Comparación de dos vías de inoculación en la producción de anticuerpos contra fructosa 1,6-bisfosfatasa en huevos de gallina (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Materiales. En el estudio se utilizaron 6 gallinas de raza Leghorn de un año de edad en producción. Como antígeno se utilizó Fructosa- 1,6-bisfosfatasa de riñón de cerdo (FBPasa). Los reactivos utilizados para ensayo en gota, inmunodetección y electroforesis en geles de poliacrilamida fueron adquiridos en BIORAD®.

Purificación de FBPasa. A partir de riñones de cerdo recién sacrificados, siguiendo el procedimiento descrito por Colombo y col. (1972), modificado por Reyes y col. (1987), se purificó FBPasa a homogeneidad. Este proceso se basó en tres etapas consecutivas de precipitación con pH, calor y sulfato de amonio, luego de las cuales se realizó una cromatografía de afinidad en Cibacron blue ® (sefarosa azul). El sedimento obtenido en la precipitación con sulfato de amonio se resuspendió y dializó contra una solución de Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, EDTA 0.1 mM. La solución de proteínas se aplicó en una columna de vidrio de 4 x 15 cm con aproximadamente 150 ml de la resina sefarosa azul equilibrada en el mismo tampón. Una vez aplicada la muestra, se lavó la columna con la solución de equilibrio y la FBPasa se eluyó específicamente con 300 ml de una solución de adenosina monofosfato (AMP) 0.2 mM en Tris- HCl 20mM, pH 7.5, EDTA 0,1 mM, colectándose fracciones de 8 ml, a un flujo de 2 ml/min. Las fracciones con enzima se detectaron midiendo la absorbancia a 280 nm y la actividad bifosfatásica (Saéz y col., 1996). Aquellas fracciones con actividad mayor a 20 unidades/ml fueron reunidas y concentradas por precipitación con sulfato de amonio al 90% de saturación. Después de centrifugar a 10.000 x g, el sedimento se resuspendió y se dializó por 24 horas con tres cambios de 1 litro de una solución de Tris-HCl 20mM, pH 7.5, EDTA 0.1 mM. La enzima purificada presentó una actividad específica de 40 unidades por miligramo de proteína. Para determinar el grado de pureza de la FBPasa, 1 µg de la proteína purificada se separó en un gel de poliacrilamida al 12% en condiciones desnaturantes (Laemmli, 1970). Su movilidad electroforética fue comparada con una mezcla de marcadores de peso molecular (Winkler®), que contenía las siguientes proteínas: ß-galactosidasa, 116.000; albúmina, 66.000; ovoalbúmina, 45.000; lactato deshidrogenasa, 35.000; endonucleasa de restricción Bsp981, 25.000; ß-lactoglobulina, 18.400 y lisozima, 14.400 g/ mol.

Inmunización. Utilizando 0.2 mg de FBPasa resuspendida en 0.5 ml de PBS (NaCl 150 mM, Na2HPO4 10 mM, pH 7.5), se preparó una emulsión con un volumen de 0.5 ml de adyuvante completo de Freund para la primera inmunización y de 0.5 ml de adyuvante incompleto de Freund en la segunda y tercera inmunizaciones, las cuales se realizaron con un intervalo de 2 semanas (entre la 1ª y 2ª inmunización) y de 4 semanas (entre la 2ª y 3ª inmunización) (esquema 1). Con un volumen final de 1 ml, tres gallinas fueron inmunizadas por vía intramuscular (gallinas Nº 1, 2 y 3) y tres por vía subcutánea (gallinas Nº 4, 5 y 6). La recolección de huevos y purificación de anticuerpos se realizó periódicamente antes y después de cada inmunización. El daño ocasionado por la inmunización en las gallinas se determinó mediante necropsias.

ESQUEMA I: Diagrama de las inoculaciones con FBPasa. AFC: Adyuvante de Freund Completo. AFI: Adyuvante de Freund Incompleto. Diagram of FBPase inoculation. AFC: Complete Freund’s Adjuvant. AFI: Incomplete Freund’s Adjuvant.

