitación se induce normalmente por adición de sal o de un solvente orgánico, para alterar la naturaleza de la solución, de manera tal que las proteínas precipiten. La precipitación selectiva de unas proteínas de una solución de varias proteínas, es una de las técnicas más antiguas de concentración y purificación (Chisti y Moo-Young, 1991).

Los factores de purificación que se obtienen están entre 3 y 10 veces, lo que resulta modesto comparado, por ejemplo, con los métodos cromatográficos. Los métodos de precipitación se pueden aplicar a grandes cantidades de materiales que pueden estar bastantes crudos (residuos celulares, sólidos suspendidos, contaminantes, etc.) y además, permiten la aplicación efectiva de la operación continua. Por todas esas características, la precipitación se encuentra frecuentemente en los esquemas industriales de purificación de proteínas, fundamentalmente en las primeras etapas de purificación.

El proceso de precipitación convierte la proteína soluble en una forma insoluble alterando las interacciones soluto-solvente. Las moléculas de proteínas pueden acarrear cargas positivas y negativas, estando en dependencia la carga neta del pH de la solución. Cuando la proteína está en su pH isoeléctrico, la molécula de proteína lleva carga neta cero y es menos soluble en un solvente polar, como es el caso del agua. Ese punto isoeléctrico es normalmente muy diferente en las distintas proteínas y esto hace posible que mediante la variación por pasos del pH de una solución de proteínas se puedan precipitar y colectar fracciones diversas, aunque hay que tener en cuenta que la exposición a valores de pH extremos puede provocar la desnaturalización de las proteínas y causar la pérdida de su actividad biológica. Esta técnica de separación de proteínas por variación del pH se emplea en la industria de los alimentos, por ejemplo en la coagulación de la leche.

El agua es un solvente polar fuerte, con una alta constante dieléctrica (K 21 a 20C), por quel interactúa con la proteína cargada, manteniéndola en solución. La adición de un solvente menos polar como algunos compuestos orgánicos (metanol, etanol, acetona) reducen la constante dieléctrica de la solución y de manera correspondiente disminuye la solubilidad de la proteína. Los solventes orgánicos tienen una gran afinidad con las superficies hidrofóbicas de las proteínas y esto provoca la desnaturalización de las proteínas junto con su precipitación y por ello la concentración de solvente orgánico normalmente se mantiene baja, aunque existen algunos como el 2 Metil-2,4-Pentano Diol (MPD), el Dimetil Sulfóxido (DMSO) y el etanol que se pueden utilizar también en altas concentraciones.

En general, la técnica de precipitación de proteínas más utilizada es la precipitación por adición de sales, conocida como precipitación por salado (salting-out). La adición de sal (como sólido cristalino o como solución concentrada), a las soluciones de proteínas, reduce la solubilidad de las proteínas. El efecto se deber al parecer, de la reducción de la actividad del agua o de la disponibilidad de agua para la hidratación de la proteína aunque el mecanismo exacto del proceso es hasta ahora discutible.

La efectividad de aniones y cationes en el proceso de precipitación por salado de las proteínas depende de su carga iónica y en general, mientras más alta es la carga más efectivo es el ión. Basado en esa observación, muchos iones pueden agruparse en una serie de eficiencia de precipitación por salado, conocida como serie liotrópica o serie de Hofmeister (Tabla 1), aunque esto no constituye una relación completa de todos los posibles iones. Las sales que comúnmente se emplean son los sulfatos de amonio y sodio y los fosfatos de sodio y potasio. De ellas, el sulfato de amonio es bastante usado por ser barato y soluble a bajas temperaturas, sin embargo es también corrosivo y libera amoniaco en un ambiente alcalino. Este proceso de precipitación por sales se controla por la fuerza iónica I de la solución, la que se calcula mediante:

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Tabla 1. Serie liotrópica de iones

La parte lineal de ese gráfico se describe por la llamada ecuación de Cohn:

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donde KSL es la constante de precipitación por salado.

La constante depende del pH, la temperatura y la proteína, pero se afecta poco por el tipo de sal

Las características de los precipitados de proteínas dependen significativamente de factores tales como el método de contacto de la sal y la solución de la proteína, la naturaleza del mezclado y la magnitud de los campos de cizalladura en el reactor de precipitación, así como efectos del envejecimiento.

