Efecto de una dieta con bajo aporte de selenio sobre la respuesta inmune a la vacuna Brucella abortus Cepa RB51 en vacas lecheras (página 2)

MATERIAL Y MÉTODOS

Animales y grupos experimentales. Se utilizaron 12 vacas Frisón Negro entre 4 y 9 años de edad con 7-8 meses de gestación, provenientes de un predio lechero libre de tuberculosis, leucosis y brucelosis. Los animales fueron asignados al azar a dos grupos de 6 vacas cada uno, homogéneo en edad (6,5 ± 0,9 años), número de partos (3,5 ± 1,4), peso corporal (594 ± 69,7 kg), tiempo de gestación (230 días), producción de leche en la última lactación (6406 ± 852,6 l) y alimentados con una dieta de bajo contenido de Se. Un grupo fue alimentado sólo con la dieta pobre en Se (Se-D), mientras que al otro grupo se les restituyó el balance nutricional normal de Se mediante la suplementación con Se (Se-S).

Alimentación y manejo. Los animales fueron mantenidos durante todo el experimento en estabulación permanente (piso de hormigón con cama de paja y comederos individuales) y agua ad libitum. A partir de aproximadamente 45 días antes del parto los animales fueron alimentados con 9,5 kg de heno de pradera natural (Se=0,02 ppm de materia seca (MS)), más 1 kg de concentrado comercial (Se=0,12 ppm de MS). Posterior al parto, los animales fueron mantenidos en similares condiciones, con dos ordeñas al día (14 L/día) y una ración diaria de 11,5 kg de heno (Se=0,02 ppm), concentrado (Se=0,12 ppm) hasta 5 kg, según requerimientos por producción, 0,5 kg de afrecho de soya (Se=0.17 ppm de MS), 0,5 kg de sebo para alimentación animal (Se<0,01 ppm de MS), urea 0,12 kg (Se < 0,01 ppm de MS) y 0,15 kg de mezcla mineral sin Se.

El contenido de Se de la ración fue medido mediante espectroscopia de plasma acoplado inductivamente con detector de masa (ICP-MS), en muestras digeridas en ácido nítrico y perclórico1. El aporte de Se en la ración fue de 0,048 ppm de MS (equivalente al 16% de los requerimientos según NRC 2001). En el transcurso del período de estudio se registró la condición corporal de todos los animales utilizando la escala de 1 a 5 según Edmonson y col (1989).

Suplementación con selenio. El grupo Se-S fue suplementado con 1 mg de Se/kilo de peso vivo (pv) usando selenato de bario2 en dosis única de 1 ml/50 kg/pv subcutáneo, administrado aproximadamente 45 días antes del comienzo de los partos. De cada vaca se tomaron dos muestras de sangre (con y sin heparina), por venopunción coccígea previo a la suplementación y luego cada 15 días durante todo el experimento, el suero obtenido fue guardado a –20°C hasta su posterior análisis.

Evaluación de la actividad sanguínea de glutatión peroxidasa (GSH-Px). La actividad sanguínea de GSHPx se evaluó quincenalmente en hemolizados de las muestras de sangre con heparina. Su determinación se realizó empleando reactivos comerciales3 basados en la técnica cinética compuesta NADPH-dependiente descrita por Paglia y Valentine (1967) modificada según Ceballos y col (1998). Las lecturas se realizaron en un espectrofotómetro Hitachi 40204 y la actividad fue expresada en U/g Hb.

Inmunización con la vacuna RB51. Todos los animales fueron inmunizados con una dosis completa (1-3,4 x 1010) de la vacuna Brucella abortus Cepa RB515, 100 días posteriores a la administración de Se.

Preparación antigénica del extracto total de RB51. Para las pruebas de intradermorreacción se preparó antígeno de Brucella abortus Cepa RB51 de acuerdo al protocolo descrito por Leyán y col (2005). La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford utilizando un kit comercial6.

Determinación de la concentración de inmunoglobulinas IgG, IgM e IgA en suero. Se cuantificaron mediante el método de inmunodifusión radial7. La determinación se realizó previo a la administración de Se (día 0) y posterior a la administración de Se, los días 30, 60 y 90.