Purificación de los anticuerpos. Se utilizaron huevos desde el día 12 post-inmunización hasta los colectados un día antes del sacrificio de las aves. La purificación se realizaba con 2 yemas y el volumen final variaba dependiendo del tamaño del huevo. Las proteínas hidrosolubles de la yema fueron precipitadas con sulfato de amonio en un 65% de saturación. Luego de centrifugar las muestras a 20.000 g por 15 minutos, el precipitado fue resuspendido en 10 ml de Tris- HCl 20 mM, pH 7.5, EDTA 0.1 mM, posteriormente dializado y guardado a -20 ºC (Akita y Nakai, 1993).

Titulación de anticuerpos. Se realizó mediante el método de ensayo en gota (dot blot) descrito por Gershoni y Palade (1983). Para estimar el título, varias tiras de nitrocelulosa fueron sembradas con 20 ng de FBPasa y luego incubadas con distintas diluciones (1:1.000, 1:10.000, 1:20.000, 1:40.000, 1:50.000, 1:60.000) del anticuerpo IgY purificado, el cual fue inmunodetectado con anticuerpo secundario de cabra anti-IgY de gallina acoplado a peroxidasa (Aves Labs, Inc). Para revelar la actividad del conjugado, el papel de nitrocelulosa se incubó por 5 minutos en una solución de diaminobencidina (DAB) 0.5 mg/ml, H2O2 0,15% (v/v), Tween-20 0.3% (v/v) en PBS. Para, determinar de forma más precisa el título de los anticuerpos inducidos, la marca debida a la precipitación de DAB en los dot blots, fue digitalizada y analizada. Para ello, se utilizó el programa computacional "UNSCANIT" (Silk Scientific Corporation), con el cual se determinó él número de pixeles presentes en cada marca de la nitrocelulosa. Se utilizó como única dilución, 1:10.000, de los anticuerpos obtenidos días anteriores y posteriores a cada inmunización. El análisis final se obtuvo de forma similar, utilizando dos diluciones (1:10.000 y 1:20.000) de los anticuerpos obtenidos una semana después de la 3ª inmunización. Como control de la reacción para cada anticuerpo se realizó un experimento donde no se adicionó el anticuerpo primario.

Determinación de especificidad de los anticuerpos mediante ensayo en gota (Dot blot). En una tira rectangular de nitrocelulosa se sembraron 100 ng de tres proteínas diferentes (FBPasa, aldolasa A y aldolasa B). Posteriormente, la tira de nitrocelulosa se incubó en una dilución 1:1.000 del anticuerpo IgY purificado y este fue inmunodetectado con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgY de gallina acoplado a peroxidasa. Para revelar la actividad del conjugado, el papel de nitrocelulosa se mantuvo 5 minutos en una solución de diaminobencidina 0,5 mg/ml, H2O2 0.15% (v/v), Tween-20 0.3% (v/v) en PBS. La presencia de reacción fue estimada de acuerdo a la intensidad de la marca ocasionada por la precipitación de DAB.

Determinación de especificidad de los anticuerpos mediante Inmunodetección (Western blot). Un extracto de proteínas totales de hígado de rata fue sometido a electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS en condiciones desnaturantes, de acuerdo al método descrito por Laemmli (1970). Posteriormente, las proteínas presentes en el gel de poliacrilamida fueron electrotransferidas a una membrana de nitrocelulosa, la cual fue sometida a inmunodetección de acuerdo al método descrito por Tsang y col. (1983). La membrana fue bloqueada con solución de PBS-tween-leche (Na2HPO4 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5, Tween-20 0.3% (v/v) y leche descremada 5% (p/v)) a 30 °C por 30 minutos. Posteriormente fue incubada con una dilución 1:1.000 del anticuerpo IgY purificado, el cual fue inmunodetectado con anticuerpo secundario de cabra anti-IgY de gallina acoplado a peroxidasa. El revelado se llevó a cabo de la misma manera que en el ensayo en gota. La presencia de reacción fue estimada de acuerdo a la intensidad de la marca debida a la precipitación de DAB.

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de "t de Student" para muestras pareadas mediante el programa computacional "graph Pad Instat" (Graph Pad Software), considerando un nivel de significancia de p<0.05. Los datos analizados correspondieron a la cantidad de pixeles obtenidos por dot blot en títulos de 1:10.000 y 1:20.000 de los anticuerpos purificados.

