La utilización de los antimicrobianos en la terapéutica de las enfermedades infecciosas, se hacen cuando se ha efectuado el diagnóstico clínico bacteriológico y se plantea la necesidad de saber cual es el antibiótico que debe utilizarse para eliminar al microorganismo que esta provocando la infección, además, algunas veces el médico necesita conocer:
- La susceptibilidad entre el microorganismo "in vitro".
- La relación de susceptibilidad entre el microorganismo y otras bacterias de la misma especie.
- Las propiedades farmacológicas de los antibióticos incluyendo toxicidad, absorción, metabolismo, vida media, distribución y excreción.
- Experiencia clínica previa de la eficiencia del antimicrobiano en el tratamiento de infecciones similares debida a la misma especie.
- La historia natural del proceso patológico.
- El estado inmune del Hospedero.
El patrón de referencia para conocer la susceptibilidad a los antibióticos es en la que se mide la concentración inhibitoria mínima (MIC) de un antibiótico, o sea la concentración más pequeña en la que se inhibe el crecimiento de las bacterias in vitro. Los cálculos de los fármacos a prueba se pueden realizar tanto en caldo como en agar y los resultados son similares. Un estudio semejante de la MIC sería la concentración bactericida mínima (MBC), que representa la concentración más pequeña de un antibiótico que destruye a la bacteria. El pronostico clínico de infecciones graves depende en gran parte de que el antibiótico sea bactericida (destruye al microorganismo) o bacteriostático (inhibe su proliferación sin destruirlo), estos factores no guardan relación directa con la susceptibilidad y la resistencia.
La prueba de susceptibilidad en agar (antibiograma) fue creada para estimar la MIC y esta valorada por métodos estandarizados y consiste en la difusión de los antibióticos desde un disco a medios en los que se le ha inoculado una suspensión estandarizada de bacterias. bv
El diámetro obtenido de la zona de inhibición que se presenta alrededor del disco se correlaciona con los valores de MIC estándar, y permite la extrapolación de los datos de este método sencillo a la medición de MIC en dilución en caldo que es un método más complejo. La técnica de difusión en disco, aunque estandarizada, puede sufrir alteración por varios factores, principalmente por la velocidad de proliferación bacteriana y la composición de los medios de cultivo, y de esta forma, no es absolutamente confiable para evaluar a todos los microorganismos. Existe un método estandarizado que nos informa de las fracciones de microorganismos en diferentes grados, como susceptible, intermedio o resistente que se basa en la correlación entre la difusión en disco y la MIC, y los niveles séricos máximos que pueden alcanzarse con un antibiótico en particular. 1
LIMITACIONES DEL MÉTODO.
La prueba de Bauer-Kirby, ha sido aceptada como la técnica estándar para la realización de las pruebas de sensibilidad por difusión con discos, y en la mayoría de los casos brinda información útil. Hay, sin embargo, unas pocas limitaciones distintivas. La prueba sólo debiera aplicarse a especies bacterianas que han sido cuidadosamente evaluadas. Las bacterias que crecen con lentitud, las que necesitan nutrientes especiales, o las que requieren CO2 o condiciones anaerobias para su desarrollo no deben probarse, a menos que la validez del procedimiento haya sido comprobada.5
Un método que utiliza una combinación de las dos técnicas descritas es la prueba, que se basa en que una tira de papel impregnada con un antibiótico que se difunde contra el gradiente de concentración en el medio bacteriano inoculado, de manera muy similar a lo que ocurre en la técnica de difusión en disco, sin embargo, en vez de medirse el diámetro del disco, la zona de inhibición es elíptica y cruza la tira en los valores de la concentración inhibitoria mínima. Esta técnica no evita que eventuales problemas con los medios de cultivo o con la velocidad de crecimiento, pero mejora la posibilidad de correlacionar la anchura de la franja o zona, con la concentración inhibitoria mínima.2
Existen otras pruebas muy especializadas que se pueden llevar a cabo en muchos laboratorios, como son la de identificación de los mecanismos de resistencia a los antibióticos por medio de métodos bioquímicos para inactivar enzimas, como la b -lactamasa y la cloranfenicol acetiltransferasa.1 o por sondas genéticas, para la identificación de DNA que codifican la resistencia, como las enzimas inactivadoras de aminoglucosidos1 Por desgracia aunque estos métodos son muy satisfactorios para identificar microorganismos resistentes, no lo son en absoluto para medir su susceptibilidad.
