Comparación de dos vías de inoculación en la producción de anticuerpos contra fructosa 1,6-bisfosfatasa en huevos de gallina

(*) Este trabajo fue financiado, en parte, por el proyecto FONDECYT 1010720 y por la Dirección de Investigación, Universidad Austral de Chile, DID-UACH 200302.

• Material y métodos
• Resultados
• Discusión
• Bibliografía

Summary: The present study compares the intramuscular (IM) and subcutaneous (SC) inoculation routes for antibody production in hens. Six laying Leghorn hens were separated in two identical inoculation groups and immunized with purified Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) from pig kidney extract. The hens were inoculated at two and four week intervals with an emulsified mixture of purified FBPase and Freund’s complete adjuvant (first inoculation) and Freund’s incomplete adjuvant (second and third inoculations). The egg yolk antibodies were purified and titrated with immune dot blot. High amounts of antibody were produced by both hen groups and the titers were comparable. However, in each inoculation group we found some differences which we attributed to individual variations. These results show that both routes of inoculation (SC and IM) are equally effective in generating hen antibodies against a cytosolic enzyme. Moreover, the immune-blot analysis revealed that the antibodies anti-FBPase obtained from intramuscular and subcutaneous inoculations recognized the enzyme in rat liver extract containing much more than 50 different proteins. These results demonstrated that the antibodies produced by these two routes of inoculation are highly specific.

Key words: antibodies, hen’s eggs, FBPase.

Resumen: El presente estudio comparó las vías de inoculación intramuscular (IM) y subcutánea (SC) para la producción de anticuerpos en gallinas. Seis gallinas Leghorn de postura fueron separadas en dos grupos de inoculación idénticos e inmunizadas con fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa) purificada de riñón de cerdo. Las gallinas fueron inoculadas con un intervalo de 2 y 4 semanas, con una emulsión mezclada con FBPasa purificada y adyuvante de Freund completo (primera inoculación) y adyuvante de Freund incompleto (segunda y tercera inoculación). Los anticuerpos obtenidos desde yema de huevo fueron purificados y titulados por ensayo en gota. Elevadas cantidades de anticuerpo fueron producidas por ambos grupos de gallinas y los títulos fueron comparables. Sin embargo, en cada grupo de inoculación se encontraron algunas diferencias atribuibles a variaciones individuales. Los resultados muestran que ambas vías de inmunización (SC e IM) son igualmente efectivas en la generación de anticuerpos desde gallinas contra enzimas citosólicas. Además, el análisis mediante inmunodetección reveló que los anticuerpos anti- FBPasa obtenidos por inoculación intramuscular y subcutánea, reconocieron a la enzima en extractos de hígado de rata, los cuales contenían más de 50 diferentes proteínas. Estos resultados demostraron que los anticuerpos producidos por estas dos vías de inoculación son altamente específicos.

Palabras claves: anticuerpos, huevos de gallina, FBPasa.

INTRODUCCIÓN

En gallinas, se ha demostrado la existencia de tres clases de inmunoglobulinas análogas a la de mamíferos: IgA, IgM e IgG (Carlander, 2002). Sin embargo, al comparar la estructura de la inmunoglobulina G aviar y mamífera se observan diferencias en la masa molecular, siendo de 200 kDa en las aves y de 160 kDa en los mamíferos (Tizard, 1982). Por otra parte, la inmunoglobulina G aviar posee gran similitud en su secuencia de ADN con la IgE humana (Shimizu y col., 1992). Estas características permiten que ambas IgG no presenten reacción cruzada (Frendscho, 1994). Producto de estas diferencias la inmunoglobulina IgG aviar fue denominada IgY (Camenish y col., 1999).