Figura 2. Comportamiento típico de la solubilidad de una proteína en función de la fuerza iónica (De Chisti y Moo-Young, 1991).

En la práctica se ha comprobado que los recipientes de mezclado, agitados con impelentes helicoidales de cinta, de baja razón de cizalladura, resultan muy útiles para el proceso de contacto entre el reactivo y las soluciones de proteínas (Figura 3).

Figura 3. Mezclador con impelente de cinta helicoidal para la precipitación de proteínas (De Chisti y Moo-Young, 1991).

Extracción líquido-líquido

La extracción líquido-líquido es mucho más practicada en las industrias biotécnicas y en su forma más convencional, se utiliza un solvente para extraer uno o más componentes de una mezcla líquida. Este tipo de operación puede requerir más de una etapa de contacto en equilibrio, con flujos en modo cruzado o a contracorriente. En las bioseparaciones se han utilizado ampliamente extractores especiales como los contactores centrífugos Podbielniak

Es un método de remoción selectiva de una sustancia deseada desde una mezcla en fase líquida hacia un segundo líquido inmiscible. El soluto (antibiótico, ácido orgánico) se encuentra normalmente en una solución acuosa (caldo de fermentación o licor) y cuando contacta con un solvente inmiscible se distribuye o particiona por si propio, entre las dos fases. La extensión de la partición se determina por el coeficiente de partición kp que se define como:

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Para ácidos orgánicos y bases tales como penicilinas, ácido benzoico, ácido cítrico y eritromicina, kp depende fuertemente del pH: las formas de sales de esos compuestos, ejemplo benzoato de sodio, tienen solubilidad preferencial en medio acuoso, mientras que las formas ácido (ácido benzoico) o base (eritromicina) muestran más solubilidad en compuestos orgánicos menos polares.Para realizar las extracciones deseadas se realizan variaciones de pH y para ello se utilizan adiciones de sales inorgánicas, ácidos grasos, detergentes, etc. También se han utilizado fases orgánicas compuestas de mezclas de dos o más solventes orgánicos y en esos casos la kp puede ser alterada cambiando la composición del solvente.

La relación entre la cantidad total de soluto en las dos fases se conoce como grado de separación (G) y depende de los volúmenes de solvente y de caldo:

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hay que tener en cuenta que esta ecuación, además de la ecuación 3, son relaciones de equilibrio.

En la industria hay disponibles diversos tipos de equipos de extracción líquido-líquido y en particular, en la industria de los antibióticos se han utilizado extractores centrífugos como el mencionado extractor Podbielniak, para lograr una extracción muy rápida Figura,4.

Las proteínas y otros biopolímeros que presenten una solubilidad razonable solamente en soluciones acuosas, o que se desnaturizan en los solventes orgánicos, pueden ser purificados por extracción líquido-líquido entre dos fases acuosas. En esos casos se producen fases acuosas inmiscibles, disolviendo en las mismas concentraciones elevadas de dos polímeros diferentes o de combinaciones de polímero y sales en agua

Figura 4. Extractor centrífugo tipo Podbielnak

Cromatografía

La aplicación industrial de cromatografía como una tecnología de separación industrial, a gran escala ha probado por sí misma ser particularmente valiosa para la purificación de proteínas. La producción de insulina, hormonas y enzimas medicinales hacen ya uso de esta técnica mientras que el fraccionamiento de plasma sanguíneo por cromatografía está también en rápido desarrollo. En general mezclas muy complejas pueden ser separadas o resueltas en sus componentes por esta técnica.

Todas las separaciones cromatográficas dependen de interacciones fisicoquímicas entre los componentes disueltos de una mezcla y una fase estacionaria. Esta última es comúnmente un sólido o un líquido soportado sobre un sólido, que están contenidos en una columna empacada. La mezcla a separar se aplica a la columna en un pequeño volumen de solución y posteriormente la columna se lava con un solvente que constituye la fase móvil y los distintos componentes de la mezcla se mueven hacia abajo en la columna, con velocidades diferentes que dependen de cuan fuerte sea la interacción entre el compuesto en particular y la fase estacionaria. Los compuestos que se asocian fuertemente con la fase estacionaria, fluyen hacia abajo a una velocidad menor que aquellos que no lo hacen tan fuerte (Chisti y Moo-Young, 1991).

