Análisis y evaluación Fitoquímica de los metabolitos secundarios

Resumen

Vismia ferruginea (Clusiaceae) o Punta de Lanza es una planta nativa de América tropical, que es empleada en medicina tradicional como analgésico Y como incienso en fiestas religiosas, también es aprovechada en carpintería y Construcción. Sobre la familia Clusiaceae se puede decir que presenta xantonas, benzofenonas, cumarinas y flavonoides; pocos son los estudios Fotoquímicas de Vismia ferruginea, pero Álvarez (2008) estableció el poder Antioxidante de sus extractos. El presente estudio se realizo con el propósito de Evaluar a través de pruebas Fotoquímicas preliminares (Reacciones de Precipitación y coloración o gota a gota, y pruebas cromatografías) la Identificación de los principales metabolitos secundarios de Vismia ferruginea, con posible acción farmacológica entre otras; para ello se preparo un Extracto alcohólico por maceración, en donde a través de la aplicación de Diferentes pruebas, ensayos y cromatografías de capa delgada (TLC) se determino la presencia o ausencia de los metabolitos de interés. en ese orden se obtuvieron resultados positivos para presencia de azucares reductores, polifenoles, taninos, terpenos, flavonoides, cardiotónicos, lactonas terpenicas; y pruebas negativas para la presencia de cumarinas, alcaloides, antraquinonas, iridoides, saponinas, azucares no reductores.

Las pruebas Cromatograficas reiteraron los resultados de los ensayos gota a gota y además Indicaron la no presencia de antocianinas en el extracto. Como conclusión queda la necesidad de realizar estudios de actividad biológica y de presencia de metabolitos secundarios en otros órganos de la planta y con otros extractos.

Palabras clave: Vismia ferruginea, Etnobotánica, extracto etanolico, Metabolitos Secundarios.

Introducción

La exploración de plantas medicinales enmarcada dentro de la investigación etnobotánica como una vía segura, rápida y adecuada para encontrar nuevos medicamentos, ha adquirido gran importancia en el mundo moderno, para enfrentar los grandes problemas de la salud, especialmente cuando el hombre se encuentra sorprendido e indefenso como lo estuvo en la primera década del siglo XX, con nuevas o reconocidas enfermedades infecciosas y gran cantidad de patógenos resistentes a principios activos efectivamente utilizados como los antibióticos (Forero-Pinto).Existen numerosos ejemplos de drogas que se han desarrollado a partir de plantas utilizadas en la medicina tradicional (Desmarchelier et al, 1995). Vismia es un género de plantas perteneciente a la familia Clusiaceae. Como la mayoría de los miembros de Clusiaceae, las especies de este género contienen xanthonas.

Las especies del genero Vismia son árboles y arbustos de amplia distribución; se encuentran principalmente en las regiones tropicales y subtropicales de América del Sur y Central, aunque algunas pocas especies también se hallan en África y Asia (Botta et al.).

Estas especies han sido empleadas abundantemente alrededor del mundo en la medicina tradicional para el tratamiento de algunas enfermedades, particularmente el látex producido por diferentes especies, tales como V. augusta, V. confertiflora, V. dealbata, V. baccifera ssp. ferruginea y V. guianensis entre otras, se han usado para el tratamiento de heridas y ulceraciones infectadas, enfermedades fúngicas de la piel, herpes en los labios, como purgante y febrifugo, entre otras (Cárdenas y López, 1987; Nagem y Oliveira, 1988; Fuller et al., 1999 y Van Andel, 2000).

Este estudio se realizó con el objetivo identificar los principales metabolitos secundarios de Vismia ferruginea, con posible acción farmacológica entre otras.

Generalidades

Vismia Ferruginea

pertenece a la familia Clusiaceae, esta familia se caracteriza por tener hojas simples, opuestas, enteras, sin estípulas, la mayoría posee látex blanco o amarillo. Vismia tiene savia anaranjada y muchos nervios laterales finos y paralelos (Buitrón, 1989)

Esta familia comprende unas 1200 especies en una cincuentena de géneros.

Son por lo general árboles y arbustos con savia lechosa y frutos en capsula (Maguire, 2000)

Algunos géneros importantes son

Clusia,

Tovomitopsis,

Chrysoclamis (UTPI).