SISTEMAS DISPONIBLES EN EL COMERCIO.
En el comercio hay múltiples sistemas semiautomáticos para la realización de pruebas de sensibilidad antimicrobiana. El mayor mercado lo comparten dos productos:Vitek (bioMérieux, Hazelwood, MO) y MicroScan (Dade International, West Sacramento, CA).
El instrumento Vitek utiliza un análisis computarizado del crecimiento en tarjetas plásticas para calcular la CIM. En algunos casos el cálculo de éste depende de la identificación bacteriana. La precisión adicional proporcionada por la correlación, manejada por la computadora, del patrón de crecimiento y la identificación está contrabalanceada por la falta de certeza acerca de los resultados de sensibilidad, si la identificación aún no se conoce o no puede ser proporcionada por el sistema con la certeza adecuada
Los productos MicroScan se basan en la metodología CIM tradicional.5
PRINCIPALES MECANISMOS EN LA RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS.
Mecanismos de actividad antibiótica.
Los principales mecanismos se pueden agrupar de la siguiente manera. Para destruir bacterias, los antibióticos deben penetrar por la pared de éstas sin que sean metabolizados intrínsecamente, y actuar en el "blanco". De este modo, para conocer los mecanismos de resistencia es de suma importancia entender la forma en que actúa cada clase de antibióticos. Prácticamente todos los agentes antimicrobianos obstaculizan funciones críticas dentro de la bacteria6. Varias actividades bioquímicas son especialmente vulnerables a la interferencia por los antibióticos, por ejemplo, la síntesis de la pared celular bacteriana y la función de sus membranas, la síntesis de proteínas, el metabolismo de ácidos nucleicos y las vías metabólicas intermedias.
Disminución de la permeabilidad hacia el antibiótico.
- Inactivación del antibiótico.
- Modificación química del blanco sobre la que actúa el antibiótico.
- Síntesis de una enzima resistente.7
- Enzimas que inactivan a los antibióticos.
El mecanismo de resistencia más común a los antibióticos es su inactivación por mecanismos enzimáticos. Algunas enzimas inactivadoras de fármacos quizá fueron formadas para evitar el "suicidio" por especies productoras de antibióticos. Transferidas a otra especie, los genes de tales enzimas inactivadoras ocasionan resistencia a los antibióticos. Los ejemplos clásicos de enzimas con tales propiedades son las b -lactamasas, las modificadoras de aminoglucósidos y la cloranfenicol acetiltransferasa.
Las b -lactamasas hidrolizan el anillo b -lactámico de las penicilinas y las cefalosporinas, y lo transforman en el derivado inactivo ácido peniciloico. Los grampositivos y los gramnegativos producen b -lactamasas. Las de los grampositivos son más activas contra penicilinas y en menor grado contra las cefalosporinas. Por la estructura simple de la pared bacteriana que caracteriza a los grampositivos, las b -lactamasas de grampositivos son enzimas inducibles secretadas al entorno, las de las gramnegativos son mucho más heterogéneas y pueden ser constitutivas o inducibles. La estructura parietal más compleja de los microorganismos gramnegativos, con una membrana interna y otra externa, permite la síntesis de b -lactamasas dentro del citoplasma y su excreción al espacio periplásmico. Por el mecanismo mencionado, los gramnegativos, en forma constitutiva, producen cantidades relativamente pequeñas de enzima, que impiden el acceso de los antibióticos b -láctamicos activos, a los "blancos" presentes en la membrana, que son las Proteínas Ligadoras de Penicilina (PBP).1
Como sabemos, los ß-lactámicos forman complejos covalentes estables con algunas de las PBPs (peniciloil-PBPs), que hacen que estas autolisinas se inactiven. Pues bien, existen indicios de que las ß-lactamasas serían unas "autolisinas" evolucionadas que en vez de formar complejos estables con los ß-lactámicos, se habrían especializado en cortar el anillo lactamico (dando ácido peniciloico) a expensas de su actividad transpeptidasa original.7
¿DE DONDE SE ORIGINAN LAS BETA-LACTAMASAS?