En las separaciones biológicas industriales la fase móvil es siempre un líquido, normalmente una solución acuosa. Sin embargo la naturaleza de las interacciones entre los componentes de la mezcla y la fase estacionaria pueden ser diferentes, lo que da lugar a diferentes tipos de cromatografía, entre las que se incluyen: afinidad, intercambio iónico y cromatografía hidrofóbica, así como filtración por gel. Todas son útiles en las separaciones biotecnológicas, siendo usadas ampliamente las de intercambio iónico para la purificación de proteínas, mientras que la cromatografía de afinidad constituye una técnica especialmente poderosa para las sustancias biológicamente activas.

El proceso de cromatografía en general comienza cuando la mezcla se aplica a la columna cromatográfica y el flujo de solvente comienza. Entonces la variación de la concentración de los componentes en el tiempo se comporta de la forma que se muestra en la figura 5

Figura 5. Cromatograma típico (De Chisti y Moo-Young, 1991).

En ese ejemplo, los picos corresponden a los dos componentes A y B de la mezcla y la extensión de la separación se mide por los picos de resolución Rz, definidos como la diferencia entre los tiempos de retención (ta y tb) de los componentes, dividido por el ancho promedio del pico:

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Los anchos de los picos se miden en unidades de tiempo. Cuando Rz es igual a 1.0, el área de solapamiento de los dos picos es aproximadamente el 2% del área total de los picos. Para reducir el solapamiento a 0.1%, la resolución debe ser de 1.5 o mayor. (Chisti y Moo-Young, 1991).

Como se señaló anteriormente, se han utilizado varios tipos de cromatografía para el aislamiento de las biomoléculas, entre las que se destaca la Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC), con la cual se ha estado trabajando intensivamente en los últimos años con relación principalmente a la determinación adecuada de los parámetros de escalado necesarios para las capacidades industriales requeridas. Para este proceso de escalado es imprescindible contar con modelos matemáticos adecuados que permitan pasar de los resultados de laboratorio a los requerimientos industriales y también en este campo se han obtenido avances importantes

Figura 6. Comparación entre los resultados de una cromatografía analítica y otra preparativa

En la figura 6. se presenta una comparación entre los comatogramas de la escala analítica y la escala preparativa, para la purificación de la uracil-ADN-glicosilasa, Se aprecia claramente como la columna más grande (escala preparativa) no hace un corte tan preciso entre las enzimas y las proteínas, en gran parte debido al grado de mezcla de los fluidos en su flujo por la columna. En este aspecto hay que considerar los requerimientos diferentes que tienen ambos tipos de cromatografía, ya que en la analítica, por ejemplo, lo determinante es la precisión de la separación, sin importar mucho el costo entre otras cosas por la pequeña escala de operación, mientras que en el caso de la escala preparativa, por el contrario, los costos tienen una gran importancia. En la actualidad se han obtenido grandes avances en este campo y por lo tanto las técnicas de HPLC ofrecen una gran perspectiva para el escalado de la producción de productos proteicos de la biotecnología

Otro método cromatográfico prominente es la cromatografía de afinidad, denominada en ocasiones adsorción bioespecífica. Esta operación puede verse de forma muy similar a un adsorbedor de cama fija, pero con limitaciones con relación a la capacidad y con requerimientos de refrigeración. En este proceso, un ligando específico como un inhibidor enzimático, se agrega a un soporte sólido, como las perlas de agarosa y se empacan en la columna de contacto. Una enzima específica en la mezcla alimentada interactuará con el ligando inmovilizado, efectuando de esa forma la separación.

En el modo de regeneración, la enzima capturada se remueve con una corriente que tiene una fortaleza iónica modificada o con cualquier otra propiedad que sirva a las necesidades de remoción.

Productos recombinantes

4.1 Solubilización de proteínas recombinantes

Las proteínas recombinates cuando se expresan en bacterias, generalmente, se forman agregados proteicos inactivos e insolubles denominados cuerpos de inclusión. En células eucariotas las proteínas heterólogas son secretadas al medio de cultivo y raramente dichas proteínas se obtienen intracelularmente asociadas a la estructura de la membrana mediante interacciones iónicas o por enlaces de hidrógeno.

Para la purificación a partir de los cuerpos de inclusión o las que quedan enlazadas a las membranas deben ser solubilizadas con agentes caotrópicos o desnaturalizante que se conoce como extracción o solubilización. En la composición del medio adecuado para la extracción se debe tener en cuenta diferentes factores como el pH, la fuerza iónica, las interacciones hidrofóbicas, el potencial redox y la presencia de proteasas. Estos deben garantizar la estabilidad de la proteína y su remoción eficiente de las células o tejidos. La solución final involucra un compromiso entre el máximo de recobrado y la pureza superior.

