Perfil bioquímico del músculo Gluteus medius en equinos con distinto historial en carreras de resistencia (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Grupos de animales. En este estudio se emplearon 36 equinos de distintas razas (Anglo-árabe, Arabe y Arabe cruzado) participantes habituales en carreras de resistencia, incluyendo 1 semental, 17 machos castrados y 18 hembras, con edades comprendidas entre 4 y 17 años (media ± desviación típica, 8.42 ± 2.85 años). En general, todos los individuos tuvieron una conformación análoga y fueron mantenidos en similares condiciones ambientales en la misma región de España (Cataluña). Todos los caballos recibieron un entrenamiento de resistencia convencional, al menos, los 2 años previos a este estudio y habían participado durante 2 a 10 años en pruebas de larga resistencia de nivel nacional y/o internacional según la edad de cada animal. El programa de entrenamiento habitual consistió en 60-120 minutos/día de carrera de baja intensidad (10 km/h) durante 5 ó 6 días/semana, aunque algunas diferencias interindividuales en su intensidad y duración no pudieron ser cuantificadas.

Para catalogar el rendimiento de cada animal en la competición se usaron las velocidades medias de las 3 carreras con las mejores marcas realizadas en los 2 ó 3 últimos años. Veinte de los 36 equinos fueron considerados de rendimiento excelente (Grupo CRE) en la competición de acuerdo con la velocidad media de sus tres mejores records en carreras de resistencia durante los anteriores dos o tres años, mientras que los 16 restantes tuvieron rendimientos moderados (Grupo CRM), con una velocidad media de carrera <12.5 km/h (en pruebas de 120 a 180 km), <14 km/h (en competiciones de 80 a 120 km) o <13.5 km/h (en pruebas de 40 a 60 km). El número de hembras y machos en cada una de las dos categorías fue aproximadamente igual. No obstante, la varianza ligada al sexo fue considerada en el modelo estadístico aplicado a los datos.

Biopsias musculares. De cada caballo se obtuvieron tres biopsias del músculo Gluteus medius derecho a 20 mm (región superficial), 40 mm (región media) y 60 mm (región profunda) de profundidad, a través de la misma incisión, de acuerdo con Lindholm y Piehl (1974). Este músculo fue elegido porque interviene activamente en todas las intensidades de ejercicio (Lindholm y Piehl, 1974). Todas las muestras fueron tomadas por la misma persona, con experiencia en estudios sobre biopsias musculares, procurando que su localización y profundidad fueran equiparables en todos los caballos. El lugar de acceso de la aguja de biopsia se identificó sobre la grupa, en un ángulo de 45° con el plano transversal, dorso caudalmente desde la tuberosidad coxal del ilion (Lindholm y Piehl, 1974). La localización exacta de las biopsias varió entre 100 y 150 mm desde ese punto, de acuerdo con la raza, edad y conformación de la grupa de cada caballo. Las biopsias fueron congeladas por inmersión directa en nitrógeno líquido. Todas las muestras fueron almacenadas a -80° C hasta su análisis.

Análisis bioquímicos. Las muestras musculares, una vez descongeladas, fueron liofilizadas durante 24 horas, eliminándose a continuación la sangre, grasa y tejido conectivo. Una determinada cantidad de músculo (1 a 2 mg) fue homogeneizada en un tampón de fostato de potasio (0.1 M, pH 7.3) a una dilución de 1:400 mantenido a baja temperatura con hielo picado. Para ello se utilizó un vaso homogeneizador específico para la trituración de tejidos. Las actividades de las enzimas citrato sintasa (CS, E.C., 4.1.3.7), 3-OH-acil-coenzima A-deshidrogenasa (HAD, E.C., 1.1.1.35) y lactato deshidrogenasa (LDH, E. C., l. l. 1.27) fueron medidas por duplicado en cada muestra de acuerdo con los protocolos de Essén y col. (1980) para CS y HAD y Essén-Gustavsson y col. (1983) para LDH. Las actividades enzimáticas se determinaron cuantificando los cambios en el número de equivalentes de NADH in vitro a 25° C, usando técnicas fluorométricas y se expresaron en µmol de NADH convertido/min/g de músculo liofilizado. El error metodológico se determinó en 90 mediciones dobles del mismo homogeneizado y los coeficientes de variación para las actividades CS, HAD y LDH fueron 5.15, 5.91 y 4.60 por ciento respectivamente.