Aspectos etnobotánicas

Es una especie utilizada en carpintería y la corteza, que es fuerte, se ha usado para techar casas. Forma, dentro de los bosques, asociaciones puras, porque es altamente re generable. De acuerdo a Mahecha, 1983, "las hojas de este árbol no dejan crecer otro tipo de vegetación y es atacado por un gusano con bandas negras rojizas", que defolia totalmente y cuyas picaduras son muy dolorosas.

Los Yaneshas, que son una etnia de la selva amazónica peruana, tienen usos específicos para esta planta, la llaman Mareñets que significa uta de agua, ellos antes de dormir utilizan el látex anaranjado encima de la parte afectada.

Una vez que esté bien pegado lo dejan hasta que este se desprenda por sí solo. Además de esto recomiendan seguir una dieta sin pescado además de usar sal ni comer cosas calientes (Ramuesh, sf)

Además de estos usos medicinales en algunas regiones usan el látex de la planta como incienso en fiestas religiosas; estas personas cosechan los cúmulos de resina que se endurecen en los troncos. Las raíces y la corteza de Vismia guineensis es utilizada para enfermedades en la piel (Gunasekera et al., 1977).

Igualmente esta planta es usada como colorante (Echavarría, 1987), las partes que de la planta que se usan para este fin son las hojas, de las cuales obtienen los colores como Amarillo, amarillo encendido, amarillo oscuro, verde oscuro y verde claro.

Según el Centro Nacional de Investigación de Café, en Colombia, Vismia ferruginea

es nativa de América tropical, forma asociaciones dentro del bosque y en centro y sur América se encuentran aproximadamente 40 spp. Del género.

Taxonomía

La familia Clusiaceae fue dividida en 2 subfamilias: Clusioideae (subfamilia típica) e Hypericoideae. Esta última familia a menudo es tratada como familia Hypericaceae. La subfamilia Hypericoideae es más común en zonas templadas y la subfamilia Clusioideae se centra en zonas tropicales.

Sin embargo las últimas clasificaciones dividen a la familia de una manera más fina. La siguiente taxonomía sigue sobre todo el de Stevens (1980):

Reino: Plantae

Filo: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Theales

Familia: Clusiaceae

Subfamilia: Hypericoididae

Tribu: Vismieae

Género: Vismia

Especie: Vismia ferruginea

Descripción botánica

Árbol de tronco cuadrado con ritidoma, ramas con indumento café oscuro, hojas simples, opuestas de peciolo puberulo, limbo ovado lanceolado, de 12 – 15 cm. de largo, por 7 – 10 de ancho, puberulo café en el envés, con puntos negros, haz glabros, con las nervaduras cubiertas de pequeños tricomas blanquecinos. Las yemas y parte terminal de las ramas están recubiertas de un indumento café oscuro.

Flores blancas, pequeñas en inflorescencias terminales y subterminales.

CARACTERES DISTINTIVOS

Árbol de 10-15 m.

Corteza densamente fisurada.

Copa Piramidal.

HOJAS

Follaje de tonalidad verde anaranjada. simples, opuestas, enteras, sin estípulas

FLORES

Flores blancas y pequeñas

FRUTOS

Frutos parecidos a tomaticos de 15 milímetros de diámetro, con abundantes semillas.

OTROS CARACTERES

Látex anaranjado, ramas y envés de las hojas cubiertos con indumento ferruginoso.

Antecedentes

Los metabolitos secundarios producidos por plantas constituye una fuente de sustancias bioactivas. Hoy en día los científicos están interesados en este tipo de metabolitos, además que ha aumentado la búsqueda de nuevas drogas de origen vegetal. Las plantas de la familia Clusiaceae son conocidas como buenas fuentes de este tipo de compuestos. En Camerún muchos metabolitos secundarios han sido aislados de numerosas plantas de la familia Clusiaceae, entre los cuales se pueden citar las xantonas, benzofenonas, cumarinas y flavonoides (Nkengfack et al. 2002; Ouahouo et al., 2004; Komguem et al.,2005).

La presencia de Xantonas, es de gran importancia, ya que estas poseen una actividad antidepresiva y antituberculosa.

Además de poseer acción antimicrobiano, antiviral y cardiotónico (Hostettmann and Wagner, 1977; Suzuki

et al., 1980, 1981; Kitanov and Blinova, 1987).

Estudios recientes en frutos de Vismia, han establecido el potencial antioxidante de los extractos de Vismia ferruginea, Vismia baccifera, y se cree que esta actividad antioxidante está asociada con las características químicas de los metabolitos encontrados en estas plantas (Álvarez, 2008).