• Renaturalización de proteínas recombinantes

Los agentes caotrópicos y reductores empleados en la extracción provoca la ruptura de los puentes disulfuro y de las interacciones hidrofóbicas dando como resultado la pérdida de las estructuras terciarias y secundarias y la obtención de cadenas polipeptídicas linéales, fenómenos que se conocen como desnaturalización. La renaturalización es el proceso contrario donde la proteína recupera su estructura terciaria nativa, que le confiere su actividad biológica específica. Existen métodos que se pueden emplear para la renaturalización entre ellos se pueden mencionar a la dilución, diálisis, diafiltración y cromatografía por filtración en gel. El objetivo consiste en cambiar o remover el exceso de agentes desnaturalizantes y reductores, lo que permite que las proteínas en cuestión vuelvan a su estado natural. Las principales características de cada método se muestran en la tabla 2.

El problema fundamental del proceso de renaturalización es el bajo recobrado de algunas proteínas debido a la formación de agregados de especies plegadas de una manera incorrecta. Esta agregación es un fenómeno intermolecular, por lo que es altamente dependiente de la concentración proteica.

Tabla 2. Comparacion de los métodos más utilizados en la renaturalización de proteínas.

Los estudios mas actuales han demostrado que se originan por las interacciones entre las regiones hidrofóbicas en las cadenas polipeptídicas plegadas parcialmente por lo que provoca que las condiciones en que las proteínas se renaturaliza tienen que ser cuidadosamente seleccionadas teniendo en cuenta parámetros externos como es la temperatura, el pH, la fuerza iónica, la agitación y los factores internos como la concentración de proteínas y el tiempo. Para evitar la agregación se han utilizado aditivos como: L-arginina, moléculas chaperonas, sales y alcoholes de cadenas cortas, que aumentan la solubilidad de los intermediarios con plegamiento parcial e inhiben la reacción de agregación.

• Precipitación de proteínas recombinantes

Al comenzar la purificación de las proteínas recombinantes extracelulares o intracelulares hay un concentrado de proteínas, lípidos y otros componentes como polisacáridos, sales y agua. En la mayoría de los casos hay muchos contaminantes .Por lo primero se emplea generalmente un paso de limpieza o pretratamiento que permite clarificar el flujo de materiales suspendidos, sales y contaminantes no proteicos. Las operaciones típicas de este paso incluyen la absorción, interacción hidrofóbica, separación de dos faces acuosas o la precipitación de proteínas.

La precipitación de proteínas es la operación más ampliamente estudiada y usada para una purificación parcial antes de utilizar un paso de alta resolución. El principio básico de esta técnica es provocar una alteración de alguna propiedad del solvente original que promueve la insolubilización de las proteínas.

Entre las ventajas del uso de la precipitación: la operación es fácilmente adaptable a gran escala, se puede hacer continuamente, requiere de un equipamiento simple y se puede basar en número grande de alternativas además se usan reactivos a muy bajas concentraciones.

Los métodos mas utilizados en la precipitación de proteínas son: la precipitación de euglobulinas; por salado o "salting-out"; con solventes orgánicos; con polímeros orgánicos neutros; con polielectrolitos; con iones metálicos; por inmunoafinidad; por desnaturalización selectiva y con colorantes. La precipitación de euglobulinas se basa en la insolubilización de estos tipos de proteínas insolubles en agua, a medida que se le disminuye la concentración salina hasta valores cercanos a 0.

Una de las técnicas más ampliamente utilizadas en la purificación es la precipitación por salado o "salting-out". Una gran ventaja del fraccionamiento por sulfato de amonio, que lo sitúa virtualmente por encima de las otras técnicas, a demás de su sencillez es la estabilización que ocurre en las proteínas. Un precipitado proteico es a menudo estable por años y constituye el método natural de empacar las proteínas comerciales. Las altas concentraciones de sal previenen la acción proteolítica y bacteriana, por ello es útil tener siempre en una purificación una etapa donde la muestra pueda ser dejada durante la noche.