Determinación de la respuesta inmune humoral específica a la vacuna RB51. La respuesta humoral se determinó por el método de ELISA indirecto en muestras de suero (1:2000) obtenidas los días 0, 15, 30, 45 y 60 desde la vacunación. En resumen, la placa de poliestireno se sensibilizó con 0,5 µg de proteína del extracto total de RB51 por pocillo, se adicionó el suero y fueron incubadas a 4°C durante 18 horas. Para detectar los anticuerpos anti Brucella abortus, se utilizaron anticuerpos anti IgG de bovino unidos a peroxidasa8. Posteriormente la reacción fue revelada con o-Phenylenediamine9 y peróxido de hidrógeno como sustrato. La lectura se realizó en un lector de ELISA ElX 800 automático10.

Determinación de la respuesta inmune celular específica a la vacuna RB51. La respuesta inmune celular se evaluó mediante pruebas de intradermorreacción y análisis histológico:

Intradermo reacción. Se efectuó en los dos grupos de animales previamente sensibilizados con la administración de la vacuna RB51. La respuesta se determinó 60 días después de la vacunación mediante inyección intradérmica del extracto de Brucella abortus Cepa RB 51 en la región cervical, en dosis de 16 µg y 32 µg. La lectura se realizó a las 72 h con un cutímetro de resorte. Como control de la reacción se utilizó Tuberculina PPD bovino11 en los mismos animales. Como control de la especificidad del antígeno se realizó la prueba de intradermo reacción a terneras no inmunizadas con RB51.

Estudio histológico. Se realizó en muestras de tejido obtenidas mediante biopsia del área de reacción de la piel. Las muestras fueron fijadas en formalina tamponada al 3,9% y procesadas de acuerdo a las técnicas histológicas convencionales. Los cortes histológicos fueron teñidos con hematoxilina y eosina para su estudio.

Análisis estadístico. Se determinaron las medias, desvíos y error estándar por grupo y período de muestreo para cada variable. Posterior a evaluar la normalidad de la distribución de los datos (Kolmogorov-Smirnov) y su homosedastisidad (Bartlett’s), las diferencias entre períodos se evaluaron mediante ANDEVA y la prueba de comparación múltiple de Tukey. Las diferencia entre grupos se evaluaron mediante la prueba de "t" de Student. Los análisis se realizaron con el programa Prism 3.0 y se empleó un nivel de significancia del 95%.

RESULTADOS

El ensayo comprendió el período preparto, parto y lactancia de las vacas, tiempo en el cual los animales de ambos grupos presentaron variaciones en su condición corporal propias a su estado fisiológico, sin mostrar diferencias entre los grupos (P>0,05). El preparto fue de 3,3 para descender a 2,3 al mes de lactancia y recuperar a 3,0 a los 180 días de lactancia.

Los animales mantenidos sólo con la ración con bajo contenido de Se presentaron una disminución (P<0,05) en la actividad de GSH-Px hasta valores considerados bajos (<100 U/g Hb) a los 30 días y deficientes (<60 U/g Hb) a los 150 días. La suplementación con selenato de bario aumentó significativamente (P<0,05) la actividad GSH-Px desde 118,5±29 U/g Hb (previo a la suplementación) a valores mayores de 300 U/g Hb al final del período experimental (figura 1).

Las concentraciones de IgG, IgM e IgA de ambos grupos de animales fueron similares (P>0,05) (cuadro 1). Por otra parte, entre los días 30 y 60 postsuplementación, correspondiente con el período de partos, se observó una disminución significativa (P<0,05) de la concentración de inmunoglobulinas IgG en ambos grupos (cuadro 1).

La inducción de respuesta inmune humoral específica a la vacuna RB51 en ambos grupos de animales desarrolló similar cinética de producción de anticuerpos, con un aumento (P<0.05) en el día 15 postinmunización (figura 2). Aun cuando no se presentaron diferencias entre grupos (P>0.05), se observó una tendencia a títulos de anticuerpos más alto en el grupo Se-S (figura 2).