Análisis estadístico. La variabilidad de las actividades enzimáticas fue expresada por la desviación típica. Los componentes de la varianza fueron evaluados a cada profundidad por un análisis múltiple de varianza de tres factores (MANOVA) según el siguiente modelo (SAS Institute, 1982):

Yijkl = µ + Ei + Sj + CRk + CI + Errorl(ijk)

donde los factores fueron edad (E), sexo (S) y categoría de rendimiento (CR) y donde µ es la media poblacional de la actividad de un determinado enzima en cada muestra biópsica. En general los coeficientes de interacción (CI) no fueron significativos. Debido a la influencia de la raza Arabe en todos los caballos de este estudio, la varianza ligada a la raza fue incluida en el coeficiente de error aleatorio (Errorl1(ijk)). Los efectos de los factores examinados fueron considerados significativos con una probabilidad P<0.05. Las variaciones de las actividades enzimáticas entre categorías de rendimiento fueron nuevamente analizadas mediante un análisis de covarianza (ANCOVA) para corregir la influencia que la profundidad de la muestra ejerce sobre las actividades enzimáticas del músculo. También se calcularon las ecuaciones de regresión lineal frente a la profundidad de muestreo para cada categoría de rendimiento.

RESULTADOS

En general, la influencia de la edad y el sexo sobre las actividades de las enzimas analizadas no fue significativa (P>0.05).

A una profundidad determinada en el músculo (cuadro 1), los caballos del Grupo CRE tuvieron mayores actividades de CS y HAD y menor actividad de LDH que los del Grupo CRM. Sin embargo, estas diferencias sólo fueron significativas para la actividad de CS a profundidades de 40 y 60 mm (p<0.02 en ambas) y para la actividad de HAD a 40 mm (P<0.01).

La aplicación de un ANCOVA sobre el material en conjunto para examinar las diferencias entre categorías de rendimiento teniendo en cuenta la profundidad de muestreo permitió separar el efecto de ambos factores (cuadro 2). La influencia de la categoría de rendimiento fue significativa para las actividades de CS y HAD (P<0.001 y P<0.02, respectivamente), pero no para la actividad de LDH (P>0.05). Los cambios debidos a la profundidad fueron de una magnitud mucho mayor que los atribuibles al efecto de la categoría de rendimiento, como demuestran los elevados valores F (cuadro 2).

En el cuadro 3 se comparan las ecuaciones de las rectas de regresión para las actividades enzimáticas frente a la profundidad de muestreo entre ambos grupos de caballos. Los valores de la ordenada en el origen fueron significativamente distintos para las actividades de CS (P<0.001) y de HAD (P<0.02), pero no para la actividad de LDH (P>0.05). Las actividades de las tres enzimas cambiaron significativamente en función de la profundidad de la muestra, pero las pendientes de las rectas de regresión no fueron significativamente diferentes entre categorías de rendimiento. Globalmente, las actividades de CS y HAD se incrementaron el 60% y el 75% (P<0.001 en ambas) respectivamente, desde la profundidad de muestreo más superficial a la más profunda del músculo. Por el contrario, la actividad de LDH disminuyó el 23% (P<0.01) en la porción más profunda del músculo.

Para describir el perfil metabólico general del músculo en cada categoría de rendimiento se calculó la regresión con la profundidad de las proporciones de actividades LDH/CS y LDH/HAD en todas las muestras (cuadro 3). En ambos grupos existió una fuerte relación lineal para las 2 proporciones (P<0.001). Pese a no detectarse diferencias significativas entre las pendientes de estas rectas de regresión, los valores de la ordenada en el origen fueron significativamente mayores para ambas proporciones en el Grupo CRM que en el Grupo CRE (LDH/CS P<0.001; LDH/HAD P<0.01).

DISCUSIÓN

Las actividades de las enzimas CS, HAD y LDH estuvieron dentro del rango de valores obtenido por otros autores (Guy y Snow, 1977; Snow y Guy, 1981; Essén-Gustavsson y col., 1984; Hodgson y Rose, 1987). Algunos estudios han obtenido actividades CS y LDH más elevadas en equinos fina sangre de carrera (Lindholm y col., 1983; Lovell y Rose, 1991; Ronéus y col., 1991) y trotadores (Henckel, 1983; Hodgson y col., 1985; Valberg y col., 1985). Por el contrario, la actividad HAD fue mayor en el presente estudio. El alto valor del ratio de las actividades HAD/CS obtenido demuestra la importancia del metabolismo lipídico durante el ejercicio submáximo de larga distancia en los equinos de resistencia (Essén-Gustavsson y col., 1984; Hodgson y Rose, 1987).