Aunque la prevalencia de cepas (sobre todo patógenas) resistentes a ß-lactámicos es un fenómeno que se "disparó" desde los años 50 con el uso masivo de estos antibióticos, está claro que la resistencia debía de existir previamente al uso humano de los antibióticos. La aplicación clínica a gran escala (incluyendo el abuso) de las penicilinas y cefalosporinas sólo ha permitido que veamos en acción un caso "acelerado" de evolución bacteriana, donde las cepas más aptas han sobrevivido y se han multiplicado, y en el que, merced a los procesos de intercambio genético y a la construcción "modular" (transposones) de muchos plásmidos R, las entidades genéticas responsables se han diseminado de unas especies bacterianas a otras. Se supone que en la naturaleza como en los suelos, ciertas cepas bacterianas, antes de la aparición de la quimioterapia, poseían ya mecanismos para destruir los ß-lactámicos segregados por hongos con los que coexistían.
Profundizando más en el tema, parece que las propias ß-lactamasas proceden evolutivamente (por mutaciones sucesivas) de alguno de los genes que originalmente codificaban algunas de las "autolisinas" (PBPs) que intervienen en la maduración del peptidoglucano. Es decir, las ß-lactamasas serían formas modificadas de los mismos blancos (por ejemplo las transpeptidasas) sobre las que actúan los ß-lactámicos.
Como sabemos, los ß-lactámicos forman complejos covalentes estables con algunas de las PBPs (peniciloil-PBPs), que hacen que estas autolisinas se inactiven. Pues bien, existen indicios de que las ß-lactamasas serían unas "autolisinas" evolucionadas que en vez de formar complejos estables con los ß-lactámicos, se habrían especializado en cortar el anillo lactámico (dando peniciloico) a expensas de su actividad transpeptidasa original.7
INACTIVACIÓN ENZIMATICA DEL ANTIBIÓTICO.
Las enzimas que modifican aminoglucósidos constituyen el mecanismo primario de resistencia adquirida a tales fármacos en grampositivos y gramnegativos. Las tres clases principales de dichas enzimas son las acetiltransferasas, las fosfotransferasas y las adeniltransferasas. Cada una modifica al aminoglucósido por transferencia del grupo químico indicado por ejemplo, un acetilo, un fosforilo o un adenilo a la cadena lateral especifica. La nomenclatura se basa en el grupo químico desplazado y el sitio al cual es transferido. Por ejemplo, la enzima que fosforila el grupo 3’-fosfotransferasa (APH [3’]) Se conocen innumerables subgrupos de enzimas que sirven como sustratos a los aminoglucósidos; se les designa con números romanos. Al parecer, la modificación de los aminoglucósidos no inactiva el fármaco a nivel extracelular, sino que, más bien, disminuye el transporte o la modificación del medicamento durante la fase de transporte con menor unión a ribosomas.
DISMINUCIÓN DEL ACCESO DE LOS ANTIBIÓTICOS.
El acceso de los antibióticos a sus "blancos" intracelulares es un factor importante para valorar la susceptibilidad de los microorganismos a ellos. (figura 1) Muchos gramnegativos son "intrínsecamente" resistentes a clases amplias de antibióticos, por su complicada estructura de membrana, que no permite la penetración de los fármacos; por lo contrario, los estreptococos y los enterococos son resistentes a los aminoglucosidos, por la poca permeabilidad de su pared. Los principales mecanismos primarios de disminución del acceso de los antibióticos a las bacterias son una menor permeabilidad de la membrana externa, salida activa del fármaco y "atrapamiento" del antibiótico. La menor permeabilidad de la membrana externa de los gramnegativos es un mecanismo común de resistencia a múltiples antibióticos, dicha membrana es una bicapa de lípidos asimétrica, compuesta de lipopolisacáridos (LPS) en la "hojilla" externa, y fosfolípidos en la interna. En la bicapa están intercaladas proteínas transmembrana, como las porinas, que forman conductos llenos de agua a través de la membrana externa. Los antibióticos hidrófobos, como la tetraciclina, penetran en la bacteria por difusión a través de la bicapa lípida, en tanto que los hidrófilos, incluidos los b -lactámicos, algunas quinolonas y los aminoglucósidos, utilizan conductos de porina para penetrar por el espació periplásmico.9
Otro mecanismo de captación referente a los aminoglucósidos es la llamada vía "autopromovida" presente en P. Aeruginosa: los aminoglucósidos desplazan los cationes divalentes que estabilizan la interacción de los lipopolisacáridos y las porinas en la hojuela externa de la membrana externa, y asi permiten la penetración de los fármacos. Los cambios en la cantidad, la estructura y la función de las porinas y los LPS pueden ocasionar resistencia a b -lactámicos, tetraciclina, quinolonas y cloranfenicol, como resultados de una disminución de número de poros o de su diámetro en los conductos de porina transmembrana.1
Figura 1. – MECANISMOS DE RESISTENCIA A LOS ANTIBIÓTICOS b -lactamicos .