A las 72 h de iniciadas las pruebas de intradermo reacción, se observó aumento de volumen e induración local en ambos grupos de animales. Las respuestas, tanto al usar 16 µg como 32µg de proteína total de Brucella abortus (figura 3), fueron similares para ambos grupos, con una tendencia a ser mayor en el grupo Se-S, sin llegar a ser estadísticamente significativa. El análisis histológico de la reacción inflamatoria en el sitio de estimulación en ambos grupos de animales demostró infiltrado inflamatorio mononuclear con presencia de eosinófilos (figura 4). Por otra parte, las pruebas de intradermo reacción realizadas con tuberculina en los mismos animales y las realizadas con extracto de RB51 en terneras no vacunadas contra brucelosis fueron negativas.  

DISCUSIÓN

La condición corporal de los animales de ambos grupos disminuyó progresivamente durante el período experimental, como consecuencia de la producción láctea y el estricto control en la alimentación. El efecto de la dieta con bajo contenido de Se se tradujo en una disminución lenta y progresiva de la actividad de la enzima GSH-Px en los eritrocitos, que se hizo mínima a los 150 días. Por otra parte, la suplementación con Se aumentó la actividad de GSH-Px desde los 45 días con respecto al valor basal, tiempo que guarda relación con la incorporación del Se a las seleno enzimas en el glóbulo rojo durante la eritrogénesis (Grace 1994). El efecto del selenato de bario se mantuvo durante los 6 meses de estudio debido a la lenta liberación del Se (Lee y col 1999), de manera similar a lo observado por Leyán y col (2005) al utilizarlo en vaquillas con mismos propósitos.

La disminución de IgG en ambos grupos, entre los días 30 y 60 con respecto al valor basal del día 0 coincide con el período periparto, en el cual se produce el transporte activo de inmunoglobulina IgG1 desde la circulación sanguínea a la glándula mamaria (Larson y col 1980). Aun cuando no se presentan diferencias significativas en la concentración de IgG entre ambos grupos, permanece la duda si la eficiencia del transporte activo a la glándula mamaria fue mayor en los animales suplementados, como ha sido sugerido por Swecker y col (1995). En este mismo sentido Leyán y col (2004) señalaron que el uso de selenato de bario en vacas gestantes selenio-deficientes disminuye la concentración de IgG1 sin afectar los niveles de IgG total en el calostro.

Si bien los anticuerpos inducidos por la vacuna RB51 contra Brucella abortus no son detectados con la prueba de aglutinación rápida usada como prueba de campo, estos sí son detectados mediante ELISA (Schurig y col 1991, Cheville y col 1993, Jiménez de Bagues y col 1994). Al respecto, los resultados demostraron que la deficiencia de Se no alteró cualitativamente la respuesta de anticuerpos durante todo el experimento; sin embargo, durante todo el período de estudio se observó una tendencia levemente mayor en los animales suplementados. En ambos grupos el aumento del día 15 corresponde a la respuesta secundaria a la revacunación, ya que estos animales provenían de un predio libre de brucelosis y habían sido vacunados entre los 3 y 8 meses de edad con la vacuna Cepa 19. Es interesante señalar que aun cuando las diferencias entre grupos no son significativas durante el período experimental, la persistencia de los títulos es levemente mayor en los animales suplementados con Se. Estudios previos también señalan que la suplementación con Se no tiene efecto significativo sobre la respuesta inmune humoral a Brucella abortus en vaquillas (Nemec y col 1990, Leyán y col 2005).

La respuesta cutánea al antígeno total de Brucella demostró ser especifica, ya que el grupo de animales no vacunados usados como control no presentó reacción local ni alteraciones microscópicas en el tejido. La reacción en los animales vacunados indica desarrollo de la inmunidad celular, la cual es importante para la protección contra la enfermedad natural (Oliveira y col 2002, Wyckoff 2002). Un aspecto importante de considerar es la relación entre la actividad de GSH-Px y la reacción intradérmica; al respecto, los animales suplementados tenían una actividad de GSH-Px de 280 U/g Hb en el momento de realizar la prueba. En este mismo sentido, los resultados informados por Leyán y col (2005), utilizando similares condiciones experimentales en vaquillas, señalan que en animales con 400 U/g Hb se produjo una disminución de la respuesta inmune celular. Esta diferencia sugiere que en los animales deficientes de Se la suplementación con selenato de bario no afectaría o tiende a mejorar la respuesta, pero en animales con estatus normal de Se su suplementación eleva la actividad de GSH-Px a valores que coinciden con una disminución de la respuesta celular (Leyán y col 2005).