Aunque las actividades de las enzimas CS y HAD aumentan con el entrenamiento de resistencia (Henckel 1983; Hodgson y Rose, 1987), las diferencias obtenidas en la relación de HAD/CS respecto a otros estudios previos en caballos de competición pueden deberse parcialmente a la influencia de la raza Arabe en todos los equinos incluidos en el presente trabajo. De hecho, los equinos Arabes tienen una mayor actividad de HAD (Snow y Guy, 1981) y un porcentaje de fibras tipo I (López-Rivero y col., 1990) significativamente superior a otras razas, lo que puede estar relacionado con su excelente aptitud para las carreras de resistencia, una disciplina ecuestre dominada por esta raza (Ridgway, 1989). También en equinos islandeses, una raza extraordinariamente adaptada para actividades de resistencia, el ratio HAD/CS es superior a 1 1.

Nuestros resultados muestran claramente que los equinos con mejores resultados en carreras de larga distancia tienen una capacidad aeróbica mayor y una capacidad anaeróbica relativamente menor en el músculo Gluteus medius que los equinos con resultados moderados en la competición. Así lo indican las elevadas actividades CS y HAD y los menores valores de las rectas de regresión con la profundidad de las proporciones de las actividades enzimáticas que describen el perfil metabólico del músculo en los equinos del grupo CRE. Esta mayor capacidad oxidativa pone en relieve que, a nivel muscular, las rutas metabólicas predominantes en los mejores equinos de resistencia son la oxidación de piruvato y ácidos grasos. Además, como el aumento de la actividad de una enzima implica un incremento de la probabilidad de unirse con su sustrato (Hodgson y Rose, 1987), las elevadas actividades de las enzimas HAD y CS encontradas en los caballos del Grupo CRE deberían mejorar el uso de dichos sustratos en sus correspondientes rutas metabólicas durante el ejercicio submáximo en carreras de resistencia. Tal mejora de la regulación metabólica implica un aumento del consumo de grasa y una disminución del empleo de glucógeno en los músculos durante su actividad. Dicho mecanismo aumentaría la eficacia en la utilización de energía por las fibras musculares y disminuiría su fatigabilidad, ya que el agotamiento de las reservas intramusculares de glucógeno ha sido relacionado con el inicio de la fatiga durante el ejercicio de resistencia (Snow y col., 1981,1982; Hodgson y col., 1983). De hecho, en equinos bien entrenados y con un desarrollo óptimo de su capacidad oxidativa a nivel del músculo, la utilización de glucógeno durante el ejercicio es menor que en animales sin entrenamiento (Hodgson y col., 1985).

Las diferentes actividades enzimáticas obtenidas en ambos grupos de rendimiento pueden estar relacionadas con las diferencias observadas en el porcentaje y tamaño fibrilar, ya que existe una correlación entre las actividades enzimáticas y ambos parámetros fibrilares (Valberg y col., 1985). Este hecho ha sido confirmado por mediciones de actividades enzimáticas oxidativas (CS) y glucolíticas (LDH) en fibras musculares aisladas de caballos (Valberg y Essén-Gustavsson, 1987). Las fibras tipo I tienen mayor capacidad oxidativa y menor capacidad glucolítica que las IIB. Las fibras tipo I también poseen una menor actividad LDH que las fibras IIA, pero su actividad CS es similar. Por lo general, las fibras tipo IIA poseen un potencial oxidativo mayor y una capacidad glucolítica menor que las fibras IIB (Valberg y Essén-Gustavsson, 1987).

Se ha demostrado que, tras el entrenamiento, las fibras musculares equinas pueden aumentar su capacidad oxidativa sin cambiar su perfil histoquímico por mATPasa (Hodgson y col., 1985; Hodgson y Rose, 1987; López-Rivero y col., 1991). De esta manera, las fibras tipo I de los equinos con mejores resultados podrían tener mayor actividad de las enzimas oxidativas que las de los individuos con peores resultados.

Las elevadas actividades de las enzimas oxidativas observadas en los equinos con una mayor capacidad atlética indican una adaptación funcional del músculo que puede ser debida al entrenamiento y a una influencia genética. El aumento de las actividades enzimáticas aeróbicas tras el entrenamiento es una adaptación frecuente en el músculo equino (Guy y Snow, 1977; Henckel, 1983; Cutmore y col., 1985; Hodgson y col., 1985; Hodgson y Rose, 1987). Sin embargo, y dado que todos los caballos examinados en este estudio habían recibido un entrenamiento similar, las diferencias en las actividades enzimáticas podrían estar relacionadas, en parte, con la dotación genética propia de cada individuo. De hecho, las actividades de enzimas musculares muestran diferencias individuales significativas en potros recién nacidos (Kline y Bechtel, 1990), en animales de un año antes del entrenamiento (Lindholm y col., 1983) y entre caballos de distintas razas sin entrenar (Snow y Guy, 1981).