Debido a la distancia filogenética entre aves y mamíferos, las gallinas producen anticuerpos más específicos contra antígenos mamíferos que los mismos mamíferos (Li y col., 1998). Además, los anticuerpos IgY resultan adecuados para ensayos inmunológicos pues disminuyen los falsos positivos, al no interactuar con las IgG de mamíferos, con el factor reumatoide o con los receptores de fijación del complemento de los mamíferos (Montes y col., 1994). La IgY es transportada desde el suero del ave a la yema del huevo, lo cual permite transferir los anticuerpos maternos a la descendencia y posibilita, de esta manera, la adquisición de inmunidad pasiva en los polluelos. La concentración de IgY en el suero de la gallina es de aproximadamente 5-7 mg/ml (Carlander, 2002), en tanto la concentración de IgY en la yema del huevo es de 15 mg/ml, con variaciones entre 8 y 25 mg/ml (Sunwoo y col., 2002; Rose y col., 1974). Por lo tanto, una yema de huevo de un volumen aproximado de 15 ml contiene más de 100 mg de IgY (Carlander y col., 2002; Larsson y col., 1993). Luego, desde una gallina en postura que produce aproximadamente 20 huevos por mes, se podrían aislar desde la yema más de 2 gramos de IgY (Carlander, 2002), cantidad comparable con la producción de grandes mamíferos, como equinos y bovinos (Tizard, 1982). Además, la obtención de anticuerpos a partir de la yema de huevo no representa un procedimiento invasivo, como el sangrado en conejos, evitando de esta manera el estrés y el sufrimiento animal (Broderson, 1989).

Los anticuerpos obtenidos de yema de huevo de gallina, tienen diversas aplicaciones, entre ellas se destaca su empleo en inmunoterapia oral. Larsson y col. (1993) demostraron los efectos positivos de incluir IgY contra Staphylococcus aureus y Streptococcus agilata en el alimento de vacas de lechería. Este tratamiento produjo una importante reducción en las células somáticas, disminuyendo los costos en el tratamiento de la mastitis (Coleman, 1996). Además, otros investigadores han demostrado que anticuerpos obtenidos de gallinas inmunizadas con E. coli enterotoxigénica pueden detener, en 24 horas, la diarrea en lechones (Marquardt y col., 1999). Otra característica importante de la inmunoglobulina IgY, que permite su administración vía oral, es su alto grado de estabilidad ante variaciones de temperatura y pH. La IgY es particularmente resistente al proceso de pasteurización a un pH mayor de 4 (Shimizu y col., 1988). Por esta razón, se ha propuesto su uso en terapia oral en pacientes con fibrosis quística, cáncer (Yang y col., 1997; Carlander y col., 1999), inmunodeprimidos (Coleman, 1999), y como antisuero en casos de mordeduras de arañas o serpientes (Thalley y Carroll, 1990).

En la literatura se ha informado de diferentes métodos para la obtención de anticuerpos desde huevos de gallina (Carlander, 2002). Para evaluar la respuesta humoral en gallinas se han utilizados las vías de inoculación subcutánea (Chung-seog y col., 1985; Frendscho, 1994), intramuscular (Camenisch y col., 1999; Orsini y col., 2001; Sunwoo y col., 2002; Akita y Nakai, 1992) y endovenosa (Patterson y col., 1962; Gutiérrez y col., 2001). Utilizando el mismo antígeno se comparó la producción de anticuerpos a través de las vías de administración intramuscular y endovenosa, encontrándose diferencias significativas (Gutiérrez y col., 2001). Sin embargo, no hay estudios comparativos de la producción de anticuerpos inmunizando a través de las vías intramuscular y subcutánea. Por lo tanto, en el presente trabajo se compararon dos vías de inoculación (intramuscular y subcutánea), para la obtención de anticuerpos policlonales en gallina. El antígeno utilizado fue la Fructosa-1,6- bisfosfatasa de riñón de cerdo, enzima tetramérica encargada de catalizar uno de los pasos irreversibles de la gluconeogenesis, la conversión de fructosa-1,6-bisfosfato a fructosa- 6-fosfato (Van Schaftingen, 1987).