La ausencia de diferencias en los valores obtenidos, tanto en la respuesta inmune específica como en la concentración de inmunoglobulinas séricas, no se relaciona con las marcadas diferencias entre grupos que establece la medición de la actividad enzimática de GSH-Px. Este hecho nos estaría revelando que otros mecanismos que son independientes de la actividad de GSH-Px podrían intervenir en la modulación de la capacidad antioxidante, dando lugar a una respuesta biológica compensatoria en la red antioxidante destinada a minimizar los efectos de la deficiencia nutricional, lo que otorgaría protección a las células involucradas en la respuesta inmune. En este sentido, se ha visto que algunas isoformas de glutatión transferasa, no dependientes de Se, pueden ser inducidas en situaciones de deficiencia de Se, incrementando su actividad y contribuyendo a la eliminación de peróxidos orgánicos (Chang y col 1990). Por otra parte, también se ha señalado que la disminución de la actividad de GSHPx parece ser compensada con un incremento en la actividad de la catalasa (Himeno y col 1993). Estos mecanismos contribuirían a mantener la capacidad de respuesta frente a una agresión oxidativa. También es necesario considerar que el rol que desempeña GSH-Px sería secundario en la protección y estabilidad de los lípidos de membrana, pudiendo ser más importante el estatus de vitamina E que el de Se (Gutzwiller 1998). Desde otro punto de vista, se ha sugerido que el rol de GSH-Px como enzima antioxidante in vivo podría ser menor que su función homeostática, como una forma de almacenamiento de Se (Nève 2000). Por otra parte, un factor importante que se debe considerar al momento de explicar la ausencia de diferencias entre grupos Se-S y Se-D proviene de los estudios desarrollados por Weitzel y col (1990) y Guan y col (1995), quienes encontraron que la isoforma GSH-Px fosfolípido hidroperóxido disminuye su actividad más lentamente que la celular. El rol biológico que desempeña es sinérgico a la vitamina E y consiste en remover los fosfolípidos hidroperóxidados a nivel de membranas y que no constituyen sustrato para la GSH-Px celular. Esto determina que en situaciones de deficiencia de Se, en donde la actividad de GSH-Px celular se ve fuertemente deprimida, la actividad enzimática de GSH-Px fosfolípido hidroperóxido continúe expresándose por un lapso más prolongado permitiendo a la célula soportar una agresión oxidativa.

Evaluar la influencia de la nutrición sobre la respuesta inmune es compleja, especialmente en vacas en producción, ya que los animales se encuentran influenciados por el estrés ambiental, condiciones reproductivas como la gestación y el parto, las exigencias de producción de leche y distintos desafíos antigénicos ambientales. Aun así, los resultados preliminares obtenidos en este estudio de diseño experimental de alimentación controlada permiten concluir que un bajo aporte nutricional de Se no afecta en forma significativa la inmunocompetencia en vacas de lechería. Sin embargo, se requieren mayores estudios tendientes a establecer con mayor precisión el efecto del estatus de Se (GSH-Px) sobre la respuesta inmune.

Notas

1 Hill Laboratories, N Z.

2 Deposel‚ Young Animal Health Ltd., NZ.

3 RANSEL®. Laboratorios Randox, Crumlin, UK.

4 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim.

5 Professional Biological Company, Denver, Co, USA.

6 Bio-Rad, Hercules CA.

7 BINDARID®. The Binding Site, UK.

8 Capel, ICN Pharmaceuticals, Inc. USA.

9 Sigma, USA.

10 Bio-Tek Instruments Inc. USA.

11 Intervet Chile Ltda. Chile.

REFERENCIAS

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V Leyán1, F Wittwer3, P A Contreras3, G Schurig21 Instituto de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile. 2 Virginia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine Virginia Tech, USA. 3 Instituto de Ciencias Clínicas Veterinarias, Universidad Austral de Chile.