Otra precipitación muy utilizada por su simplicidad es isoeléctrica. Se basa en el ajuste del pH al punto donde la carga neta es 0. De esta forma, se minimiza la repulsión y se puede tener como resultado una atracción electrostática de cada una de las moléculas entre si. Este es el punto de mínima solubilidad o pH isoeléctrico y en muchos casos tal ajuste resulta en precipitación. Cuando el pH de una mezcla de proteínas se ajusta al pH isoeléctrico de unos de sus componentes, la mayor parte o casi todo el componente precipitará, quedando en la solución las proteínas cuyos valores de pH isoeléctricos se encuentren por encima o por debajo de aquel. La proteína precipitada isoeléctricamente permanece en su conformación nativa, y puede redisolverse en un medio de pH apropiado y concentración salina adecuada.

Por otra parte, el método de precipitación proteica mediante solvente orgánica se basa en la adición de un solvente orgánico miscible en el agua, como el etanol o la acetona, a un extracto acuoso que contiene proteínas. Esto provoca una variedad de efectos que, combinados, conduce a la precipitación proteica. Una ventaja del fraccionamiento con solventes orgánicos es que este puede operar a temperaturas inferiores a 0°C, ya que todos los solventes miscibles forman mezclas con agua que se congelan a temperatura bien por debajo de 0°C.

Las sales y los solventes orgánicos no son los únicos materiales que pueden provocar agregación de proteínas sin desnaturalización. Se han investigado la capacidad de una variedad de polímeros de alto peso molecular, neutrales y solubles en agua, para precipitar las proteínas. Sin embargo, la alta viscosidad de la mayoría de las soluciones resultó una desventaja para que su uso como precipitantes no fuera práctico. Uno de los polímeros mas usados y que se pudiera considerar una excepción es el polietilenglicol (PEG).

Los polielectrolitos son polímeros solubles en agua que contienen grupos ionizables repetidos. Estos han sido usados en la purificación de proteínas, especialmente a escala industrial, los cuales pueden ser reutilizados.

La acción precipitante de los iones metálicos se utiliza en la purificación de proteínas. Este método se basa en la habilidad de estos para reaccionar con sitios específicos de la molécula de proteína aunque no todos los complejos metal – proteína son insolubles.

La existencia de interacciones altamente específicas entre las proteínas y moléculas biológicas o sintéticas se ha utilizado para desarrollar una técnica especialmente selectiva, conocida como precipitación por afinidad. El método es conceptualmente similar a la cromatografía por afinidad y utiliza ligandos específicos como sustratos, coenzimas o inmunoglobulinas, enlazados a un polímero soluble en agua.

Existe un gran número de proteínas que son muy resistentes, incluso a condiciones extremas. Se puede utilizar esta excepcional estabilidad exponiendo un preparado impuro a estas condiciones donde las proteínas no deseadas se desnaturalizan y precipitan fuera de la solución, fenómeno conocido por desnaturalización selectiva. Se crean condiciones donde la proteína de interés no se desnaturalice y los contaminantes se desnaturalicen y precipiten. Los parámetros en que se han puesto el mayor énfasis han sido la temperatura, el pH y los solventes orgánicos.

Purificación de alta resolución

En dependencia de la pureza requerida para el uso del producto, la etapa de pretratamiento pudiera ser suficiente. Después de este paso probablemente se usara un método de purificación de proteínas de alta resolución, que generalmente se realiza por cromatografía. La selección se basa en las diferentes técnicas cromatografías para separar la proteína de interés de sus contaminantes como cromatografía de adsorción, de fase reversa, de interacción hidrofóbica, de afinidad, cromatoenfoque, siendo la cromatografía defiltración en gel y de intercambio iónico, las más empleadas por su alta resolución capacidad y simpleza

Referencias

Aiba S., Humphrey A. E. And Millis N. F. 1973. Biochemical Engineering, 2da edition, Academic Press, New York.

Chisti, Y., Moo-Young, M., in Biotechnology: The Science and the Business, Moses, V., Cape, R. E., eds, Harwood Academic Publishers, New York, 1991, pp. 167-209. Fermentation technology, bioprocessing, scale-up and manufacture.

Scragg. A. H 1997. Biotecnología para Ingenieros. Sistemas biológicos en procesos tecnológicos. Ed. Limusa, S.A de C. Grupo Noriega. Editores Balderas 95, México. D.F

Autor:

Lilian Sánchez Miranda

BIOPROCESOS III.

Categoría: ingeniería