RESULTADOS

Purificación de FBPasa. El análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturantes mostró que la enzima se encontraba en un alto grado de pureza. Se determinó la existencia de una banda única de proteína correspondiente a la FBPasa. Al comparar los píxeles de esta banda con los píxeles del fondo del carril se determinó que aproximadamente la FBPasa se encontraba en un 99% pura. Utilizando un marcador de proteínas de rango amplio y tinción con azul de Coomasie, se determinó que la proteína purificada poseía una masa de 36 kDa correspondiente al monómero de FBPasa (figura 1 A). 

FIGURA 1. Determinación de la especificidad de los anticuerpos obtenidos por inoculación intramuscular y subcutánea mediante western blot (B) y dot blot (C). A: Análisis mediante gel de poliacrilamida 12%: FBPasa purificada (1) y extracto de proteína total de hígado de rata (2) teñido con azul de Coomasie. St: Marcador de proteínas rango amplio (15-116 KDa). B: inmunodetección de FBPasa con anticuerpos de gallina en muestra con FBPasa pura (1) y en extracto de proteína total de hígado de rata con anticuerpo obtenido por inoculación intramuscular (2) y por inoculación subcutánea (3). C: análisis mediante ensayo en gota con anti-FBPasa, en dilución de 1:1.000, obtenida por inoculación intramuscular (1) y subcutánea (2). F: FBPasa; A: aldolasa A; B: aldolasa B.

Specificity of antibodies obtained by intramuscular and subcutaneous inoculation determined by western blot and dot blot A: analysis by PAGE shows: purified FBPase (1) and total protein extract of rat liver (2). St: Molecular weight standard (15-116 KDa). B: immunodetection of FBPase with hen antibodies in a sample of pure FBPase (1) and a rat liver total protein extract with antibodies obtained by intramuscular (2) and subcutaneous (3) inoculations. C: dot blot analysis with anti-FBPase, in diluted 1:1000, obtained by intramuscular (1) and subcutaneous inoculations (2). F: FBPase; A: aldolase A; B: aldolase B.

Inmunización. Luego de la segunda inoculación, los grupos de aves inoculados por vía intramuscular y subcutánea presentaron un período de muda de plumas y la consecuente disminución en la producción de huevos. Por otra parte, al finalizar el ensayo se realizaron necropsias en todas las gallinas, encontrándose lesiones inflamatorias, con contenido caseoso en el tejido circundante al punto de inoculación. La magnitud de las lesiones fue similar en ambos grupos de gallinas, encontrándose pequeñas diferencias individuales dentro de un mismo grupo.

Título de los anticuerpos. Luego de la tercera inmunización se determinó el título de los anticuerpos producidos por ambas vías de inoculación (cuadro 1). El análisis de imagen digital indicó que el nivel de anticuerpos contra FBPasa presente en la yema de los huevos, previo a las inmunizaciones, fue mínimo o no existente, determinándose un número de pixeles cercanos a la respuesta basal (20 pixeles). Elevados títulos de anticuerpos fueron detectados ya a doce días después de la primera inyección, alcanzando su máximo 1-2 semana después de la tercera inoculación (figura 2). Resultados similares se obtuvieron con las otras gallinas inmunizadas (datos no mostrados). Además, al comparar la cantidad de pixeles, durante los distintos tiempos del experimento, se encontró que ambas vías de inoculación no presentaron diferencias (figura 2). Por otro lado, al comparar los resultados obtenidos dentro de cada grupo de inoculación, se observó que existen diferencias individuales en la producción de anticuerpos (figura 3). Utilizando un título bajo (1/1000) no se observa esta diferencia, la que comienza a ser evidente al realizar el análisis con un título de 1:10.000. De esta forma, se determinaron diferencias entre un 50 % y un 100 % entre gallinas del mismo grupo, encontrándose las mayores variaciones en las aves inoculadas por vía subcutánea (figura 3). Sin embargo, se determinó que no existen diferencias significativas entre las vías utilizadas para la producción de anticuerpos anti-FBPasa. 