Todos estos hallazgos señalan la importancia de la herencia sobre la predeterminación de las actividades enzimáticas musculares. Un estudio categórico y cuidadosamente diseñado realizado con gemelos humanos monozigóticos y dizigóticos (Komi y col., 1977) concluyó que existe un predominio de la influencia genética sobre la composición fibrilar, pero no sobre las actividades enzimáticas del músculo. Debido a la correlación que existe entre los porcentajes fibrilares y las actividades enzimáticas (Valberg y Essén-Gustavsson, 1987), el papel del componente genético sobre la variación interindividual de las actividades enzimáticas puede ser consecuencia directa de la influencia genética sobre la proporción de fibras de contracción lenta y rápida mencionada anteriormente.

Como el ejercicio de resistencia en el caballo es esencialmente aeróbico (Essén-Gustavsson y col., 1984; Hodgson y Rose, 1987), y sólo produce un ligero incremento del lactato sanguíneo (Lucke y Hall, 1980) las pequeñas diferencias (no significativas) obtenidas para la actividad LDH entre los dos grupos de caballos eran previsibles ya que la actividad de LDH no aumenta significativamente con el entrenamiento de resistencia (Henckel, 1983; Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; Hodgson y Rose, 1987).

Los resultados del presente estudio demuestran la existencia de diferencias muy significativas en el perfil metabólico del músculo Gluteus medius de equinos con distinto historial en carreras de larga distancia. Los mejores equinos de resistencia tuvieron mayor capacidad oxidativa en el músculo que los individuos con resultados moderados en la competición.

AGRADECIMIENTOS

Los análisis bioquímicos de las biopsias musculares fueron realizados durante las estancias de A.L. Serrano y J.L.L. Rivero en el National Institute of Animal Science (Dinamarca). Agradecemos la asistencia técnica de Marianne Andersen, así como la cooperación desinteresada de todos los propietarios de los caballos por permitirnos tomar biopsias musculares.

* Estudio financiado por la Junta de Andalucía (Grupo 2001), la Universidad de Córdoba y el National Institute of Animal Science (Dinamarca). (Henckel, 1993, observación personal).

BIBLIOGRAFÍA

CUTMORE, C.M.M., D.H. SNOW, E.A. NEWSHOLME. 1985. Activities of key enzymes of aerobic and anaerobic metabolism in middle gluteal muscle from trained and untrained horses, Equine Vet. J. 17: 354-356.

ESSEN, B., A. LINDHOLM, J. THORNTON. 1980. Histochemical properties of muscle fiber types and enzyme activities on skeletal muscles of Standardbred trotters of different ages, Equine Vet. J. 12: 175-180.

ESSEN-GUSTAVSSON, B., A. LINDHOLM, D. McMIKEN, S.G.B. PERSSON, J. THORNTON. 1983. Skeletal muscle characteristics of young Standardbreds in relation to growth and early training. En: D.H. SNOW, S.G.B. PERSSON and R.J. ROSE (eds.). Equine Exercise Physiology. Granta Editions, Cambridge, England, pp. 200-210.

ESSEN-GUSTAVSSON, B., K. KARLSTRÖM, A. LINDHOLM. 1984. Fibre types, enzyme activities and substrate utilisation in skeletal muscles of horses competing in endurance rides, Equine Vet. J. 16: 197-202.

GUY, P.S., D.H. SNOW. 1977. The effect of training and detraining on muscle composition in the horse, J. Physiol. 269: 33-51.

HENCKEL, P. 1983. Training and growth induced changes in the middle gluteal muscle of young Standardbred trotters, Equine Vet. J. 15: 134-140.

HODSON, D.R., R.J. ROSE, J.R. ALLEN. 1983. Muscle glycogen depletion and repletion patterns in horses performing various distances of endurance exercise. En: D.H. SNOW, S.G.B. PERSSON and R.J. ROSE (eds.). Equine Exercise Physiology. Granta Editions, Cambridge, England, pp. 229-236.

HODGSON, D.R., R.J. ROSE, J. DIMAURO, J.R. ALLEN. 1985. Effects of a submaximal treadmil training programme on histochemical properties, enzyme activities and glycogen utilisation of skeletal muscle in horse, Equine Vet. J. 17: 300-305.

HODGSON, D.R., R.J. ROSE. 1987. Effects of a nine-month endurance training programme on mucle composition in the horse, Vet. Rec. 121: 271-274.