INTERES CLÍNICO DE LA RESISTENCIA BACTERIANA.
La base genética de la resistencia guarda relación íntima con los mecanismos bioquímicos de este fenómeno, y es importante para precisar la rapidez con que puede surgir la resistencia a los antibióticos en una población bacteriana. Un ejemplo es la resistencia mediada por plásmidos más a menudo es consecuencia de la síntesis de una enzima inactivadora de antibióticos, y está muy extendida tanto dentro de cada especie en particular como entre organismos afines. La resistencia puede ser mediada por cromosomas o plásmidos; en el primer caso puede deberse a una mutación genética o un cambio en la regulación genética.8
La síntesis de quimioterápicos artificiales y el descubrimiento y mejora de los antibióticos han supuesto en este siglo una auténtica revolución médica en el tratamiento de enfermedades infecciosas. Sin embargo, la extrema versatilidad y adaptabilidad de los microorganismos ha impedido que la victoria humana sobre las bacterias patógenas haya sido total: muchas bacterias han ido desarrollando en los últimos decenios mecanismos que las protegen frente a muchos fármacos.
De hecho, desde la introducción de la antibioterapia en todo el mundo, estamos realizando un gigantesco "experimento" de intervención genética en los seres vivos más abundantes del planeta: Las bacterias. Estamos "sufriendo" la verdad de la supervivencia darwiniana de los más aptos, ya que la presión selectiva que representa la aplicación a gran escala de los quimioterápicos ha permitido la diseminación de cepas microbianas con mecanismos de resistencia que, en muchas ocasiones dificultan el adecuado tratamiento clínico.7
Los mecanismos de resistencia bacteriana son muy variados. No se han descrito mecanismos especie-específicos, ni exclusivos contra un tipo particular de antibiótico. Es importante resaltar que, en muchos casos, la resistencia es mediada por elementos genéticos móviles (plásmidos y transposones), que pueden diseminarla entre diferentes géneros bacterianos. En este caso el problema se vuelve critico, porque generalmente estos elementos llevan determinantes multirresistentes. No es esta la única manera en que la presión selectiva, durante la administración de un tipo de antimicrobiano, genera resistencia.6
- Jane J. Burns. M D Mecanismos de Resistencia Bacteriana, Clínicas Pediátricas de Norteamérica, Volumen 3/1995 Pág. 463-470
- Patrich, R. Murria, Kobayashi, G. S., Pfaller, M. A. Rosenthal, K. S. Microbiología Médica, segunda edición, Editorial Harcourt-Brace, 1997, Pág. 123-127
- Jorge Ortigoza Ferado, Cesar H. Hernández Rodríguez, Microbiología Practica, Esc. Nal. De Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, México, D.F. Pág. 146
- Joel G. Hardman, Lee E. Lumbird, Perry B. Molinoff, Raymond W. Ruddon, Alfred Goodman Gilman, Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica, Ed. Mc Graw-Hill Interamericana, 9ª edición, Vol. II México, 1996 Pág. 1066, 1091
- Koneman, E. Stephen, D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberg, Washington C. Winn, Diagnostico Microbiologico, Texto y Atlas color. Ed. Medica Panamericana, 5a edición, Buenos Aires Arg. 1999. Págs. 800-805
- Elsa Garcia, C. Ramos, Silvia Giono Cerezo, Bacteriología Medica Diagnostica, Instituto Politécnico Nacional, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, departamento de Microbiología. México 1993
- www.insp.mx/salud/36/364-7 s html-En cache
- www.microbiologia.com.or/antimicrobianos/anti.resistencia.html
- www.insc.es/salud/epidemiologia/resp/resist
. MARIO ALBERTO ORTIZ
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