FIGURA 2. Análisis digital de la tinción de DAB, obtenidas mediante ensayo en gota con los anticuerpos anti-FBPasa. Se muestra el análisis de una gallina de cada grupo de inoculación usando una dilución de 1:10.000, a diferentes tiempos de inmunización. A: preinmune; B: 12 días después de la 1ª inmunización; C: 1 semana después de la 2ª inmunización; D: 1 semana antes de la 3ª inmunización; E: 1 semana después de la 3ª inmunización; F: 4 semanas después de la 3ª inmunización. No se observaron diferencias significativas entre ambos grupos, lo cual fue determinado por la prueba de t de Student. Digital analysis of DAB signals obtained by dot blot with anti-FBPase antibodies. Analysis of one chicken from each inoculation group at different immunization stages was diluted 1:10.000. A: preimmune; B: twelve days after the first immunization; C: one week after the second immunization; D: one week before the third immunization; E: one week after the third immunization; F: four week after the third immunization. No significant difference was observed between both groups as determined by Student’s t test. 

FIGURA 3: Análisis digital de la intensidad de las marcas de DAB obtenidas mediante ensayo en gota, usando dos diluciones (1:10.000 y 1:20.000) de los anticuerpos anti-FBPasa (1 semana después de la 3ª inmunización) de ambos grupos de inoculación. No se observaron diferencias significativas entre ambos grupos, lo cual fue determinado por la prueba de t de Student. Digital analysis of the DAB signals obtained by dot blot, using two dilution (1:10.000 and 1:20.000) of anti-FBPase antibodies (1 week after the third immunization) of both inoculation groups. No significant difference was observed between both groups as determined by Student’s t test.

Determinación de especificidad de los anticuerpos anti–FBPasa. Mediante ensayo en gota, se determinó la posible reacción cruzada que pudieran presentar los anticuerpos purificados, con dos enzimas que copurifican en condiciones similares a las de FBPasa (aldolasa A y aldolasa B). Los anticuerpos obtenidos por inmunización intramuscular y subcutánea mostraron ser específicos para FBPasa, no detectándose reacción con las otras dos proteínas (figura 1C). Posteriormente, mediante análisis de Western blot de un extracto de proteína total de hígado de rata, se determinó que los anticuerpos producidos a través de ambas vías de inoculación reconocían una banda de masa ligeramente superior a 36 kDa (figura 1B), correspondiente a la masa molecular de la FBPasa de hígado de rata, dentro de una población con más de 50 proteínas diferentes.

DISCUSIÓN

El proceso de inmunización produjo zonas con daño tisular, lo cual puede ser atribuido a la utilización del adyuvante. En ambos grupos experimentales se encontraron lesiones macroscópicas similares con contenido caseoso circundantes al punto de inoculación. Estas observaciones difieren de las descritas por Gassmann y col. (1990), quienes informan que el adyuvante completo es bien tolerado y no produce reacciones inflamatorias. Como las lesiones macroscópicas son comparables en ambos grupos de inoculación no es posible recomendar en forma preferencial el uso de una de estas vías. Sin embargo, se estima que estas lesiones cumplieron un rol importante en la estimulación anticipada del inicio del período de muda de plumas en las gallinas, lo que condujo a una fuerte disminución en la producción de huevos. A pesar de esta interrupción en la producción, ambos grupos de inoculación mantuvieron elevados títulos de anticuerpos (cuadro 1). Al respecto, Carlander y col. (2001) indican que el transporte de IgY desde el suero a la yema del huevo no decrece al producirse una interrupción en la postura de los huevos. No obstante, se estima importante seleccionar gallinas jóvenes, previo o al inició de su período de postura, para comenzar la etapa de inmunización. Evitando de este modo que el estrés ocasionado por la manipulación durante las inoculaciones y la acción irritante del adyuvante, disminuyan la producción de huevos y con ello la producción de anticuerpos. La inoculación con aldolasa B y adyuvante completo de Freund en otro grupo de aves, antes del período de postura de huevos, evitó la disminución de la producción de huevos y con ello la disminución de los anticuerpos obtenidos (datos no mostrados). Otros autores han propuesto que es factible sustituir el adyuvante completo por el incompleto en la inmunización primaria, lo que no alteraría una efectiva respuesta inmunológica, evitando las lesiones y disminuyendo la mortalidad de las aves (Schade y col., 1996).

De acuerdo a Patterson y col. (1962) los anticuerpos aparecen en la yema 8 días después de la inoculación primaria, obteniéndose el máximo nivel a partir del día 12. Teniendo en cuenta esta información, la determinación de anticuerpos se inició doce días después de la primera inmunización. Las gallinas utilizadas en este ensayo proporcionaron huevos con una alta tasa de anticuerpos por un período de a lo menos dos meses (figura 2). En este sentido, la persistencia de elevados títulos de anticuerpos en yema es mayor que la observada en el suero de las aves (Patterson y col., 1962). La primera medición del nivel de anticuerpos, en la yema del huevo post-inoculación, mediante análisis digital, arrojó un numero de 350 pixeles, indicando una elevada cantidad de anticuerpos a pocos días de iniciarse el ensayo.