Materiales y métodos

Material Vegetal

El material fue obtenido de hojas frescas recolectadas de plantas de Vismia Ferruginea. La planta fue suministrada por el docente Héctor Esquivel (Herbario Toli – Universidad del Tolima) y colectada en el barrio el Salado de la ciudad de Ibagué, en las horas de la de la mañana.

Preparación del Extracto Vegetal

Las hojas fueron pesadas previamente y secadas en estufa a 45º C en un tiempo de 24 -48 h, ya secas fueron maceradas (1h), para preparar el extracto, como solvente se utilizo etanol al 96 % (relación 1:10), con tiempo de extracción de 24 horas a agotamiento (Murillo & Méndez, 2008)

Se determinaron algunos parámetros e índices de calidad del material

recolectado: % de humedad, % de cenizas y sólidos totales, para el porcentaje de humedad se utilizaron muestras vegetales frescas.

% de Humedad

Es la medida de cantidad de agua, puede determinarse el porcentaje de esta en base seca o en base humeda y representas una caracterisitica importante para cualquier análisis que se le haga al solido (Hart, L y Fisher H. 1971).

% de Cenizas

El termino de cenizas está definido por el porcentaje en base seca, del cociente de la muestra calcinada y la muestra seca (Badui, S. 1986).

Pruebas para la determinación rápida de metabolitos secundarios

(Ensayos gota a gota).

Para la identificación de los grupos Fitoquímicos generales del extracto fueron realizados algunos ensayos según la guía de Murillo & Méndez (2008). El test para aminoácidos fue realizado a través del reactivo ninhidrina.

Para carbohidratos se realizaron las pruebas de Antrona; de Molisch; de Benedict; de Seliwanoff (resorcinol), para azucares no reductores, y la prueba de yodo para identificación de polisacáridos vegetales (almidón).

Para la identificación de saponinas se utilizaron: la prueba de la espuma. Para polifenoles se utilizo: el ensayo con el reactivo de Folin-Ciocalteu (FC). Para la determinación de taninos se aplicaron las pruebas de: Cloruro ferrico, Prueba de gelatina-sal, Prueba para diferenciación de taninos condensados e

hidrolizables, prueba especificas para identificación de taninos hidrolizables y condensados respectivamente.

Para la determinación de flavonoides se utilizo:

Reacciones de precipitación y coloración por Hidróxido de Sodio, prueba de Shinoda, ensayo con Zn/HCl, y OD 3UXHED GH 3HZ·V.

El test para fenilpropanoides incluía las pruebas de:

Reacciones de precipitación y coloración con el reactivo de Arnow. La caracterización de

antraquinonas se realizo por la reacción de Bornträger; y las pruebas para Terpenos / Esteroides realizadas fueron: Reacción de Lieberman-Burchard y la reacción de Salkowski. Posteriormente otras pruebas fitoquímicas incluían:

determinación de Iridoides la reacción de precipitación y coloración por reactivo de vainillina. Las pruebas de alcaloides incluían reacciones de precipitación y coloración, con los reactivos de Tanred, Drangerdoff, Mayer, Wagner, Erlich, Reineckato de Amonio y Valser.

Además para comprobar presencia de núcleos especiales, se realizo la prueba de Marquis, la prueba

del Acido Nítrico, y el ensayo con [H SO ]/K Cr O (3.0%).

Para la detección de Glucósidos Cardiotonicos, las pruebas realizadas incluyeron: Algunas reacciones de coloración y precipitación como la del reactivo de Baljet, el reactivo de Kedde, la prueba de Kéller-Killiani y la reacción de Salkowsky, la reacción de Lieberman-Burchard fue una prueba opcional. Para diferenciar el anillo lactonico en relaciona las cumarinas, la detección de esta última se hizo por la reacción de precipitación y coloración con NaOH. La última prueba de caracterización de metabolitos secundarios, es la identificación de la presencia de Lactonas Terpenicas, a través de EtOH-CH Cl y acetato de plomo.