KLINE, K.H., P.J. BECHTEL. 1988. Changes in the metabolic profile of the equine Gluteus medius as a function of sampling depth, Comp. Biochem. Physiol. (A) 91: 815-819.

KLINE, K.H., P.J. BECHTEL. 1990. Changes in the metabolic profile of equine muscle from birth through 1 year of age, J. Appl. Physiol. 68: 1399-1404.

KOMI, P.V., J.H.T. VITASALO, M. HAVU, A. THORSTENSSON, B. SJODIN, J. KARLSSON. 1977. Skeletal muscle fibres and muscle enzyme activities in monozygous and dizygous twins of both sexes, Acta Physiol. Scand. 100: 385-392.

LINDHOLM, A., K. PIEHL. 1974. Fibre composition, enzyme activity and concentration of metabolites and electrolytes in muscles of Standardbred horses, Acta Vet. Scand. 15: 287-309.

LINDHOLM, A., B. ESSEN-GUSTAVSSON, D. McMIKEN, S. PERSSON, J.R. THORNTON. 1983. Muscle histochemistry and biochemistry of Thoroughbred horses during growth and training. En: D.H. SNOW, S.G.B. PERSSON and R.J. ROSE (eds.). Equine Exercise Physiology. Granta Editions, Cambridge, England, pp. 211-217.

LOPEZ-RIVERO, J.L., E. AGÜERA, J. VIVO, A. DIZ, F. MIRO. 1990. Histochemical and morphometrical study of the middle gluteal muscle in Arab horses, J. Equine Vet. Sci. 10: 144-148.

LOPEZ-RIVERO, J.L., J.L. MORALES-LOPEZ, A.M. GALISTEO, E. AGÜERA. 1991. Muscle fibre type composition in untrained and endurance-trained Andalusian and Arabian horses, Equine Vet. J. 23: 91-93.

LOVEL, D.K., R.J. ROSE. 1991. Changes in fibre composition and metabolism in equine skeletal muscle in response to interval and high intensity training. En: S.G.B. PERSSON, A. LINDHOLM, L.B. JEFFCOTT (eds.). Equine Exercise Physiology 3. ICEEP Publications, Davis, California, pp. 215-222.

LUCKE, J.N., G.M. HALL. 1980. Long distance exercise in the horse: Golden Horseshoe Ride 1978, Vet. Rec. 106: 405-407.

RIDGWAY, K.J. 1989. Selecting the endurance horse. En: Equine Sports Medicine. Ed. W.E. Jones. Lea and Febiger, Philadelphia, pp. 290-293.

RONEUS, M., A. LINDHOLM, A. ASHEIM. 1991. Muscle characteristics in Thoroughbreds of different ages and sexes, Equine Vet. J. 23: 207-210.

SAS INSTITUTE INC. 1982. SAS User’s Guide: Statistics. Cary, NC: SAS Institute, pp. 139-200.

SNOW, D.H., P.S. GUY. 1981. Fiber types and enzyme activities of the Gluteus medius in different breeds of horse. En: J.B. POORTMANS and B. NISET (eds.). Biochemistry of Exercise IV. University Park, Baltimore, MD, pp. 275-282.

SNOW, D.H., P. BAXTER, R.J. ROSE. 1981. Muscle fibre composition and glycogen depletion in horses competing in an endurance ride, Vet. Rec. 108: 374-378.

SNOW, D.H., M.G. KERR, M.A. NIMMO, E.A. ABBOTT. 1982. Alteration in blood, sweat, urine and muscle composition during prolonged exercise in the horse, Vet. Rec. 110: 377-384.

VALBERG, S., B. ESSEN-GUSTAVSSON, A. LIND-HOLM, S. PERSSON. 1985. Energy metabolism in relation to skeletal muscle fibre properties during treadmill exercise, Equine Vet. J. 17: 439-444.

VALBERG, S., B. ESSEN-GUSTAVSSON. 1987. Metabolic response to racing determined in pools of type I, IIA, and IIB fibres. En J.R. GILLESPIE and N.E. ROBINSON (eds.). Equine Exercise Physiology 2. ICEEP Publications, Davis, California, pp. 290-301.

 J.L.L. RIVERO1, M.V, Ph.D; A.L. SERRANO1, M.V, Ph.D; P. HENCKEL2, M. Sc.1Grupo de Biología Muscular, Universidad de Córdoba, Facultad de Veterinaria, Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas. Avda. Medina Azahara 9, 14005 Córdoba, España. 2National Institute of Animal Science, Department of Research in Pigs and Horses, Dk.8830 Tjele, Dinamarca.