El nivel de anticuerpos luego de la segunda inmunización es mayor al obtenido luego de la primera, este incremento se debe a la acción de las células B de memoria que permiten una más fácil y rápida respuesta ante el antígeno (Kuby, 1997). Posteriormente, el nivel de los anticuerpos se mantuvo relativamente alto sin mayores declinaciones durante el período experimental (11 semanas) observándose la mayor intensidad en la marca de la nitrocelulosa luego de la tercera inmunización (8 semanas). La persistencia de altos títulos de anticuerpos y la alta cantidad de inmunoglobulinas presente en la yema de un huevo, equivalentes a las obtenidas por el sangramiento de un conejo (Frendscho, 1994), determina que la producción de anticuerpos desde huevos de gallina es una alternativa mucho más conveniente y barata, sólo comparable en cantidad con lo producido por grandes mamíferos, como bovinos o equinos (Larsson y col., 1993).

Las diferencias obtenidas dentro de cada grupo de inoculación, de un 50 % a un 100% en el número de pixeles (figura 3), pueden ser atribuidas a factores individuales. Sin embargo, al comparar el numero de pixeles promedio entre ambos grupos de inoculación, no se encontraron diferencias importantes, lo cual estaría indicando que la utilización de cualquiera de estas dos vías de inoculación para promover la producción de anticuerpos de proteínas citosólicas (como la FBPasa) en gallinas, es igualmente efectiva.

Un aspecto importante de la investigación fue determinar la especificidad de los anticuerpos purificados desde yema de huevo. Se ha descrito que FBPase interacciona con otras enzimas del metabolismo y que en ciertas condiciones de purificación puede estar contaminada con otras enzimas. Entre ellas, la más descritas son su interacción con la aldolasa A y B. Los ensayos en gota muestran que no existe reacción cruzada entre el anticuerpo anti-FBPasa con aldolasa A y aldolasa B, y que el anticuerpo producido detecta exclusivamente a la FBPasa (figura 1C). Estos resultados indican fuertemente que el anticuerpo obtenido es altamente específico. Este análisis fue corroborado realizando un inmunoblot de un extracto de proteínas totales de hígado de rata. Los resultados de inmunodetección muestran inequívocamente que el anticuerpo purificado desde huevos contra FBPasa presenta una alta especificidad, detectándose específicamente a la enzima en un extracto de proteínas totales de hígado de rata (figura 1B). Además, como se muestra en la carril 1 de la figura 1B se confirmó que el anticuerpo producido reconoce a la FBPasa purificada. Esta alta especificidad demostrada por el anticuerpo anti-FBPasa permitirá su utilización en ensayos de inmunohistoquímica. Este análisis podría posteriormente dilucidar la localización de la fructosa-1,6-bisfosfatasa a nivel celular en diferentes condiciones fisiológicas. Asimismo, debido a las características inmunológicas de IgY de disminuir los falsos positivos y no interactuar con las IgG de mamíferos posibilitaría la realización de estudios de co-localizacion, utilizando a la vez anticuerpos mamíferos de otras enzimas relacionadas en sus procesos metabólicos.

En conclusión, en este trabajo se compararon dos vías de inmunización para la obtención de anticuerpos desde la yema del huevo de gallinas mediante la estimación del título y la caracterización de los anticuerpos a través de diversos ensayos inmunológicos. Estos son los primeros estudios donde se muestra que no existen diferencias entre estas dos vías de inmunización (intramuscular y subcutánea) para la producción de anticuerpos de proteínas citosólicas como la FBPasa. Las diferencias detectadas dentro de cada grupo pueden atribuirse a factores individuales. Por otra parte, la elevada concentración de anticuerpos en cada huevo (15mg/ml), el largo período de postura de las gallinas (1 año) y la gran cantidad de IgY (100-300 mg/huevo) hace a este método una alternativa mucho más económica que las utilizadas convencionalmente.

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2 Instituto de Patología Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.