Evaluación Fitoquímica Preliminar (Cromatografías)

La cromatografías utilizadas en este informe, tanto las fases móvil, estacionaria y reveladores fueron sugeridos por la guía elaborada por Murillo & Méndez (2008). Para la identificación de carbohidratos se utilizo: Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria: sílica gel G-60, fase móvil: isopropanol, acetato de etilo, agua (5:4:1), revelador: solución alcohólica sulfúrica; para taninos o polifenoles en general: Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria: sílica gel G-60, fase móvil: BAW 4:1:5, revelador: Luz UV; para flavonoides: Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria: sílica gel GF254, fase móvil: acetato de etilo, ácido formico, ácido acético, agua (11:11:27), revelador: se analizo después de asperjar con AlCl al 1% en etanol 3 con observación al UV; además se realizo cromatografía de capa delgada en papel, con fase móvil: BAW (4:1:5) y de revelador vapores de amoniaco; para fenilpropanoides:

Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria:

sílica gel G-60, fase móvil: n-hexano-cloroformo 3:2, revelador: vainillina al 1% en H SO2 al 5%; la evaluación de antraquinonas fue por: Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria: sílica gel G-60, fase móvil: acetato de etilo 8:2, n-propanol, acetato de etilo, agua (40:40:30), revelador: UV-365 nm; y por ultimo para terpenos y esteroides se utilizo: Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria: sílica gel G-60, fase móvil: 2,4 dinitrofenilhidracina, éter de petróleo, revelador: Lieberman-Burchard.

Para alcaloides: Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria:

Sílica gel G-60,

Fase móvil:

CHCl -AcOEt.3 (8:2), revelador: reactivo de Dragendorff.

Lss glucósidos cardiotónicos fueron detectadas por:

Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria: sílica gel G-60, fase móvil: Acetato de etilo: metanol: agua. (100:13.5:10), Revelador: reactivo de Bajlet a luz UV 365 nm, Para las cumarinsa fueron detectadas por:

Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria: sílica gel G-60, fase móvil: Tolueno: éter (1:1, saturado con ácido acético al 10%), revelador:a luz UV 365 nm. Las lactonas terpenicas fueron identificadas por. Cromatografía de capa delgada (TLC), fase estacionaria: sílica gel G-60, fase móvil: CHCl -3 acetona (90:10), revelador: vainillina al 1% en ácido sulfúrico al 5%.

Resultados y discusión

Los análisis de parámetros de calidad nos mostró que las hojas de Vismia ferruginea, cuentan con un porcentaje de humedad del 98.48%, de cenizas un 99.73 % y 1782.2423 p.p.m de sólidos totales.

La determinación del contenido de humedad indico la cantidad de agua involucrada en la composición de los mismos. El contenido de humedad se expresa generalmente como porcentaje, las cifras varían entre 60-99% en los productos naturales. En los tejidos vegetales y animales existe dos formas generales: agua libre y agua ligada, como soluto o como solvente; en forma libre, formando hidratos o como agua adsorbida. La determinación de humedad se realizo por la determinación de la pérdida de masa que sufre cuando se somete a una combinación tiempo ² temperatura adecuada. El residuo que se obtuvo se conoce como sólidos totales o materia seca.

Las cenizas son un término analítico equivalente al residuo inorgánico que queda después de quemar la materia orgánica; representan el contenido mineral, es decir el conjunto de nutrientes elementales que están presentes en determinada muestra. El análisis de las cenizas se llevo a cabo por incineración total de la muestra a temperaturas elevadas y la por determinación de su masa (HULME, A. 1971).

Los resultados para las pruebas de detección rápida de algunos metabolitos secundarios indicaron presencia de algunos de ellos (tabla 1) los cuales fueron confirmados por cromatografías de capa delgada, los cuales se muestran en la tabla 2.

Tabla 1. Análisis Fitoquímico del extracto etanolico de hojas de Vismia ferruginea

Para la prueba de carbohidratos reductores, el resultado positivo nos indica que la planta deja libre un grupo aldehído (maltosa y lactosa) (Thacker, J. 2002), las pruebas de precipitación y coloración indicaron la presencia de cetosas (fructosas) al evidenciar un color rojo cereza, en el caso de azucares no reductores, el resultado negativo nos indica que no tienen un grupo aldehído libre (sacarosa).

La prueba de Saponinas nos arrogo un resultado negativo, indicando que la planta no usa este metabolito para defensa en las hojas, sin embargo no asegura que no la presente ya que puede encontrarse en otras partes como lo es la semilla, la corteza o el tallo (Hostettman, K., Marston, A. 1995).

El resultado fue positivo para la prueba de polifenoles, y la coloración azul intensa indico fenoles en alta cantidad, lo cual se puede deber a que estos compuestos están íntimamente relacionados con la actividad de repelencia por las plantas a poblaciones de insectos, (Álvarez V. 2010) y al ser las hojas el

blanco más común, es lógico que estos metabolitos sean empleados en defensa química.

La prueba positiva para presencia de taninos condensados indica, que estos compuestos son utilizados en la defensa química ya que gracias a su capacidad de precipitar proteínas, podrían servir como antinutricionales ante el ataque de predadores.

Esta acción estaría relacionada con la impalatabilidad que provocan los taninos como también la disminución de la digestibilidad de las proteínas dietarías (Álvarez 2010). Los taninos encontrados fueron de tipo catecol.

Tabla Nº 2: Pruebas cromatograficas para identificación de metabolitos químicos principales del

extracto alcohólico de hojas de V. ferruginea

La presencia de flavonoides fue positiva para el extracto, una coloración rojo cereza indico flavonoides de tipo dihidroflavonoles, precursores directos de flavandioles y flavonoles, lo que indica que son usados por la planta como mecanismos de defensa, y atracción de polinizadoresen algunas plantas.

La presencia de fenilpropanoides se debe a que estos compuestos participan en la defensa química de la planta, no previniendo el ataque sino resistiéndolo, se generan al ser las hojas atacadas por virus o bacterias en las heridas que dejan los predadores.

La prueba de Iridoides fue negativa, tal vez porque la V. ferruginea presenta otro tipo de compuestos que actúan como agentes tóxicos contra agentes fitopatogenos, como hongos y bacterias.

Al no poseer iridoides, los fenilpropanoides que si están presentes (en las hojas) en V. ferruginea, cumplen la función de defensa química.

En cuanto a las pruebas para esteroides y terpenos, las diferentes reacciones de precipitación y coloración evidenciaron la presencia de esteroides, formación de una interfase distinguió los carotenoides de otros pigmentos, resultados que fueron confirmados por cromatografía (Tabla Nº 3) los cuales no fueron del todo específicos ya que las manchas solo nos indica presencia o no de estos compuestos pero no que tipo de terpeno y/o esteroides

Las pruebas hechas para la detección de alcaloides arrojaron resultados negativos); lo cual puede deberse a la distribución basipetala de los metabolitos secundarios en el género Lantana (Weckerle et al. 2004). Estas pruebas fueron concluyentes, evidenciado por los reactivos de Drangerdoff y Mayer, pruebas cuya coloración nos mostro una concentración poco significativa de alcaloides en el extracto etanolico de hojas de V. ferruginea.

La presencia de Cardiotónicos fue positiva para algunas pruebas de coloración, evidenciando presencia de de cardenolios y el núcleo esferoidal, confirmada con la cromatografía, siendo los cardiotónicos los encargados de conferir a la planta un potencial medicinal como agente anticancerígeno y según Tamargo 1971 los mismos son fármacos que potencian la fuerza de contracción del corazón.

Las cumarinas están relacionadas con la defensa química de la planta ya que presenta efectos antibacterianos, sedantes y analgésicos (Álvarez V. 2010), que podrían ser útiles para repeler insectos, este no es el metabolito usado por la planta estudiada ya que las pruebas fueron negativas.

Conclusiones

Con el objetivo de realizar la identificación de los principales metabolitos secundarios en Vismia ferruginea o Punta de Lanza, se inicio este estudio y con los resultados obtenidos, la primera conclusión es que se deben hacer pruebas de actividad biológica, más precisamente actividad antioxidante debido a la

presencia de Polifenoles y Flavonoides. La presencia de terpenos simplemente nos indica los terpenos de cadena más larga y se hace necesario realizar pruebas sobre monoterpenos e isopreno, debido a la contribución de los mismos en la formación de ozono troposférico y todos los problemas que esto acarrea.

Aunque algunas pruebas arrojaron resultados negativos se necesitan hacer más estudios sobre otras partes de la planta como semilla, flor y fruto, donde la composición de metabolitos secundarios puede ser distinta.

Es muy probable que en otros órganos de Vismia ferruginea hallemos cumarinas, que no fueron encontradas en el presente estudio, pero la literatura del genero Vismia reporta que son características del mismo.

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Autor:

Karen Gonzalez Lozano

21 años

Estudiante de biología

Fecha de realización 2 de mayo de 2010

Categoría: fitoquimica

Tatiana Toro Sanchez

22 años

Estudiante de biología